全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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,/001,#"""*$"!&,!"#$,"&,"$
收稿日期$
!"#%*#!*!+
&修改稿收到日期$
!"#$*"%*!"
基金项目$国家自然科学基金"
%#"-#-)#
#&高校基本科研业务费专项资金"
23!"#%""%
#&西北农林科技大学国际科技合作基金
作者简介$毛双双"
#))"(
#!女!在读硕士研究生!主要从事黄瓜的种质资源与生物技术研究
4*56/7
$
611""#
!
18096:,;<9,=1
"
通信作者$李玉红!博士!副教授!主要从事黄瓜的种质资源与生物技术研究
4*56/7
$
7/
>
9?@1
A
-%
!
#!+,=@5
黄瓜过敏性诱导反应蛋白基因"
12345$
#
原核表达及其多克隆抗体制备
毛双双#!李玉红#"!周
!
旋#!李万青#!陈菲帆#!程智慧#!陈
!
鹏!
"
#
西北农林科技大学 园艺学院!陕西杨陵
-#!#""
&
!
西北农林科技大学 生命科学学院!陕西杨陵
-#!#""
#
摘
!
要$该试验用黄瓜霜霉菌侵染黄瓜幼苗!并通过
BCD
方法克隆其过敏性诱导反应蛋白"
EFD
#的基因
!"#$%#
!
构建原核表达载体
G
4H!6*C0EFD#
!实现在大肠杆菌"
&()*+
#
IJ!#
"
K4%
#中的高效表达&对诱导表达的时间和
FBHL
的浓度进行了优化&利用钴离子螯合层析纯化了重组蛋白并制备高效价多克隆抗血清结果表明$该黄瓜过
敏性反应诱导蛋白以包涵体的形式表达!最佳诱导时间和
FBHL
浓度分别为
$?
和
",&55@7
(
J
(#
&经纯化!得到
高纯度的分子量为
%$MK
重组蛋白
C0EFD#

N;0O;P1Q7@OO/1
A
显示
C0EFD#
的抗体具有较好的特异性原核表达
体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步研究
!"#$%#
基因在黄瓜中的功能奠定了基础
关键词$黄瓜&过敏性反应诱导蛋白基因&原核表达&多克隆抗体
中图分类号$
3-&
&
3-)
文献标志码$
R
%&"(&
)
"*#+,-
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&/00#"1(1!%"2
)
+2"1(231*#4"!
)
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A
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A
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A
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C?/16
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261
A
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C?/16
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P@O;/10
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G
P@M6P
>
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G
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G
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G
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K4%
#
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G
P;00/@1
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O/5/_;<,H?;P;=@5Q/161O
G
P@O;/1860
G
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A
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A
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G
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G
P;
G
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A
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G
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=7@16761O/0;P95,H?;P;097O00?@8;8;P;;^
G
P;00;>
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61G
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G
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G
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P;=@5Q/161O
G
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A
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A
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G
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0O;5;0O6Q7/0?5;1O61<
G
@7
>
=7@16761O/Q@G
P;
G
6P6O/@176
>
O?;:@91*
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A
6O/1
A
O?;:91=O/@1@:O?;!"#$%#
A
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A
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G
P@M6P
>
@O/=;^
G
P;00/@1
&
G
@7
>
=7@16761O/Q@!!
霜霉病是黄瓜最主要的病害!发病后一般减产
#"`
"
!"`
!严重时可达
%"`
"
&"`
!甚至绝
收)#*%*应用农药虽能减缓霜霉病的发生及蔓延!但
会导致环境污染+农药残留及病原菌抗药性的产生
等一系列问题)$*&*!培育抗病品种是最为经济有效的
手段!然而!抗病品种的高效培育依赖于对黄瓜抗病
机制的解释!因此加强对黄瓜霜霉病抗性分子机理
的研究!对于黄瓜无公害生产及抗病分子育种都具
有十分重要的理论和现实意义
过敏性诱导反应"
E
>G
;P0;10/O/];*/1<9=;O/@1
!
ED
#是寄主抵抗活体寄生病原菌侵染的最有
效防御机制之一)+*!它通过在侵染点处产生局部细
胞坏死!抑制病原菌的生长!进而激发一系列的防卫
反应)-**而过敏性诱导反应蛋白"
E
>G
;P0;10/O/];*
/1<9=;G
P@O;/10
!
EFD
#是一类与
ED
反应有
关的蛋白)*##*虽然已有研究表明
EFD
蛋白可以激
发植物发生
ED
反应!并诱导相关防卫基因表
达)*#!*!但是关于
EFD
蛋白的研究多集中在模式植物
拟南芥上)#"*#%*!对于栽培作物研究较少)*)!#$*#&*!且研
究主要集中在烟草)*+玉米)#+*+大麦)#$*+辣椒)#!*+水
稻)##*和小麦)#&*上与寻找
%
基因及抗性信号通路
研究相比!人们关于
EFD
蛋白的认识还非常有限
虽然已克隆了一些
#$%
基因!并报道这些
EFD
蛋白
与
ED
反应所诱导的细胞死亡有关!但是很少对
EFD
蛋白的功能进行研究!涉及
EFD
蛋白功能的研究报
道仅限于辣椒的
!3#$%#
基因+水稻
5"#$%#
基因以
及小麦
63#$%#
和
63#$%%
基因由于
ED
反应先
于系统获得抗性发生!因此对
EFD
蛋白进行研究能
更清楚地揭示
ED
反应及阐明抗性本质!但在黄瓜
上
EFD
蛋白的研究还未见相关报道
本课题组通过与美国威斯康星大学合作!筛选
出了高抗霜霉病黄瓜种质
ZN"
!并对
ZN"
接
种霜霉菌后的
EFD
蛋白基因"暂命名为
!"#$%#
#
进行了
Y
BCD
分析!结果表明!在抗%感种质上!
!"#$%#
出现极显著差异表达!在抗病种质上!
!"#$%#
表达量是感病种质
%
"
-
倍为进一步探
讨
!"#$%#
基因在黄瓜霜霉病抗性中的作用!本研
究在对
!"#$%#
基因克隆的基础上!通过大肠杆菌
"
&()*+
#
IJ!#
菌株进行融合表达并纯化!对获得的
蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清!
N;0O*
;P1Q7@OO/1
A
免疫印迹检测了抗血清的特异性!为该
基因功能验证及后续转基因的检测提供依据
#
!
材料和方法
$,$
!
试验材料
试验采用黄瓜高抗霜霉病自交系
ZN"
!穴盘
育苗!待幼苗长到一叶一心时!接种黄瓜霜霉病菌!
#
<
后取叶片样品迅速冻于液氮中!
(-"a
冰箱保存
备用
$,<
!
试验方法
$=<=$
!
12345$
基因序列分析
!
在黄瓜数据库中
对获得的黄瓜
!"#$%#
的氨基酸序列进行同源性
比较!查找同源序列同时在
ZCIF
数据库中用
IJRUH
在线软件"
?OO
G
$%%
888,1=Q/,175,1/?,
A
@]
%
IJRUH
%#对获得的黄瓜
!"#$%#
的氨基酸序
列进行同源性比较黄瓜
!"#$%#
蛋白质的等电
点以及分子量由
C@5
G
9O;
G
[S8O@@7
"
?OO
G
$%%
8;Q,;^
G
60
>
,@P
A
%
=@5
G
9O;
,
G
/
%#进行预测
$=<=<
!
引物设计及
12345$
基因克隆
!
依据黄瓜
数据库中
!"#$%#
基因的
CKU
序列设计
BCD
引
物!
"#$%#*J
"
&b*CRHLR==6O
AAA
=LLHRRHCHH*
HHHHLHHLHLHLR*%b
!下划线为
7()
#
酶切位
点#和
!"#$%#*D
"
&b*CCLRC=O=
A
6
A
LHLRLRRL*
HRLCLLCRCC*%b
!下划线为
89)
#
酶切位点#送
北京天一辉远生物科技有限公司合成提取接种霜
霉菌种质
ZN"
的叶片总
DZR
!利用反转录试剂
盒"
BP/5;U=P/
G
O
HS
DH*BCDc/O
!
H6c6D6
公司#合成
=KZR
以
=KZR
为模板!以
!"#$%#*[
和
!"#$%#*D
为引物进行目的基因扩增!
BCD
扩增采用
F
G
P@@:
高保
真
KZR
聚合酶进行扩增和延伸
BCD
反应体系"
!&
$
J
#为$上+下游引物"
#"
$
5@7
(
J
(#
#各
#
$
J
+
"
#"55@7
(
J
(#
#
",&
$
J
+
&dBCD
缓冲液
&
$
J
+
F
G
P@@:KZR
聚合酶"
&W
%
$
J
#
",!
$
J
+模板
KZR#,&
$
J
!
<!
T
补齐至
!&
$
J

BCD
扩增程
序为
)&a
预变性
#5/1
&
)&a
变性
!&0
!
&&a
退火
%"0
!
-! a %"0
!
%+
个循环&
-! a
延伸
#"5/1

BCD
产物于
#`
琼脂糖凝胶上电泳分析!用凝胶回
收试剂盒"北京天根生化科技公司#回收
BCD
产物
$=<=>
!
12345$
基因原核表达载体构建
!
回收
!"#$%#
基因片段经
89)
#
和
7()
#
"
H6c6D6
公
司#双酶切后!定向插入经同样双酶切的
G
4H!6
"
H6c6D6
公司#表达载体中!获得重组表达载体
G
4H!6*C0EFD#
!转化入大肠杆菌感受态 细胞
H@
G
#"
"北京天根生化科技公司#!经挑取单克隆和
菌落
BCD
检测后!送去测序取测序正确的菌液!
制备
G
4H!6*C0EFD#
质粒!将重组质粒转化入
IJ!#
"
K4%
#"本实验室保存#后进行诱导表达
$=<=?
!
12345$
重组蛋白的诱导表达与可溶性分
析
!
挑取单菌落接种到含卡那霉素
&"
$
A
(
5J
(#的
液体
JI
培养基中!
%-a
!
!""P
%
5/1
振荡培养过
&
&
期
!!!!!!!
毛双双!等$黄瓜过敏性诱导反应蛋白基因"
!"#$%#
#原核表达及其多克隆抗体制备
夜次日以
#e&"
扩大培养!
%-a
振荡培养至
TK
值为
",$
时加
FBHL
"异丙基
*
%
*K*
硫代半乳糖苷#!
诱导蛋白表达将包含重组质粒
G
4H!6*C0EFD#
的阳性菌经超声波破碎处理后!离心收集沉淀和上
清!上清和沉淀分别制样并进行
UKU*BRL4
电泳检
测!胶浓度为
#!,&`

$,<,@
!
目的蛋白表达条件的优化
!
!
#
"诱导时间的
优化
!
取阳性单克隆接菌于含有
c61
抗生素的
!"
5J
液体
JI
培养基中!
%-a
培养至
TK
值达
",$
时!加入终浓度为
",&55@7
(
J
(#的
FBHL
!
%-a
恒
温培养分别在
"
+
!
+
$
++

+
#"?
时取
&""
$
J
菌液
离心收集菌体将收集的菌体加入
#""
$
J#d
UKU*BRL4
上样缓冲液!沸水浴
#"5/1
后离心取上
清进行
UKU*BRL4
电泳检测
!"
FBHL
诱导浓度的优化
!
阳性克隆的菌液
等量接种于
&
个含有
c61
抗生素的
&5J
液体
JI
培养基中!
%-a
培养至
TK
值达
",$
左右!分别加
入终浓度为
"
+
",!
+
",&
+
",
+
#,"
和
#,!55@7
(
J
(#
FBHL
!
%-a
恒温培养
$?
后分别取
&""
$
J
菌液!离
心收集菌体加入
#""
$
J#dUKU*BRL4
上样缓冲
液!沸水浴
#"5/1
后离心取上清进行
UKU*BRL4

$,<,A
!
目的蛋白的纯化
!
目的蛋白的纯化参照李
学俊等)#-*的方法
!
#
"包涵体的纯化
!
收集菌体后加入
#
%
#"
体积
的超声裂解缓冲液!超声波功率
!%& N
破碎
%"
5/1
!
$a
+
#!"""P
%
5/1
离心
#&5/1
弃上清后加
入适量体积的包涵体洗涤缓冲液"
G
E,"
!
&"55@7
(
J
(#
Z6C7
!
",#55@7
(
J
(#磷酸缓冲液!
#` HP/@1
X*#""
#重悬沉淀!再次超声重复以上步骤
$
次
获得的沉淀中加入适量的包涵体溶解液"
G
E,"
!
",#55@7
(
J
(#磷酸缓冲液!
&"55@7
(
J
(#
Z6C7
!
+
55@7
(
J
(#尿素#!室温下溶解
!
"
%?

!"钴离子螯合层析纯化目的蛋白
!
将溶解好
的包涵体
#!"""P
%
5/1
+
$a
离心
#&5/1
!上清与等
体积
!dBIU
"
,#55@7
(
J
(#磷酸缓冲液#!含
",+
55@7
(
J
(#
Z6C7
!
+55@7
(
J
(#尿素!
G
E,"
#混
合!上样于经
#dBIU
平衡的
#"5JH67@1P;0/1
柱
上!以缓慢的流速通过柱床!用
$
倍柱体积的
#d
BIU
"含
+55@7
(
J
(#尿素#洗去杂蛋白用含
#&"
55@7
(
J
(#咪唑的
BIU
"含
+55@7
(
J
(#尿素#洗脱
目标蛋白将收集的目标蛋白液体转入透析袋再分
别对含有不同浓度尿素"
+
+
$
+
!
和
"55@7
(
J
(#
#的
透析液"
G
E,"
!
&"55@7
(
J
(#
Z6C7
!
",#55@7
(
J
(#磷酸缓冲液!
&"55@7
(
J
(#
Z6C7
#进行缓慢梯
度透析!每个浓度透析
+
"
?
将透析过的溶液保
存于
(!"a
经
UKU*BRL4
电泳检测纯化结果
$,<,B
!
重组蛋白多克隆抗体制备
!
为尽可能除去
目的蛋白中存在的微量杂蛋白!将金属离子螯合纯
化的
!"#$%#
蛋白进行
UKU*BRL4
"
!"=5d!"
=5
#电泳!切取目标条带!用灭菌水洗涤后送至武汉
三鹰生物技术公司进行兔抗
C0EFD#
多克隆抗体制
备
$=<=C
!
60DEF$
蛋白的
G/0*/&142"**#1
H
分析
!
N;0O;P1Q7@OO/1
A
分析参照季英华等)#*方法进行
样品蛋白
UKU*BRL4
电泳后!经半干电转仪恒流
&"5R-&5/1
转移到硝酸纤维素膜上!用含
&`
脱
脂奶粉的
BIUH
溶液
$a
封闭过夜!
BIUH
清洗后
加入兔多克隆抗体"
#e%""
#!于摇床室温孵育
#,&
?
!
BIUH
洗
%
次!每次
#"5/1
&再加
EDB
标记的羊
抗兔
F
A
L
"
#e!"""
#!摇床室温孵育
#,&?
!
BIUH
洗
%
次!每次
#"5/1
取等体积的
4CJ
试剂
R
液+
I
液混合滴于膜正面!于暗室反应
&5/1
!用化学发光
成像仪拍照
!
!
结果与分析
<=$
!
12345$
基因克隆及序列分析
以从黄瓜叶片中提取的
DZR
反转录成的
=K*
ZR
为模板!进行
BCD
扩增!电泳显示
BCD
扩增出
单一条带!其大小约为
+"Q
G
!与预期相符"图
#
!
R
#经片段回收!
7()
#
和
89)
#
酶切!然后克隆到
G
4H!6
的
7()
#
和
89)
#
酶切大片段上!转入转化
HTB#"
!挑单克隆后做菌落
BCD
检测"图
#
!
I
#!挑
选阳性菌株将其菌液送去测序
序列测定结果表明!克隆的黄瓜
!"#$%#
基因
与
ZCIF
数据库中的序列相符!全长为
+#Q
G
"
?O*
O
G
$%%
=5Q,Q19,;<9,=1
%
C9=95/0
,
06O/]90
,
]!"
%!
L;1I61M
序列号为
XB
,
""$#%#&#
#!编码
!+
个氨
基酸残基组成的蛋白质!该蛋白质预测的等电点以
及分子量分别为
&,%)
和
%#%!),-+K
!属于酸性蛋
白质经在黄瓜数据库和
ZCIF
数据库中比对!
!"#$%#
在黄瓜中无同源序列!但是由于黄瓜基因
组只测通了
!$%,&SQ
的序列!覆盖了黄瓜基因组
-!,`
的区域!因此还不能得出黄瓜过敏性反应诱
导蛋白家族中只有
#
个成员的结论!为此!将在本研
究中克隆的过敏性诱导反应蛋白基因暂命名为
!"#$%#

+
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
黄瓜
!"#$%#
基因特异扩增结果
[/
A
,#
!
H?;0
G
;=/:/=BCD
G
P@<9=O0@:!"#$%#
A
;1;
S,KJ!"""
&
#
"
%,!"#$%#
&
$,
G
4H!6*C0EFD#
&
,
G
4H!6*C0EFD#
<=<
!
12345$
基因原核表达载体构建及重组质粒
的鉴定
以
!"#$%#*[
和
!"#$%#*D
为引物进行
BCD
检测发现!重组原核表达质粒可扩增大小约为
""
"
)""Q
G
的片段"图
#
!
C
#序列测定结果也表明获
得的重组克隆载体包含目标基因!与黄瓜数据库中
的
EFD
基因大小相同!重组原核表达质粒中
!"#$%#
基因序列未突变!且读码框正确!没有移
码!表明
!"#$%#
基因原核表达载体
G
4H!6*
C0EFD#
构建成功
<=>
!
60DEF$
蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及表
达形式分析
原核表达载体
G
4H!6*C0EFD#
导入大肠杆菌
IJ!7
"
K4%
#中!挑取单克隆于
JI
液体培养基中培
养!至对数生长期"
TK",$
#时加
#5@7
(
J
(#
FBHL
诱导
)?
后!收集菌体以未加
FBHL
诱导的菌为对
照!进行
UKU*BRL4
检测结果表明!与未诱导对
照相比!含重组质粒的菌液在约
%$MK
处出现
#
条
较高浓度的特异诱导表达条带"图
!
#!与预期的
C0EFD#
融合蛋白分子量相当!表明
!"#$%#
基因
已经在大肠杆菌
IJ!7
"
K4%
#中融合表达
诱导菌经超声波处理后!离心收集上清液和沉
淀!分别制样进行
UKU*BRL4
电泳结果表明!重
组表达菌体裂解的上清液中没有检测出目的融合蛋
白!而在沉淀中
%$MK
处有明亮的蛋白条带"图
!
#!
这说明
C0EFD#
在大肠杆菌中主要以包涵体的不溶
形式表达
<=?
!
60DEF$
表达条件的优化
本研究对
C0EFD#
的蛋白进行了诱导时间和诱
导剂浓度的优化!
UKU*BRL4
分析结果"图
%
#表明!
C0EFD#
的蛋白表达量随着诱导时间的延长而增
加!诱导
$?
表达量最大!随后表达量下降阳性重
图
!
!
!"#$%#
表达的
UKU*BRL4
图谱
S,
蛋白
56PM;P
&
#,
未加
FBHL
诱导的
IJ!#
"
K4%
#菌总蛋白&
!,
加
",#55@7
(
J
(#
FBHL
诱导
)?
重组菌的总蛋白&
%,
加
",#
55@7
(
J
(#
FBHL
诱导
)?
重组菌上清&
$,
加
",#
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(
J
(#
FBHL
诱导
)?
重组菌沉淀
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S,BP@O;/156PM;P
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#,H?;O@O67
G
P@O;/1@:IJ!#
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K4%
#
8/O?@9O
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&
!,H?;O@O67
G
P@O;/1@:O?;P;=@5Q/161O
065
G
7;860/1<9=;>
",#55@7
(
J
(#
FBHL:@P)?
&
%,H?;09
G
;P16O61O@:O?;P;=@5Q/161O065
G
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(
J
(#
FBHL:@P)?
&
$,H?;0;P;=@5Q/161O065
G
7;860/1<9=;>
",#55@7
(
J
(#
FBHL:@P)?
组菌在
%-a
培养条件下!加入
FBHL
分别至终浓度
为
",!
+
",&
+
",
+
#,"
和
#,!55@7
(
J
(#
!诱导培养
$?
后!经
UKU*BRL4
电泳!结果表明
C0EFD#
蛋白
的表达量在
FBHL",&55@7
(
J
(#时表达量最大!
随后下降
<=@
!
重组
60DEF$
融合蛋白的纯化
经
C@
!f亲和层析柱分离纯化后!得到单一峰!
将收集液置于透析袋中!进行梯度透析去尿素和
B4L*+"""
浓缩后!
UKU*BRL4
检测纯化效果!结果
出现单一的目的条带"图
$
#!表明已纯化得到融合
E/0
标签的
C0EFD#
蛋白!纯化效果良好!达到做多
-
&
期
!!!!!!!
毛双双!等$黄瓜过敏性诱导反应蛋白基因"
!"#$%#
#原核表达及其多克隆抗体制备
克隆抗体的要求
<,A
!
抗体的特异性检测
为了 检 测 多 克 隆 抗 体 的 特 异 性!以 兔 抗
C0EFD#
蛋白多克隆抗血清为一抗!以辣根过氧化
物酶标记的羊抗兔为二抗!对表达产物进行
N;0O*
;P1Q7@OO/1
A
分析!结果表明!
R1O/*C0EFD#
能与
G
4H!6*C0EFD#
诱导菌总蛋白发生特异性反应"图
&
!泳道
#
#!与已经感染霜霉病的黄瓜叶片蛋白也发
生了特异性反应"图
&
!泳道
!
#!与未诱导宿主菌总
蛋白无反应"图
&
!泳道
%
#说明制备的多克隆抗体
具有较好的特异性!可用于后续的试验研究
图
%
!
不同
FBHL
浓度对重组
!"#$%#
表达的影响
S,
蛋白
56PM;P
&
#
"
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+
",!
+
",&
+
",
+
#,"
和
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(
J
(#
FBHL
诱导的菌体
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(#
FBHL
图
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!
UKU*BRL4
分离钴柱纯化的
C0EFD#
蛋白
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&
#,
过柱纯化后的
C0EFD#
蛋白
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C0EFD#
G
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G
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G
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=@Q67OP;0/1
图
&
!
黄瓜
C0EFD#
蛋白多克隆抗体的
N;0O;P1Q7@OO/1
A
检测
#,
含
G
4H!6*C0EFD#
的
IJ!#
"
K4%
#菌总蛋白&
!,
霜霉菌侵染的黄瓜叶片总蛋白&
%,IJ!#
"
K4%
#菌总蛋白
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G
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=7@167
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G
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G
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G
P@O;/10@:IJ!#
"
K4%
#
Q6=O;P/67=;70
%
!
讨
!
论
过敏性诱导反应"
EFD
#基因是一类与
ED
有关
的植物防御基因)#$*
ZL#
是第一个从植物中克隆
的
#$%
基因!它能激发烟草产生类似
ED
反应的
坏死斑!并诱导
BD*!
病程相关蛋白的表达)*基
于植物
EFD
蛋白氨基酸序列的同源性!
%
个玉米
#$%
基因
:;<#$%*
+
:;<#$%!
和
:;<#$%%
!和
$
个大麦
#$%
基因
#=<#$%#
+
#=<#$%!
+
#=<#$%%
和
#=<#$%$
相继得到了鉴定在这些基因中!玉
米
:;#$%%
基因转录本在病害坏死斑突变体中的
表达量显著提高!大麦
#=#$%%
转录本在快中子突
变体"呈现自发
ED
反应的突变体#中也呈强烈上
调表达)#$!#+*此结果表明!
EFD
基因在细胞程序性
死亡和防卫反应中具有重要作用)#&*在拟南芥上!
过量表达质膜定位的辣椒
!3#$%#
和水稻
5"<
#$%#
基因均诱导了
ED
反应和相关防卫基因的表
达!而且提高了拟南芥对细菌性病害"
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和
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#和卵菌"
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#病害的抗性)#"*#!*在小
麦上!沉默
63#$%#
和
63#$%%
基因均显著降低
了小麦对条锈病的抗性)#&*
3/
等)#%*报道拟南芥
EFD
蛋白通过与抗性蛋白
DBU!
结合!形成一个复
合体!而在
DBU!
介导的数量性状抗性中发挥重要
作用
在葫芦科上
!"#$%#
基因的研究尚未见报道!
本研究在进行
BCD
扩增时采用了高保真
F
G
P@@:
KZR
聚合酶!其错配率比普通
63
A
酶低
&!
倍!大
大降低了碱基错配率!确保了氨基酸序列的正确性
诱导
C0EFD#
蛋白表达时!对表达条件进行优化!尝
试了不同
FBHL
浓度+不同诱导时间+不同诱导温度
等条件下蛋白的表达情况!结果表明!融合蛋白在
%-a
+
FBHL
浓度
",&55@7
(
J
(#时即可获得高效

西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表达虽然有研究显示!低温诱导包涵体表达可得
到可溶性产物!但本试验中融合蛋白一直以包涵体
形式表达由于表达的蛋白带有
E/0
标签!应用钴
柱和组氨酸亲和性得到了很好的纯化效果!将表达
的蛋白纯化后制备多克隆抗体!并进行特异性检测!
为后续的研究奠定了基础
在成功获得对
C0EFD#
蛋白特异的多克隆抗体
的基础上!在后续的研究中主要研究
!"#$%#
基因
在黄瓜体内的分布情况+不同生物胁迫下的表达以
及不同信号通路之间的联系以及免疫组化等该项
研究将有助于阐明过敏性反应蛋白在黄瓜抗病中的
作用!加深对黄瓜抗霜霉病机制的理解
参考文献!
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