全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
&
#$
"(&)"*""
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""+&"!$
"
!"#$
#
"&+"(&+"*
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#",*"
%
-
,.//0,#"""+&"!$,!"#$,"&,"(&
收稿日期$
!"#&+#!+!*
&修改稿收到日期$
!"#$+"#+!$
基金项目$国家自然科学基金"
%#!"!$$
#&江西省教育厅科技计划项目"
122#!#3&
#&江西省科技支撑计划"
!"#!!445""&
#&江西省青年
科学家培养计划"
!"##!464!%""*
#
作者简介$温秀芳"
#(3()
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物遗传与分子生物学研究
7+89.:
$
#"!$#"3#"
!;;
,<=8
"
通信作者$罗向东!博士!教授!主要从事植物遗传与分子生物学研究
7+89.:
$
>?:@=:A
!
#%,<=8
东乡野生稻耐冷渐渗系
$%&
甲基化
水平和模式变化研究
温秀芳!戴亮芳!赵
!
俊!罗向东"!邓晓娟!张帆涛!谢建坤
"江西师范大学 生命科学学院!南昌
%%""!!
#
摘
!
要$根据水稻全基因组和特定位点的
6
B
1
岛序列设计引物!采用
C酶酶切
EFG
!以东乡野生稻耐冷渐渗
系"
HI$%%$
和
HI$&!%
#及其双亲为试材!研究其基因组和特定位点的
EFG
甲基化水平和模式变化特征!探讨甲基
化变异对野生优异基因渐渗的影响结果显示$"
#
#在覆盖全基因组的
3%
个
6
B
1
岛中!
HI$%%$
和
HI$&!%
的基因
组甲基化频率分别为
&,J
和
$%,3J
!低于受体亲本协青早
4
的
!,J
&大部分"
*$,(J
"
3",*J
#受体亲本的甲
基化模式在两耐冷渐渗中能稳定遗传!另外一些位点发生了甲基化模式的改变!主要表现为脱甲基化"
#%,%J
"
#3,#J
#和过甲基化"
&,&J
"
,"J
#"
!
#在耐冷
KLI/
区间!两耐冷渐渗系的甲基化水平为
#%,%J
"
!,*J
!远
低于受体亲本的
#,&J
&它们在该区域的甲基化模式变异主要为脱甲基化"
%%,%J
"
&","J
#!高于全基因组的平
均变异率"
%
#分析逆转座子
!"#$%
和
&(#&
区域的
$#
个
6
B
1
岛发现!耐冷渐渗系在该区域具有较高频率的甲
基化修饰和较低的甲基化模式变异研究表明!种间杂交渐渗诱发了受体亲本广泛的甲基化水平和模式变异!为
野生优异基因的有效利用提供了新的机遇和挑战
关键词$东乡野生稻&耐冷渐渗系&
EFG
甲基化&
C酶
中图分类号$
K*3(
文献标志码$
G
$%&()*
+
,-)#"./(0(,-.!1-))(2.3*-.
4
(5#.3",!6",(2-.7(
8.)2"
4
2(55#"./#.(5$(2#0(!92":,(
1
2$(3
4
-
5
&
6
&/;2#99<
M7FN.@A90
O
!
EGHI.90
O
A90
O
!
PQGR2@0
!
ISRN.90
O
?=0
O
"
!
E7F1N.9=
-
@90
!
PQGF1590T9=
!
NH72.90U@0
"
6=:V
O
V=AI.AVW<.V0!
2.90
O
>.F=D89:S0.XVD/.T
Y
!
F90O
%%""!!
!
6Z.09
#
&=5)2-7)
$
H0TZV
B
DV/V0T/T@?
Y
!
EFG8VTZ
Y
:9T.=0/
B
V<.A.<[6B
D.8VD/]VDV?V/.
O
0V?9<<=D?.0
O
T=TZV/V+
;
@V0B
1./:90?DV
O
.=0TZD=@
O
Z=@T#!B
V<.A.<
O
V0=8.<
B
=/.T.=0,H0=D?VDT=.0+
XV/T.
O
9TVTZVO
V/=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0:VXV:90?
B
9TTVD0.0TZV<=:?T=:VD90O
DV//.=0:.0V/
"
HI/
!
HI$%%$90?HI$&!%
#
90?TZV.D
B
9DV0T/
!
]V@/V?TZV/V/
B
V<.9:
B
D.8VD/T=98
B
:.A
Y
TZV
B
DVX.=@/:
Y
?.
O
V/TV?
O
V+
0=8.Y
CY
8V,
"
#
#
G09:
Y
/./=A3%
B
9.D/=A
B
D.8VD/?./TD.^@TV?9=AD.;
@V0<
Y
=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0.0HI$%%$90?HI$&!%]9/T=&,J90?$%,3J
!
DV+
/
B
VY
!
]Z.B
9DV0T
"
&(
)
*%%+,-%I,;
.0
O
_9=4
#
,C=/T=AEFG
8VTZ
Y
:9T.=0
B
9TTVD0/=ADV<@DDV0T
B
9DV0T<=@:? V^.0ZVD.TV?.0TZVHI/,GTTZV/98VT.8V
!
/=8V=A8VTZ
Y
:9+
T.=0
B
9TTVD0/Z9XVO
V?.0<:@?.0
O
?V8VTZ
Y
:9T.=0
"
#%,%)#3,#J
#
90?Z
YB
VD8VTZ
Y
:9T.=0
"
&,&J)
,"J
#
,
"
!
#
H0TZVKLI/DV
O
.=0DV:9TV?T=<=:?T=:VD90!
TZVADV
;
@V0<
Y
=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0.0HI$%%$90?
HI$&!%]9/#%,%J)!,*J
!
]Z.B
9DV0T,LZVADV
;
@V0<
Y
=AEFG
8VTZ
Y
:9T.=0
B
9TTVD0/O
V/=ATZVT]=HI/.0TZVKLI/DV
O
.=0]9/89.0:
Y
A=D?V8VTZ
Y
:9T.=0
"
%%,%J)
&","J
#!
]Z.O
ZVDTZ90TZ9T=ATZV9XVD9
O
VX9D.9T.=0ADV
;
@V0<
Y
=A]Z=:V+
O
V0=8V,
"
%
#
5@DTZVD909:+
Y
/./=0$#
B
9.D/=A
B
D.8VD/^ 9/V?=0T]=DVTD=TD90/
B
=/=0/
"
!"#$%90?&(#&
#
?V8=0/TD9TV?TZ9TTZVDV]9/
Z.
O
ZVD:VXV:=AADV
;
@V0<
Y
=AEFG8VTZ
Y
:9T.=090?:=]VDADV
;
@V0<
Y
=A8VTZ
Y
:9T.=0
B
9TTVD0O
V/,LZV/V
DV/@:T//@
OO
V/TV?TZ9TTZVV>TV0/.XVEFG8VTZ
Y
:9T.=0:VXV:90?
B
9TTVD0O
V/Z9XV^ VV0Z9
BB
V0V??@D.0
O
TZV.0TVD/
B
V<.A.Y
D^.?._9T.=090?9:.V0
O
V0V.0TD=
O
DV//.=0
!
]Z.B
D=X.?V@/VA@:.0A=D89T.=0A=DVAA.+
<.V0T:
Y
V>
B
:=.T.0
O
90?@/.0
O
TZV.0TVDV/T.0
O
].:?
O
V0V/A=DD.>(
+
?"2!5
$
E=0
O
>.90
O
].:?D.&
<=:?T=:VD90O
DV//.=0:.0V/
&
EFG8VTZ
Y
:9T.=0
&
CY
8V
!!
EFG
甲基化"
EFG 8VTZ
Y
:9T.=0
#是真核生物
EFG
中一种可逆且能遗传的表观遗传修饰!广泛存
在于细菌和动植物基因组中(#)
EFG
甲基化通常
被认为是基因组
EFG
的一种防御型机制(!)但事
实上!在植物的生长发育过程中
EFG
甲基化修饰
起着非常重要的作用!它能关闭或启动某些基因的
转录表达程序!参与基因的表达调控*组蛋白修饰*
染色体印记*着丝粒和端粒结构的维持等生命活
动(%)因此!
EFG
甲基化的遗传与可塑性对生物体
维持正常的生命活动至关重要
研究表明!外界因素可诱发植物基因组甲基化
变异!如远缘杂交*转基因*离体培养*环境胁迫
等(&+$)前人对拟南芥*棉花*大米草*玉米等种间杂
交后代的研究发现!外源物种
EFG
的导入可诱发
受体物种基因组广泛的
EFG
甲基化水平和模式的
变化!引发相关基因的表达或沉默!进而引起种间杂
交后代的基因表达的表型与其双亲具有显著差
异(+*)因此!
EFG
甲基化水平和模式的改变一方
面为种间杂交创造新的遗传变异提供了新的育种途
径和思路!但同时对野生优异基因的有效利用提出
了新的挑战为此!阐明种间杂交后代中甲基化模
式的变异的遗传与分子机制具有重要的理论和实践
意义
东乡野生稻是一种全球分布最北的普通野生稻
"
&(
)
*%(#
.
,
/
"
0
"11D.AA,
#!蕴藏大量栽培稻品种改
良所没有的优异基因!如高产*强耐冷*抗旱等(3)
利用东乡野生稻创制水稻"
&2%+,-%I,
#新种质已
成为改良栽培稻重要农艺性状和拓宽水稻遗传基础
的重要课题此前本课题组通过种间杂交和多次回
交*自交获得了一些携带野生稻优异基因的抗旱*耐
冷*耐低磷渐渗系(3+()随后的研究发现!这些高世
代渐渗系中伴随一些非孟德尔式的表观遗传变异!
如高世代"
46
#
5
(
#强耐冷渐渗系
HI$!&%
和
HI$%%$
在株型*株高以及谷粒颜色等形态学性状还存在一
定变异或分离!其逆转录酶的序列结构和荧光定量
的相对表达量与供体亲本有很大的差异(#")!减数分
裂也存在落后染色体及双核仁等不稳定现象(3)为
了更全面地了解野生稻优异基因在向栽培稻渐渗过
程中发生的遗传与表观遗传变异特征!本研究基于
水稻全基因组序列信息!对水稻全基因组的
6
B
1
岛
进行分析!利用
6
B
1
两侧的序列设计甲基化特异性
[6扩增引物!分析东乡野生稻耐冷渐渗系的在种
间杂交渐渗过程中所发生甲基化水平和模式变化特
征在此基础上!基于我们此前鉴定的东乡野生稻
耐冷基因粗定位
KLI/
结果(##)和耐冷渐渗系中已
发生逆转录酶活性变化的转座子结果(#")!对渐渗系
基因组的特定区域的
6
B
1
岛甲基化水平和模式变
化特征作进一步分析!探讨
EFG
甲基化水平和模
式变化对外源优异基因渐渗的影响!为东乡野生稻
耐冷基因在实际育种中的充分利用提供有益信息
#
!
材料和方法
@,@
!
材
!
料
本课题组此前以东乡野生稻"
&2(#
.
,
/
"
0
"1
1D.AA,
#为供体亲本!以栽培稻+协青早
4
,"
&2%+,-%
I,;
.0
O
_9=4
#为受体亲本杂交获得种间杂种
5
#
种间杂种
5
#
随后与受体亲本进行回交得
46
#
5
#
!经单粒传连续自交得
46
#
5
(
代群体!该渐渗
群体经耐冷鉴定筛选!获得强耐冷渐渗系
HI$%%$
和
HI$!&%
(
3
)
本文以东乡野生稻耐冷渐渗系"
HI$%%$
和
HI$&!%
#及其双亲为试材!研究其基因组和特定
位点
EFG
甲基化水平和模式变化特征
@!
3
B
;
岛甲基化特异扩增引物设计
利用
\.-
V"
ZTT
B
$%%
D.B
:90T^.=:=
OY
,8/@,V?@
%#中水稻基因组信息!
均匀地选择分布在
#!
条染色体上不同
4G6
中的
EFG
序列!结合我们对耐冷基因粗定位结果(##)!利
用程序
CVTZ
Y
:[D.8VD7>
B
DV//X#,"
在这些序列中
$(
&
期
!!!!!!!!!!
温秀芳!等$东乡野生稻耐冷渐渗系
EFG
甲基化水平和模式变化研究
寻找
6
B
1
岛!针对这些富含
61
序列的
EFG
利用
[D.8VD/%H0
B
@T
"
XVD/.=0&,"
#设计了
(3
对甲基化
特异性
[6扩增引物!其中
#$
对为耐冷基因
KLI
定位区间的引物!其余
3%
条为覆盖全基因组的甲基
化特异性扩增引物耐冷粗定位区间为第
#
号染色
体上的
\C!&+\C#"($
!
&
号染色体上的
W&*C+
W&#"C
!
#!
号染色体上的
\C$#(+\C!*"
(
##
)
另
外!我们此前发现耐冷渐渗系中逆转座子
!"#$%
和
&(#$
已发生逆转录酶活性变化(#")!为此根据各染
色体上
!"#$%
和
&(#$
转座区域的
EFG
序列!设
计特异引物
$#
对引物序列交于上海英俊公司
合成
@,C
!
甲基化引物扩增分析
采用
6LG4
法提取水稻基因组
EFG

EFG
检测合格后用
C酶于
%*`
酶切"约
#Z
以
上#!随后
$`
温育
#Z
使酶灭活终止酶切!
C酶酶切体系
$"
#
I
!包含
#"aF47 @^AAVD$
#
I
!
#""
a4WG",$
#
I
!
1L[
"
#""88=:
%
I
#
",$
#
I
!
C酶"
#"S
%
#
I
#
#
I
!
EFG#
#
I
!灭菌
??Q
!
R&!
#
I

酶切产物用
??Q
!
R
稀释
#"
倍备用!并用阳性和阴
性引物检测酶切是否完全阳性引物是针对
3"#*
基因设计的 "正向引物$
16LG6661LL6LL1+
1G6LGL
&反向引物$
6L1GGGL611G16G6L+
1G6G
#&阴性引物是针对不易发生甲基化的激酶位
点设计的"正向引物$
61G6LGGG66G6L66GG+
L6GL6
&反向引物$
66GGL6GGGG6LL6L66L+
1LGG
#酶 切 时 设 空 白 对 照!即 酶 切 体 系 中
C酶用
??Q
!
R
代替!其他体系相同(#!)
C酶切完全
EFG
样品用于甲基化引物扩
增!扩增反应总体积为
#$
#
I
!包含
#"a @^AAVD#,$
#
I
!
C
O
6:
!
"
!$88=:
%
I
#
",(
#
I
!
?FL[
"
!,$88=:
%
I
#
,!
#
I
!甲基化引物"
$
#
8=:
%
I
#
!,"
#
I
!
3%
4B
=:+
Y
8VD9/V
"
$S
%
#
I
#
",!
#
I
!
C酶切后的模板
EFG
"
!$0
O
%
#
I
#
!
#
I
!灭菌水
*,!
#
I

[6扩增
条件为
(`
预变性
$8.0
!
(`
变性
%"/
!
$3`
退
火
%"/
!
*!`
延伸
&$/
!
%$
个循环后!
*!`
延伸
#"
8.0
!最后
&`
保存
$8.0

[6产物用
#,"J
的琼
脂糖凝胶检测!并利用凝胶成像分析系统进行拍照!
每对引物对所有材料的扩增重复
%
次对照组实验
中未扩增出来的材料同样也进行
%
次重复扩增
实验
@,D
!
数据统计分析
没有扩增条带的记为-
"
.!表示该
EFG
片段具
有甲基化位点&扩增出目的条带的记为-
#
.!表示该
EFG
片段无甲基化位点
6
B
1
甲基化模式变化分
为
G
*
4
*
6
三类!其中
G
类表示受体亲本+协青早
4
,的甲基化模式在渐渗后代中被稳定遗传!包括
G
#
*
G
!
两个亚类&受体亲本+协青早
4
,中无甲基化
的位点在渐渗后代变为甲基化位点的情况定为
4
类!即发生了过甲基化变异&
6
类表示+协青早
4
,为
甲基化位点!而渐渗后代中变无甲基化位点!即发生
了脱甲基化变异
!
!
结果与分析
A<@
!
基因组
$%&
酶切效果检测
为了确定
C酶对参试材料的基因组
EFG
酶切是否完全!本研究分别采用阳性和阴性引物对
酶切产物进行扩增检测阳性引物可扩增基因组最
易发生甲基化且被切开的
3"#*
基因!如果酶切不
完全!材料可扩增出
#
条
*""^
B
左右的条带&阴性
引物是针对不易发生甲基化的激酶位点设计的!可
扩增出约
!""^
B
左右的片段本研究的
C酶
切产物检测结果表明"图
#
!
G
#!渐渗系及其双亲的
酶切产物的阳性引物扩增均无
*""^
B
的扩增产物!
用阴性引物扩增时出现
#
条
!""^
B
的条带!表明渐
渗系及其双亲的
C酶切产物可用于进一步甲
基化检测
A,A
!
耐冷渐渗系基因组甲基化水平和模式变化
特点
本研究利用覆盖全基因组
#!
条染色体上的
3%
对特异性甲基化引物!对
C酶酶切后的双亲和
东乡野生稻耐冷渐渗系"
HI$%%$
和
HI$&!%
#进行特
异扩增!分析其甲基化水平和模式变化特点结果
表明!受体亲本+协青早
4
,*供体亲本东乡野生稻和
两耐冷渐渗系都具有较高频率的
EFG
甲基化
"
&$,&J
"
!,J
#其中!受体亲本+协青早
4
,的
甲基化修饰程度要远高出供体亲本东乡野生稻!分
别为
!,J
和
&$,&J
"表
#
和图
#
!
4
#&耐冷渐渗系
"
HI$%%$
和
HI$!&%
#的甲基化水平介于双亲之间!且
与受体亲本存 在明 显差 异!分别为
&,J
和
$%,3J

HI$%%$
的甲基化水平与东乡野生稻比较
接近!两者无显著性差异表明种间杂交渐渗诱发
了受体亲本的甲基化水平发生了显著变化!而且在
不同的渐渗系中甲基化水平变异也存在明显差异
进一步分析这
3%
个
6
B
1
岛甲基化模式的遗传
和变异特征发现!渐渗系的
6
B
1
岛甲基化模式变异
主要分为
G
*
4
*
6
三类"表
!
#!其中
G
类表示受体亲
本+协青早
4
,的甲基化模式在渐渗中能稳定遗传!
(
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
分为
G
#
*
G
!
两个亚类
G
#
和
G
!
分别表示未甲基
化位点的遗传和甲基化位点的遗传模式
4
类和
6
类分别表示耐冷渐渗系中发生了过甲基化变异和脱
甲基化变异统计分析表明!大部分受体亲本+协青
图
#
!
参试材料
C酶切效果检测"
G
#与
EFG
甲基化分析部分电泳图"
4
#
C,C9DUVD
&
[
*
F
对应的泳道分别表示阳性和阴性引物对参试材料的扩增&
9
"
?
对应泳道的材料分别为
栽培稻+协青早
4
,*东乡野生稻*
HI$%%$
和
HI$!&%
&
"
对应的泳道表示无扩增条带!表示该位点
EFG
含有甲基化!
#
对应的泳道表示扩增出目的条带!表示该位点无
EFG
甲基化
5.
O
,#
!
EVTVO
DV/@:T/=A89TVD.9:].TZCY
8V
"
G
#
90?
B
9DT/=A
V:VB
Z=DV/./
B
9TTVD0=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0909:
Y
/./
"
4
#
C,C9DUVD
&
[
!
FDV
B
DV/V0T[6B
D=?@B
:.A.V?^
YB
=/.T.XV90?0V
O
9T.XV
B
D.8VD/A=D.0TD=
O
DV//.=0:.0V/90?
TZV.D
B
9DV0T/,9
"
?]9/&(
)
*%%+,-%I,;
.0
O
_9=4
!
E=0
O
>.90
O
].:?D.!
HI$%%$90?HI$!&%,"8V90/
0= 9^0?/98
B
:.A.V?]Z.B
DV/V0T/TZ9T.T
,
/8VTZ
Y
:9T.=0:=<@/
&
#8V90/ 9^0?/98
B
:.A.V?
]Z.B
DV/V0T/TZ9T/V
;
@V0Y
:9T.=0.0TZV:=<@/
表
@
!
耐冷渐渗系及其双亲基因组
$%&
甲基化水平特征
L9^:V#
!
LZVO
V0=8.Y
:9T.=0:VXV:.0<=:?T=:VD90O
DV//.=0:.0V/90?TZV.D
B
9DV0T/
材料
C9TVD.9:
被检测位点数
F=,=A:=<@/
甲基化位点数
F=,=AEFG
8VTZ
Y
:9T.=0:=<@/
甲基化频率
5DV
;
@V0<
Y
=AEFG
8VTZ
Y
:9T.=0:=<@/
%
J
无甲基化点数
F=,=A0=0+EFG
8VTZ
Y
:9T.=0:=<@/
无甲基化位点频率
5DV
;
@V0<
Y
=A0=0+EFG
8VTZ
Y
:9T.=0:=<@/
%
J
N4 3% $! !,9 %# %*,&<
EM\ 3% %*,* &$,&< &$,% $&,$9
HI$%%$ 3% %3,* &,< &&,% $%,&9
HI$!&% 3% &&,* $%,3^ %3,% &,!^
CV90 3% &%,% $!,! %(,* &*,3
!!
注$
N4,
协青早
4
&
EM\,
东乡野生稻&
CV90
为平均值&同列不同字母表示
","$
水平显著性差异&下同
F=TV
$
N4,&(
)
*%%+,-%I,;
.0
O
_9=4
&
EM\,E=0
O
>.90
O
].:?D.$
9XVD9
O
VX9:@V/=ATZV?.AAVDV0T89TVD.9:,LZV?.AAVDV0T0=D89:
:VTTVD].TZ.0TZV/98V<=:@80DV
B
DV/V0T//.
O
0.A.<90T?.AAVDV0表
A
!
耐冷渐渗系基因组
$%&
甲基化模式的遗传与变异特点
L9^:V!
!
LZV.0ZVD.T90O
V0=8.8VTZ
Y
:9T.=0
B
9TTVD0/.0<=:?T=:VD90O
DV//.=0:.0V/
材料
C9TVD.9:
被检测
位点数
F=,=A:=<@/
甲基化遗传模式的位点数及频率
F=,90?ADV
;
@V0<
Y
=A.0ZVD.TV?
B
9TTVD0/EFG8VTZ
Y
:9T.=0
总位点数及频率
L=T9::=<@/90?
ADV
;
@V0<
Y
G
#
N4
"
)
#
HI/
"
)
#
G
!
N4
"
b
#
HI/
"
b
#
甲基化变异模式的位点数及频率
F=,90?ADV
;
@V0<
Y
=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0X9D.9T.=0
过甲基化"
4
#
Q
YB
VD8VTZ
Y
:9T.=0
N4
"
b
#
HI/
"
)
#
脱甲基化"
6
#
EV8VTZ
Y
:9T.=0
N4
"
)
#
HI/
"
b
#
HI$%%$ 3% %
"
*$,(J
#
9 %&,%
"
&#,&J
#
^ !3,*
"
%&,$J
#
9 %,*
"
&,&J
#
9 #,%
"
#(,*J
#
9
HI$!&% 3% *
"
3",*J
#
9 %(
"
&*J
#
9 !3
"
%%,*J
#
9 $
"
J
#
9 ##
"
#%,%J
#
^
CV90 3% $
"
*3,%J
#
%,*
"
&&,#J
#
!3,&
"
%&,!J
#
&,&
"
$,!J
#
#%,
"
#,&J
#
!!
注$
N4
"
)
#和
HI/
"
)
#分别表示在
N4
和
HI/
中未扩增出目的条带!表示在相应的位点中发生了
EFG
甲基化&
N4
"
b
#和
HI/
"
b
#分别表示在
N4
和
HI/
中能
扩增出目的条带!表示在相应的位点未发生
EFG
甲基化&每列括号前的数据表示位点数!括号内表示其频率&下同
F=TV
$
N4
"
)
#
90?HI/
"
)
#
DV
B
DV/V0T0= 9^0?Z9? V^V098
B
:.A.V?.0N490?HI/
!
DV/
B
VY
!
]Z.,
/EFG8VTZ
Y
:9T.=0/.TV
&
N4
"
b
#
90?HI/
"
b
#
DV
B
DV/V0T 9^0?/<=@:? V^98
B
:.A.V?.0N490?HI/
!
DV/
B
VY
!
]Z.,
/0=0+8VTZ
Y
:9T.=0/.TV,LZV?9T9 V^A=DV D^9!
90?.0
TZV D^9;
@V0<
Y
&
LZV/98V9/ V^:=],
*(
&
期
!!!!!!!!!!
温秀芳!等$东乡野生稻耐冷渐渗系
EFG
甲基化水平和模式变化研究
早
4
,甲基化模式在两耐冷渐渗系
HI$%%$
和
HI$!&%
中能稳定遗传!遗传率分别为
*$,(J
和
3",*J
两
耐冷渐渗系与受体亲本相比!分别有
!"
和
#
个
6
B
1
岛位点发生了甲基化模式变异!并主要表现为
脱甲基化变异"
6
类#和过甲基化变异"
4
类#其中
HI$%%$
和
HI$!&%
脱甲基化频率分别为
#3,#J
和
#%,%J
&过甲基化变化"
4
类#分别为
&,&J
和
J

表明种间杂交渐渗诱发了受体亲本的甲基化模式发
生了显著变异
A!
耐冷粗定位区间
$%&
甲基化变化特点
基于我们前期东乡野生稻耐冷
KLI/
的粗定
位结果!对渐渗系的耐冷粗定位区间的
6
B
1
进行甲
基化水平和模式特征分析结果发现!受体亲本+协
青早
4
,在耐冷粗定位区间的甲基化水平达
$%,%J
!
与全基因组
6
B
1
岛甲基化水平"
#,&J
#无显著性
差异东乡野生稻和两耐冷渐渗系"
HI$%%$
和
HI$!&%
#在该区间的甲基化水平分别为
!","J
*
#%,%J
和
!,*J
!低于其全基因组
6
B
1
岛甲基化
的平均水平"表
#
和表
%
#受体亲本+协青早
4
,的
甲基化模式"
G
#
和
G
!
#大部分在两耐冷渐渗系中能
得到较稳定的遗传!分别为
*","J
和
","J
与受
体亲本相比!
HI$%%$
和
HI$!&%
耐冷渐渗系中也发
现一定比例的甲基化遗传模式变异!并主要表现为
脱甲基化"
6
类#!分别为
&"J
和
%%,%J
!高于全基
因甲基化模式的变异的平均水平"表
#
和表
%
#
A!
逆转座子区域
$%&
甲基化变化特点
基于我们此前的研究结果!针对耐冷渐渗系
"
HI$%%$
和
HI$!&%
#中已发生逆转录酶活性变化的
逆转座子
!"#$%
和
&(#$
区域设计了
$#
对甲基化
引物!进一步研究双亲及耐冷渐渗系在特定相关区
域的甲基化水平和模式变化特征研究发现!在
!"#$%
和
&(#$
逆转座子区域!+协青早
4
,*东乡野
生稻*
HI$%%$
和
HI$!&%
的甲基化水平 分别为
!,*J
*
$,(J
*
,*J
和
&(,"J
!均高于全基因组
EFG
甲基化的平均水平"表
#
和表
&
#在
!"#$%
和
&(#$
区域!+协青早
4
,*
HI$%%$
和
HI$!&%
之间
的甲基化水平无显著差异!但均与东乡野生稻之间
存在显著差异
HI$%%$
和
HI$!&%
甲基化模式大部
分继承"
3,J
#大部分与受体亲本,协青早
4
,一
致!并主要表现为
G
#
类型的遗传模式在转座子
表
C
!
耐冷渐渗系在耐冷区间
$%&
甲基化水平和模式的遗传与变异特点
L9^:V%
!
LZVY
:9T.=0:VXV:90?
B
9TTVD0/=A
<=:?T=:VD90O
DV//.=0:.0V/9TTZVDV:9T.XVKLI/
材料
C9TVD.9:
被检测
位点数
F=,=A:=<@/
甲基化遗传模式的位点数及频率
F=,90?ADV
;
@V0<
Y
=A.0ZVD.TV?
B
9TTVD0/EFG8VTZ
Y
:9T.=0
总位点数及频率
L=T9::=<@/90?
ADV
;
@V0<
Y
G
#
N4
"
)
#
HI/
"
)
#
G
!
N4
"
b
#
HI/
"
b
#
甲基化变异模式的位点数及频率
F=,90?ADV
;
@V0<
Y
=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0X9D.9T.=0
过甲基化"
4
#
Q
YB
VD8VTZ
Y
:9T.=0
N4
"
b
#
HI/
"
)
#
脱甲基化"
6
#
EV8VTZ
Y
:9T.=0
N4
"
)
#
HI/
"
b
#
N4 #$ 3
"
$%,%J
#
9 3 * ) )
EM\ #$ %
"
!"J
#
^ % #! ) )
HI$%%$ #$ !
"
#%,%J
#
^ !
"
#%,%J
#
*
"
&,*J
#
"
"
&"J
#
HI$!&% #$ &
"
!,*J
#
^ %
"
!"J
#

"
&"J
#
#
"
,*J
#
$
"
%%,%J
#
表
D
!
耐冷渐渗系在逆转座子区域
$%&
甲基化水平和模式的遗传与变异特点
L9^:V&
!
LZVY
:9T.=0:VXV:90?
B
9TTVD0/=A<=:?T=:VD90.0TD=
O
DV//.=0:.0V/9TTZVDVTD=TD90/
B
=/=0/DV
O
.=0
材料
C9TVD.9:
被检测
位点数
F=,=A:=<@/
甲基化遗传模式的位点数及频率
F=,90?ADV
;
@V0<
Y
=A.0ZVD.TV?
B
9TTVD0/EFG8VTZ
Y
:9T.=0
总位点数及频率
L=T9::=<@/90?
ADV
;
@V0<
Y
G
#
N4
"
)
#
HI/
"
)
#
G
!
N4
"
b
#
HI/
"
b
#
甲基化变异模式的位点数及频率
F=,90?ADV
;
@V0<
Y
=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0X9D.9T.=0
过甲基化"
4
#
Q
YB
VD8VTZ
Y
:9T.=0
N4
"
b
#
HI/
"
)
#
脱甲基化"
6
#
EV8VTZ
Y
:9T.=0
N4
"
)
#
HI/
"
b
#
N4 $# %!
"
!,*J
#
9 %! #( ) )
EM\ $# !(
"
$,(J
#
^ !( !! ) )
HI$%%$ $# %%
"
&,*J
#
9 %"
"
$3,(J
#
#%
"
!$,$J
#
%
"
$,(J
#
$
"
(,3J
#
HI$!&% $# %&
"
,*J
#
9 %#
"
",3J
#
#$
"
!(,&J
#
%
"
$,(J
#
!
"
%,(J
#
3(
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
区域!
HI$%%$
和
HI$!&%
的甲基化模式总变异率"包
括过甲基化和脱甲基化#分别为
#$,*J
和
(,3J
!均
低于其他区域甲基化模式的变异率表明耐冷渐渗
系在
!"#$%
和
&(#&
转座子区域具有较高频率的
甲基化修饰和较低的甲基化模式变异率!这利于转
座子和基因组结构的稳定!为渐渗系优异性状的转
移和性状稳定奠定基础
%
!
讨
!
论
外源
EFG
渐渗会给受体基因组带来一种强烈
的-冲击."
1V0=8V/Z=#!这种冲击不仅表现在渐
渗系后代中会产生各种基于基因组序列变化的遗传
学变异!同时还可能发生许多表观遗传学变异(#%)
远缘杂交育种实践告诉我们!表观遗传学变异在许
多作物新品种改良创造了很多新的抗性和新表型!
为作物遗传育种提供了新途径!因而对这些变异发
生的分子机制深入研究将有助于作物品种改
良(!#&)作为表观遗传修饰的重要内容!
EFG
甲基
化可在阻断遗传信息传递而不改变
EFG
序列的情
况下引起生物体形态性状的变化阐明远缘杂交渐
渗过程中基因组的甲基化水平和模式变异特征及分
子机制可为物种的多样性维持机制和分子进化机制
提供理论基础!同时也对新品种的培育提供有益信
息!相关研究已成为表观遗传学研究的热点(#$+#)
C是一种甲基化内切酶!可特异切割含有
甲基化胞嘧啶的
EFG
单链或双链!但不作用于非
甲基化的
EFG
结合
[6技术!此方法不仅可以
检测绝大部分甲基化的胞嘧啶"如
$+
甲基胞嘧啶!
$+
羟甲基胞嘧啶或
F&+
甲基胞嘧啶#!还可针对特异位
点设计引物!研究特定染色体区域的甲基化特征!是
检测胞嘧啶甲基化的有利工具(#*)本研究利用该
技术分析耐冷渐渗系全基因组
3%
个
6
B
1
岛和

个特定区域
6
B
1
岛"
#$
耐冷区间和
$#
转座子区
间#发现!两耐冷渐渗后代稳定遗传了回交亲本的大
部分甲基化水平和模式!但也有一部分位点发生了
EFG
甲基化模式的变异!包括过甲基化和脱甲基
化!但不同区域
6
B
1
位点甲基化水平和变异模式有
明显差异!这与水稻(#&+#$)*拟南芥(#3)*大米草(#()以
及玉米(!")等植物杂交后代的甲基化研究相似与
其他
EFG
甲基化检测方法"如甲基化敏感多态性!
CWG[
#相比!
C酶切法检测得到的
EFG
甲基
化频率略低一些(&!#)!但该技术技术稳定*重复性
好!能精确研究特定位点*特定基因的甲基化水平和
模式变异特征!是研究
EFG
甲基化水平和模式变
化对外源优异基因渐渗影响的有效手段
通常认为基因处于甲基化修饰状态时表达抑
制!而处于非甲基化状态时表达活跃!但无论基因处
于何种状态!都可能使渐渗后代产生相关有利性状
的增强或者产生亲本没有的有利新表型!这取决于
特异位点的甲基化增强或降低对这些性状的影
响(+*)本研究结果表明!两耐冷渐渗系与受体亲本
+协青早
4
,相比!渐渗后代甲基化变异包括脱甲基
化和过甲基化两种方式!并以脱甲基化为主!东乡野
生稻和两耐冷渐渗后代
HI$%%$
和
HI$!&%
在耐冷
KLI/
粗定位区间的甲基化水平明显低于普通区间
的
6
B
1
岛甲基化水平"分别为
!","J
*
#%,%J
和
!,*J
#!并且发生甲基化模式变化的位点中有
$%,3J
是在该区域!推测优异渐渗系在其形成过程
中发生了更为广泛的
EFG
甲基化模式变化!但耐
冷
KLI/
区间的优异基因在杂交渐渗过程中的
EFG
甲基化变异特征和分子机制还需进一步深入
的研究另外!我们此前发现渐渗系中
!"#$%
和
&(#&
转座子的活性较高!而本研究的结果表明!各
参试材料在
!"#$%
和
&(#&
转座子区域的甲基化
水平较其他区域要略高!这是否与
EFG
甲基化沉
默转座子的活性*促进渐渗系性状稳定有关也还有
待于进一步研究
参考文献!
(
#
)
!
ERF1Pc
!
MGF1cC
!
PQGF1P2
!
5+%6,7>TV0T90?
B
9TTVD0=AEFG8VTZ
Y
:9T.=09:TVD9T.=0.0D.O
DV//.XVZ
Y
+
D^.?._9T.=0=AD..
"6,%1D./V^
(
2
)
,385"(5+,9%6%1:;
//
6,5:<515+,9
!
""
!
##%
$
#()!"$,
(
!
)
!
1RIIC1
!
47WLR\LQ,7@U9D
Y
=T.<<
Y
T=/.0V8VTZ
Y
:TD90/AVD9/V/
(
2
)
,;11#%6=5-,5>"
.
?,"985@,+(
)
!
""$
!
*&
$
&3#)$#,
(
%
)
!
Fc4RC Q
!
M7HWHF1d
!
\RLL7\4,EFGA.0
O
VD
B
D.0T.0
O
.0 =^T90
Y
$
B
9/T
!
B
DV/V0T
!
A@T@DV
(
2
)
,A1-5+,
0
%+,-5<515+,9
!
"#&
!
$
$
#)%$,
(
&
)
!
6Q7FIP
!
6Q7F25,6Z90
O
V/=A<
Y
T=/.0V8VTZ
Y
:9T.=0.0?@Y
].?VZ
Y
D^.?._9T.=090?9:=
B
=:
YB
:=.?.0<@<@8./
(
2
)
,<51"@5
!
""3
!
E@
((
&
期
!!!!!!!!!!
温秀芳!等$东乡野生稻耐冷渐渗系
EFG
甲基化水平和模式变化研究
"#"
#$
*3()*((,
(
$
)
!
IHIK
"李丽琴#!
5S6QQ
"付春华#!
PQGR6Q5
"赵春芳#!
5+%6,1V0VT.<90?V
B
.
O
V0VT.O
B
D=(
2
)
2C6%1+C8
)
,"6"
0)
D"@@#1,9%+,"1
"植物生理学通讯#!
""(
!
DE
"

#$
&&)$&3
"
.06Z.0V/V
#
,
(

)
!
WGF7LRCR!
QRWGdGd,\V<.
B
D=<9:?.AAVDV0;
@V0Y
:9T.=0/T9T@/=ATZV
B
=:V0EFG V^T]VV05
#
Z
Y
D^.?/=A
E"6%1#@+#$5("#@aE2:5@,#@
(
2
)
2F#
/
8
)
+,9%
!
"##
!
#3!
$
!#()!!(,
(
*
)
!
G4HE1
!
CSQReHWdHc
!
2G6KS7CHF2C
!
5+%6,6Z90
O
V/.0EFG+8VTZ
Y
:9T.=0?@D.0
O
_
YO
=T.Y
=
O
V0V/./.0.0TVD/
B
V<.A.Y
D^.?/=A
V^90/
"
C8%5"6#//
B
,
#(
2
)
,C6%1+D5663,&(
0
%1D#6+#(5
!
"##
!
#"$
$
%3%)%(%,
(
3
)
!
ISRNE
!
2HGFW!
6GR25
!
5+%6,H?V0T.A.<9T.=090?8=:V<@:9D<
Y
T=:=
OY
909:
Y
/./=A<=:?T=:VD90O
DV//.=0:.0V/?VD.XV?AD=8&(
)
*%
%+,-%I,89T.0
O
].TZ&2(#
.
,
/
"
0
"11D.AA
(
2
)
,F#
/
8
)
+,9%
!
"#!
!
#3*
$
&#)&(,
()
!
2HGFWQ"简水溶#!
MGFc
"万
!
勇#!
ISRNE
"罗向东#!
5+%6,1V0VT.<909:
Y
/./=A<=:?T=:VD90O
/T9
O
V.0E=0
O
>.90
O
].:?D."
&(
)
*%(#
.
,
/
"
0
"1
#(
2
)
,D8,155?#665+,1"
.
?"+%1
)
"植物学报#!
"##
!
DF
"
#
#$
!#)!*
"
.06Z.0V/V
#
,
(
#"
)
!
6Q7FcI
"陈雅玲#!
ISRNE
"罗向东#!
PQGF15L
"张帆涛#!
5+%6,6:=0.0
O
90?V>
B
DV//.=0909:
Y
/./=ADVTD=TD90/
B
=/=0DVXVD/VTD90+
/B
T9/V.0.0TD=
O
DV//.=0:.0V/AD=8E=0
O
>.90
O
].:?D.(
2
)
,D8,155?#665+,1"
.
?"+%1
)
"植物学报#!
"#%
!
DG
"
!
#$
#%3)#&&
"
.06Z.0V/V
#
,
(
##
)
!
简水溶
,
东乡野生稻耐冷性状的
KLI
定位(
E
)
,
南昌$江西师范大学!
"##,
(
#!
)
!
W6QSCG6Q7\G
!
dG[\GFRe[
!
dGCHFWdcP
!
5+%6,C.Y
+^9/V?EFG8VTZ
Y
:9T.=0
B
D=A.:.0
O
$
TVOY
90?9
BB
:.<9T.=0/
(
2
)
,G#965,9;9,:=55%(98
!
""
!
%&
$
!3)$&!,
(
#%
)
!
E7F1N2
!
ISRNE
!
6Q7FcI
!
5+%6,1V0VT.Y
90?
O
V0VT.<O
V/.0TZV.0TD=
O
DV//.=0:.0V/?VD.XV?AD=8&(
)
*%%+,-%I,
89T.0
O
].TZ&2(#
.
,
/
"
0
"11D.AA
(
2
)
2H"#(1%6"
.
A1+5
0
(%+,-5;
0
(,9#6+#(5
!
"#!
!
@@
"
*
#$
#"$()#",
(
#&
)
!
cGWSEGd
!
LWSdHcGCGL
!
dG\dHW
!
5+%6,C=^.:._9T.=0=ATZV9B
=/=08[.0
O
.0.0TVD/
B
V<.A.Y
D^.?D.)
*%
%+,-%90?&2
0
6%$5((,@%
(
2
)
,F#
/
8
)
+,9%
!
"#%
!
#(!
$
#*)!&,
(
#$
)
!
dGFLGCGI
!
2SF4SGLQRF1W
!
WGdSIdRR2
!
5+%6,7
B
.
O
V0VT.<O
V/90?TD90/
B
=/=0DV9Y
D^.?/
(
2
)
,I"J
659#6%(?(55:,1
0
!
"#%
!
%#
$
3#$)3!*,
(
#
)
!
MGF1MW
!
[GFc2
!
PQGRNK
!
5+%6,ED=@
O
ZT+.0?@B
V<.A.Y
:9T.=090?.T/9//=<.9T.=0].TZ?D=@
O
ZTT=:VD90D."
&(
)
*%%+,-%I,
#(
2
)
,H"#(1%6"
.
FB
/
5(,@51+%6?"+%1
)
!
"##
!
!
$
#($#)#(",
(
#*
)
!
PHI47\CGFE
!
Q7FHdR55W,1V0=8V+].?V909:
Y
/./=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0
B
9TTVD0/
(
2
)
,K5-56"
/
@51+
!
""*
!
#%&
$
%($()%($,
(
#3
)
!
CGEISF1G
!
CGWS7IIH\ M
!
MGLWRF4
!
5+%6,\V8=?V:.0
O
=AEFG8VTZ
Y
:9T.=090?
B
ZV0=T
YB
.<90?TD90/B
T.=09:O
V/.0
/
Y
0TZVT.<;(%$,:"
/
,9:=TVTD9
B
:=.?/
(
2
)
2C6%1+C8
)
,"6"
0)
!
""!
!
#!(
$
*%%)*&,
(
#(
)
!
WGICRFG
!
GHFRS6Q7CI
!
M7FE7I25,1V0VT.<90?V
B
.
O
V0VT.<<=0/V
;
@V0Y
D^.?._9T.=090?
B
=:
YB
:=.?
Y
.0E
/
%(+,1%
"
[=9#(
2
)
,I"659#6%(F9"6"
0)
!
""$
!
#&
$
##%)##*$,
(
!"
)
!
W7dQRF\W
!
6QR[\GW,[D=
O
DV//.XV:=//=AEFG8VTZ
Y
:9T.=0DV:V9/V/V
B
.
O
V0VT.<
O
V0V/.:V0<.0
O
AD=89T90?V8:
Y
DV
B
V9TV?89._VI
)
$
O
V0V
(
2
)
,<515+,9
!
""(
!
#3#
$
3#)(#,
(
!#
)
!
ERF1Pc
!
MGF1cC
!
PQGF1P2
!
5+%6,7>TV0T90?
B
9TTVD0=AEFG8VTZ
Y
:9T.=09:TVD9T.=0.0D.O
DV//.XV
Z
Y
D^.?._9T.=0=AD..
"6,%1D./V^
(
2
)
,385"(5+,9%6%1:;
//
6,5:<515+,9
!
""
!
##%
$
#()!"$,
!编辑"宋亚珍#
!!
""*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷