全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 126-130(2012)
收稿日期: 2011-05-24; 修回日期: 2011-10-17
基金项目: 国家质检总局科技项目(2011IK172)
通讯作者: 于翠,博士,农艺师,主要从事植物病害检测研究; Tel: 021-38620578, E-mail:yuc@shciq. gov. cn
第一作者: 代欢欢(1987 - ),女,安徽亳州人,硕士研究生,研究方向为植物病毒检测; E-mail: season. o21@163. com
鸢尾黄斑病毒几种 PCR检测方法的建立和比较研究
代欢欢1,2, 杨翠云2, 周 琦3, 于 翠2*
( 1上海海洋大学, 上海 201306; 2上海出入境检验检疫局食品中心, 上海 200135;
3北京出入境检验检疫局, 北京 100026)
摘要:以带有鸢尾黄斑病毒的烟草叶片为材料,研究建立了 IYSV的普通 RT-PCR、免疫捕获 RT-PCR 和 SYBR Green Ⅰ实
时荧光 RT-PCR方法,并比较了几种检测方法的灵敏度。 结果表明,DAS-ELISA检测灵敏度较低,为 1 mg带毒叶片。 而各
种 PCR方法的灵敏度均高于 DAS-ELISA 100 倍以上,其中 SYBR Green Ⅰ实时荧光 RT-PCR检测灵敏度最高,可从 0. 4 μg
的带毒叶片中检出 IYSV,而 RT-PCR 的灵敏度为 40 μg 带毒叶片,IC-RT-PCR 的检测灵敏度是 RT-PCR 的 4 倍。 鉴于
DAS-ELISA灵敏度较低,建议在用 ELISA初筛时,如样品 OD405值与阴性对照 OD405值之比在 2. 0 左右时需要再用分子方
法加以确证,以防漏检。
关键词:鸢尾黄斑病毒; PCR; 检测方法; 灵敏度
Development and comparative study of several PCR-based approaches for detection
of Iris yellow spot virus ( IYSV) 　 DAI Huan-huan1,2, YANG Cui-yun2, ZHOU Qi3, YU Cui2
( 1Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai
200135, China; 3Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)
Abstract: RT-PCR, immuno-capture RT-PCR and SYBR Green Ⅰ real-time RT-PCR approaches were de-
veloped for detecting IYSV from infected leaves of tobacco (Nicotiana tabacium) plant. Comparative study
on detective sensitivity of these PCR-based approaches was also carried out. In contrast to the double antibody
sandwich (DAS) -ELISA that could only detect the virus from 1 mg of infected leaves, the developed PCR ap-
proaches showed more than 100 times higher sensitivity. In particular, SYBR Green Ⅰ real-time RT-PCR had
the highest sensitivity and could detect IYSV from as low as 0. 4 μg of the infected leaves, while RT-PCR de-
tected the virus only from 40 μg of the infected leaves and IC-RT-PCR showed four times more sensitive than
that of RT-PCR. Since the relative low sensitivity of DAS-ELISA, it is suggested that PCR approaches should
be performed to avoid the possible omission, once the ratio of OD405 between sample and control is about 2. 0
during the primary detection by ELISA.
Key words: Iris yellow spot viru; PCR; detection approach; sensitivity
中图分类号: S432　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)02-0126-05
　 　 鸢尾黄斑病毒( Iris yellow spot virus,IYSV)是
布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(To-
spovirus)病毒。 自 20 世纪 80 年代以来随着植物
病毒研究手段的提高和分子生物学技术的迅速发
展,Tospovirus 属内多种新病毒被鉴定和命名。
IYSV最早于 1992 年在荷兰的鸢尾上被发现。 据
文献报道,IYSV 的寄主范围较窄,但能侵染单子
叶植物。 鸢尾受到侵染时,最初出现褪绿斑,随病
情发展为黄色坏死斑。 依据栽培品种的不同,受侵
染植物可达 50% ~ 95% 。 此外 IYSV 还可自然侵
　
　 2 期 　 　 代欢欢,等:鸢尾黄斑病毒几种 PCR检测方法的建立和比较研究
染洋葱、韭菜等蔬菜作物。 同其它 Tospovirus 病毒
一样,IYSV也通过蓟马传播,病情严重的地区,通
常蓟马也比较多[1 ~ 3]。 目前该病毒在荷兰、意大
利、德国,美国,日本都有报道[4],但国内还没有发
生危害的报道。
鉴于 Tospovirus 属病毒复杂的血清学关系和
我国对鸢尾、洋葱等进口量的不断增加,有必要对
该病毒进行相应的检测技术研究,建立相应的技术
储备。 在本研究中我们建立了鸢尾黄斑病毒的
RT-PCR、免疫捕获 RT-PCR 和 SYBR Green Ⅰ 实
时荧光 RT-PCR检测方法并比较了几种检测方法
的灵敏度。 研究结果为鸢尾黄斑病毒的快速诊断
及分子生物学研究提供了有力的手段。
1　 材料与方法
1. 1　 毒源
IYSV 荷兰分离物由荷兰 Wageningen 大学
Richard Kormelink教授提供,摩擦接种并保存在普
通烟上;IYSV阳性对照及多克隆抗体购自 DSMZ
公司。
1. 2　 主要试剂与仪器
植物总 RNA 提取试剂盒,Quant cDNA 第一
链合成试剂盒及 SuperReal PreMix(SYBR Green)
试剂盒购自 TIANGEN 公司;PCR 反应试剂购自
TaKaRa 公司。 DL-2000 Marker 购自 TaKaRa 公
司。 荧光 PCR仪为 ABI 7500 Fast 实时荧光 PCR
仪。
1. 3　 引物的设计和合成
根据 GenBank发表的 IYSV CP基因的序列保
守区,设计了一对特异性引物,上游引物: 5′-
GACTCACCAATGTCTTCAAC-3′,下游引物: 5′-
TTCCTTTAGCTTATTTCCAG-3′,由上海生工生物
技术有限公司合成。 扩增产物大小为 298 bp。
1. 4　 DAS-ELISA、RNA提取和 RT-PCR方法
DAS-ELISA、RNA 提取和 RT-PCR 方法参考
我们已经发表的方法[5]。 其中 PCR 体系 25 μL:
cDNA 2. 5 μL、10 × buffer 2. 5 μL、Mg2 + 1. 0 μL
(25 mM)、dNTP 4. 0 μL (2. 5 mM)、上下游引物
各 0. 2 μL (20 μM)、 rTaq 0. 3 μL,灭菌水补足
25 μL。 PCR反应条件:94℃预变性 3 min;94℃变
性 1 min,51℃复性 30 s,72℃延伸 30 s,35 个循环;
72℃延伸 10 min,保存于 4℃。
1. 5　 SYBR Green Ⅰ实时荧光 RT-PCR反应
反应在 ABI 7500 Fast 实时荧光 PCR 仪(Ap-
plied Biosystems)上进行,体系为 20 μL,包括模板
cDNA 1. 0 μL、2 × SuperReal PreMix 10 μL、50 ×
ROX Reference Dye 0. 4 μL、上下游引物各 0. 3 μL
(20 μM),加灭菌水补足 20 μL。 反应条件为 95℃
预变性 15 min;95℃ 10 s,51℃ 20 s,72℃ 30 s(采
集荧光信号)共 40 个循环,最后增加熔解过程。
1. 6　 免疫捕获 RT-PCR
IC-RT-PCR方法参照文献[5],条件同 1. 4。
2　 结果与分析
2. 1　 引物特异性检测
根据 GenBank已报道的 IYSV CP基因保守序
列设计特异性引物:IYSV-F / R,预期扩增条带大小
为 298 bp。 用 IYSV-F / R 引物对携带 IYSV 病毒
的叶片进行 RT-PCR 和 SYBR Green Ⅰ 实时荧光
RT-PCR检测,结果表明扩增条带和扩增曲线的亮
度较高、特异性好,而从带有 TSWV、INSV 和健康
的叶片中未能扩增出目标条带(图 1)。 说明针对
IYSV设计的引物特异性强,可与其它植物病毒区
分开来。
2. 2　 DAS-ELISA方法的灵敏度
称取携带 IYSV 的烟草叶片 100 mg 至研钵
中,加入 1 mL 的样品研磨缓冲液,将混匀后的液
体进行 10 倍梯度稀释,得到不同浓度的样品,以上
各浓度样品分别吸取 100 μL,进行 DAS-ELISA检
测。 试验结果表明,稀释到 10 mg·mL -1时样品
检测阳性,而稀释到 1 mg·mL -1和 0. 1 mg·mL -1
时的样品则为阴性反应 (表 1)。 经推算 DAS-
ELISA对带毒叶片的检测灵敏度为 1 mg。
2. 3　 RT-PCR方法的相对灵敏度检测
将含有 IYSV 的总 RNA 按 10 倍梯度稀释后
反转录合成 cDNA,进行 PCR灵敏度研究,当 RNA
稀释至 10 -3后,无法检出 IYSV。 表明 RT-PCR 最
低能从相当于 40 μg 带毒叶片中检测到 IYSV
(图 2)。
721
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 Special amplification plot of SYBR GreenⅠreal-time RT-PCR
A: 1: IYSV; 2: Healthy leaf; 3: INSV; 4: TSWV. B: 1,2: Iris yellow spot virus; 3: INSV; 4: TSWV.
Table 1　 Sensitivity of DAS-ELISA for detection of Iris yellow spot virus
Extraction solution / mg. mL -1 OD405 Reaction type
100 2. 077 +
10 1. 535 +
1 0. 082 -
0. 1 0. 079 -
Positive control 2. 685 +
Negative control 0. 059 -
+ : Positive; - : Negative.
Fig. 2　 Sensitivity of RT-PCR for detection of Iris yellow spot virus
M: DL2000 marker; 1-5: RNA serial dilutions (100, 10 -1, 10 -2, 10 -3, 10 -4); 6: Negative control.
2. 4　 免疫捕获 RT-PCR的灵敏度
从图 3 中可以看出,IC-RT-PCR对带毒叶片的
检测最低极限为 10 -4,相当于可从 10 μg带毒叶片
中检出该病毒。
2. 5 　 SYBR Green Ⅰ realtime RT-PCR 方法的
灵敏度检测
将提取的含 IYSV 的 RNA 按 10 倍梯度稀释
后反转录成 cDNA,进行 SYBR Green Ⅰ 实时荧光
821
　
　 2 期 　 　 代欢欢,等:鸢尾黄斑病毒几种 PCR检测方法的建立和比较研究
Fig. 3　 Sensitivity of IC-RT-PCR for detection of Iris yellow spot virus
M: DL2 000 marker; 1-6: Plant sap serial dilutions (100, 10 -1,10 -2,10 -3,10 -4, 10 -5) .
RT-PCR,结果表明随着 RNA 含量的依次减少,Ct
值依次增大(图 4)。 当稀释到 10 -5倍时检测不到
信号,无扩增曲线。 推算 SYBR Green Ⅰ 实时荧
光 RT-PCR可检测低至 0. 4 μg的带毒叶片。 从荧
光 RT-PCR 熔解曲线分析(图 5),稀释浓度在 100
~ 10 -4的 RNA 的 PCR 产物熔解峰特异,Tm 值为
81. 3 ±0. 4℃,没有其他明显的杂峰出现,稀释浓度
为 10 -5的 RNA以及阴性对照均没有出现熔解峰。
说明没有产生由引物二聚体引起的假阳性扩增信
号,反应体系的特异性高。
3　 结论与讨论
IYSV是危害鸢尾、洋葱等作物的重要病害,
因此快速、灵敏、准确、简便的检测方法的建立是十
分有意义的。 目前,国际上对 IYSV 的研究还很
少,针对该病毒的检测方法报道较少。 本研究首次
利用感染病毒的样品材料建立了 IYSV 的普通
RT-PCR、IC-RT-PCR 和 SYBR Green Ⅰ实时荧光
RT-PCR检测方法并比较了各种方法的灵敏度,对
于进境植物材料中 IYSV 及其它植物病毒的检测
具有借鉴意义。
本研究确定了 DAS-ELISA 检测灵敏度为
1 mg 带毒叶片,而 RT-PCR 的灵敏度为 40 μg 带
毒叶片。 利用 SYBR Green Ⅰ实时荧光 RT-PCR
和 IC-RT-PCR方法可分别从 0. 4 μg和 10 μg带毒
叶片中检出病毒。 这些结果表明 DAS-ELISA 的
检测灵敏度较其他方法低很多。 以往在 ELISA 初
筛样品时,如果样品OD405值 / 阴性对照OD405值
Fig. 4　 Sensitivity of SYBR Green Ⅰ real-time RT-PCR for detection of Iris yellow spot virus
1-6: RNA serial dilutions (100,10 -1,10 -2,10 -3,10 -4,10 -5); 7: Negative control.
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植物病理学报 42 卷
Fig. 5　 Melting curve of the SYBR Green Ⅰ real-time RT-PCR
1-6: RNA serial dilutions (100,10 -1,10 -2,10 -3,10 -4,10 -5);7: Negative control.
≥2. 1 时判定为阳性,但由于 DAS-ELISA 检测
IYSV的灵敏度低,因而在用 DAS-ELISA 初筛时,
如果样品 OD405值与阴性对照 OD405值之比在 2 左
右时需要再用分子方法加以确证,以防漏检。 由于
不同植物种类或不同季节、环境条件下生长的植物
材料可能带毒量有较大差异,因而针对可能携带
IYSV的寄主植物应将 ELISA 和高灵敏度 PCR 方
法结合进行检测。 另外,也可对可能携带 IYSV 的
寄主植物进行隔离试种,以便选取合适的材料进行
有效检测。
由于不同种病毒之间的序列变异较大,容易设
计出适用于 SYBR Green Ⅰ 实时荧光 RT-PCR 检
测的引物。 在本研究中 SYBR Green Ⅰ实时荧光
RT-PCR具有很高的灵敏度,对带毒叶片样品中
IYSV 的检测比 DAS-ELISA 和 RT-PCR 分别高
2 500倍和 100 倍,尤其适于对微量和低含毒量样
品的检测。 免疫捕获 RT-PCR 和普通 RT-PCR 的
检测灵敏度比较在不同的实验中有不同的结
果[5, 6],这可能是由于所采用的病毒和包被抗血清
不同,吸附病毒粒子和反转录效率有差异造成的。
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责任编辑:李晖
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