全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#%("0(#"
&修改稿收到日期$
!"#$("#("#
基金项目$国家自然科学基金项目"
%#"+#+11
#&国家现代农业产业体系项目"
2345(%!
#
作者简介$邢文婷"
#01+
#!女!在读硕士研究生!主要从事作物分子遗传改良研究
6(78-9
$
:-/
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;
1
!
#!)*?@7
"
通信作者$金志强!研究员!主要从事香蕉分子生物学研究
6(78-9
$
AB-
C
-8/
;,
-/!""#
!D
8B@@*?@7*?/
香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析
邢文婷#!!徐碧玉!!王
!
卓!!贾彩红!!刘菊华!!金志强!!%"
"
#
海南大学 农学院!海口
&+"!!1
&
!
中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实
验室!海口
&+##"#
&
%
中国热带农业科学院海口实验站!海口
&+"#"!
#
摘
!
要$通过随机克隆测序的方法从香蕉根系
?EF3
文库中获得胁迫相关蛋白基因!命名为
!"#$%#
"
G=/H8/I
登
录号为
3GJ#$!&+*#
#扩增获得的
?EF3
序列与质粒
KL"0!
的目的片段序列一致!表明
!"#$%#
是香蕉
53M
基因编码框全长
?EF3
!包含一个
&#"N
O
的最大开放阅读框!编码一个长
#)0
个氨基酸的蛋白质蛋白质序列同
源比对发现其含有完整的
3!"
和
3F#
基序结构系统进化树比对分析表明!
!"#$%#
与水稻和獐茅的亲缘关系
较近组织特异性研究表明!
!"#$%#
基因在香蕉根和果实中的表达量较高!在茎中的表达量最低实时荧光定
量
M24
分析表明
!"#$%#
响应激素的处理!同时也响应干旱(低温(高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫可见!
!"#$%#
基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用
关键词$香蕉&胁迫相关蛋白&基因克隆&表达
中图分类号$
P+1&
&
P+1)
文献标志码$
3
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+
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X@>=-/
&
;
=/=?9@/=
&
=:
O
X=..-@/
!!
非生物胁迫困扰着植物的生长!导致其生理(生
化和形态发生变化!严重则会导致死亡&因而制约了
植物的生长发育和作物产量的提高)#*植物在应对
环境胁迫的响应中!诱导大量胁迫基因表达)!($*!使
植物对胁迫产生耐受力)&(+*锌指蛋白是参与调节
植物生长发育和响应逆境的一类关键蛋白)1(0*锌
指蛋白不仅可以参与
EF3
%
4F3
的识别!还能够与
其它蛋白和脂类结合)#"(##*形成其丰富的生物功能
3!"
%
3F#
型锌指蛋白就是其中一类在植物中!
胁迫相关蛋白"
.>X=..8..@?-8>=O
X@>=-/
!
53M
#在
F(
或
2(
端包含
3!"
(
3F#
或均包含
3!"
和
3F#
锌
指结构!一些
53M
蛋白还在
2
端包含额外的
2
D
.
!
(
J-.
!
锌指模块)#!*根据
53M
蛋白结构上的锌指特
点!通过系统进化分析将
3!"
%
3F#
锌指蛋白家族
分 为 两 大 类$类 型
"
53M
蛋 白 具 有 典 型 的
2Q
!
2Q
0(#!
2Q
#(!
2Q
$
2Q
!
JQ
&
JQ2
结构&类型
#
具有
扩展的
2Q
$
2Q
0(#!
2Q
#(!
2Q
$
2Q
!
JQ
&
JQ2
结构)#%*
前人研究表明!拟南芥中有
#"
个
53M
均包含
3!"
和
3F#
锌指结构!
%
个
53M
具有
!
个
3F#
锌指结
构域!
#
个
53M
具有
#
个
3F#
锌指结构域)#$*水
稻中
#1
个
53M
均包含有
3!"
和%或
3F#
锌指结
构域!
##
个
53M
包含单个
3!"
和
3F#
锌指结构
域&
*#$%#!
包含
!
个
3!"
和
#
个
3F#
锌指结构
域)#!*在水稻全基因组中
#1
个
53M
基因在非胁
迫条件下有
)
个表达量较高!
$
个表达量较低)#!*
番茄的
#%
个
53M
基因成员对多种逆境胁迫均有应
答)#&*&玉米的
+
个
53M
基因成员对冷胁迫均表现
为上调表达)#)*过量表达
53M
基因能提高植物对
逆境的耐受力)#+(#0*
香蕉是热带(亚热带发展中国家重要的农作物
之一其果实由于富含丰富的蛋白质和碳水化合
物!是一些热带地区人民的主要粮食和国民收入的
主要来源)!"*在香蕉生产过程中经常遭受病虫害(
低温(干旱和盐渍等因素的影响!降低了香蕉产量和
果实品质!因此研究香蕉抗逆的机理十分重要笔
者从王卓等)!#*之前构建的香蕉根系均一化全长
?E(
F3
文库中进行随机测序获得一个包含
53M
基因
的克隆!通过实时荧光定量
M24
方法研究该基因在
香蕉对逆境响应中的表达变化!以期能够揭示该基
因的生理功能
#
!
材料和方法
A*A
!
材料及处理
供试香蕉幼苗购自中国热带农业科学院组培中
心!苗龄为移栽大棚后约
)"的杯苗!浇灌
J@8
;
(
98/+
.
营养液)
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;
%
W[FK
%
!
"*1!
;
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W28
"
FK
%
#
!
!
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;
%
W^
;
5K
$
,
+J
!
K
!
"*#%)
;
%
W[J
!
MK
$
!
"*)
7
;
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W _=5K
$
!
!*1) 7
;
%
W J
%
HK
%
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#*1# 7
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W
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!
,
$J
!
K
!
"*"17
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W2U5K
$
,
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!
K
!
"*!!
7
;
%
W L/5K
$
,
+J
!
K
!
"*"0 7
;
%
W J
!
@^K
$
,
$J
!
K
*!
O
J)*"
)
!!
*
材料分
1
个组!每组处理
!"
棵
苗
30*",04 15
(
*
2
104 Y*
2
.6,"/,*
"
Y*5
O
#
?UN=/.=]X@
O
-?8948?=$
"
_@?]4$
#处理$将幼苗置
于
#*&` #"
) 个%
7W
的孢子悬液中!在接种
!
(
$
和
)
后取样!接种前"
#为对照另外!将幼苗置于
分别含
#""
$
7@9
%
W
脱落酸"
3H3
#(
#a
"
7
%
7
#乙烯
利"
6>B=
O
B@/
#(
#""
$
7@9
%
W
茉莉酸甲酯"
=^V3
#(
#""
$
7@9
%
W
水杨酸"
53
#(
!""77@9
%
WF829
及
!&"
77@9
%
WM6G()"""
的溶液中&低温处理为将香蕉幼
苗置于
1b
环境中&以上材料处理分别在
)
(
#!
和
!$B
后取样!对照为处理
"B
的样品上述样品均
用液氮速冻!存于
1"b
备用
A*B
!
文库的筛选
取
!
$
W
含文库质粒的大肠杆菌
EJ#"H
菌液
涂于氯霉素平板!随机挑取大于
1""N
O
的克隆进行
菌落
M24
鉴定使用
0)
孔板进行碱裂解法提取质
粒
EF3
!测序委托深圳华大基因研究院完成测出
的
EF3
序列在经过切除载体和接头序列后在
F2(
HR
核酸数据库
HW35]/
和蛋白数据库
HW35]:
中
进行同源核苷酸和蛋白序列检索应用
EF3(
^3F
(
MX@>M8X87
和
^6G3&*"
等生物软件分析
获得
?EF3
序列及其编码蛋白质的结构域!并与
F2HR
数据库"
B>>
O
$%%
<<<*/?N-*/97*/-B*
;
@Z
%
N98.>
#和香蕉
3
基因组数据库"
B>>
O
$%%
N8/8/8(
;
=(
/@7=*?-X8\*YX
%
>@@9.*B>79
#中已知核酸和蛋白序列
进行比较分析
A9C
!
1$0!5A
在香蕉不同器官的表达分析
选取生长
1
个月的香蕉根(球茎(假茎(叶(花和
果实按照
S8/
等)!%*的方法提取
4F3
每个样品
取
$
$
;
总
4F3
!用
R/Z->X@
;
=/5U
O
=X5?X-
O
>
]^
%
4=(
Z=X.=]X8/.?X-
O
>8.=
合成
?EF3
第一链以香蕉
根(球茎(假茎(叶(花和果实的
?EF3
为模板!以
!"$6+,8
片段为内参!采用
4](M24
方法对其进行
组织特异性表达分析
!"#$%#
引物为
M
#
"
&c(
333G22323G]]3]]3G2G(%c
#和
M
!
"
&c(]]2(
2G3GG]22]G]3]G3](%c
#&
!"$6+,8#
引物为
M
#
"
&c(2G3GG2]233]2333G3(%c
#和
M
!
"
&c(
3223G233GG]223332(%c
#
)!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
A9D
!
实时定量
4$E
检测
1$0!5A
在香蕉各种胁
迫中的表达
实时定量
M24
采用
]848[8
公司的试剂盒!染
料为
5dH4GX==/
!在吉泰生物科技公司
:^%""&M
荧光定量
M24
仪上进行以接种后不同时间点的
香蕉根系
?EF3
第一链为模板!以
!"$6+,8
片段为
内标!引物同
A*C
荧光定量
M24
的反应程序如
下$
0&b
预变性
%7-/
&
0&b
变性
+.
!
)"b
退火
#&
.
!
+!b
延伸
!".
!循环
$"
次
!
!
结果与分析
B9A
!
1$0!5A
克隆与序列分析
通过对香蕉根系
?EF3
文库克隆的随机测序!
KL"0!
克隆上的
?EF3
片段可能属于香蕉胁迫相
关蛋白基因"图
#
!
3
#克隆测序!根据其
K4_
设计
的引物在香蕉根系
?EF3
中扩增出大小一致的特
异产物"图
#
!
H
#特异片段克隆到
O
E^#0(]Z=?>@X
中进行测序分析!结果也完全一致!表明该序列是香
蕉
53M
基因编码框全长
?EF3
!命名为
!"#$%#
!
G=/H8/I
登录号为
3GJ#$!&+*#

!"#$%#
序列全长为
#"%1N
O
!其中
&c
非翻译
区
#0#N
O
!
%c
非翻译区
%%+N
O
!含有一个
&#"N
O
的
K4_
!编码
#)0
个氨基酸残基可编码分子量为
#1*1&IE
和等电点为
1*#0
的氨基酸序列!而且对
氨基酸序列结构预测发现!
8^53M#
在其
F
端都有
完整的
3!"
保守基序!
2
端都有完整的
3F#
保守
基序"图
!
#
)
#&
*

8^53M#
氨基酸序列与香蕉
3
基
因组氨基酸序列进行比对!发现与
!0#$%0
基因
"登录号为
G5^ T3
-
3?BX!M#!+&"
-
""#
#高度同源!
其相似性为
01*!0a
!仅在
1)
和
##$
位的氨基酸不
同与其它植物的
3!"
%
3F#
锌指蛋白基因氨基酸
序列进行
HW35]
O
比对!结果显示
!"#$%#
与玉
图
#
!
!"#$%#
全长
?EF3M24
结果
3*
文库质粒克隆检测&
H*!"#$%#K4_
扩增
_-
;
*#
!
M24@YYU9(9=/
;
>B?EF3.=
C
U=/?=.@Y!"#$%#
3*M98.7-\?9@/-/
;
M24
O
X@\U?>
&
H*!"#$%#K4_M24
O
X@\U?>
图
!
!
8^53M#
与其他植物
53M
氨基酸序列比对分析
下划线标注序列为
53M
家族的保守基序选用的同源氨基酸序列为香蕉
53M0
"
G5^ T3
-
3?BX!M#!+&"
-
""#
#(
玉米
L_M
"
33Q#$)%+*#
#(番茄
53M%
"
32^ )1$$"*#
#(水稻
53M)
"
P1&![&*#
#(水稻
53M0
"
P+d#S0*#
#
_-
;
*!
!
2@7
O
8X-.@/@Y>B=\=\U?>=\87-/@8?-\.=
C
U=/?=.@Y 8^53M#
O
X@>=-/.8/\@>B=X
O
98/>.
5=
C
U=/?=.78XI=\N
D
U/\=X9-/=..B@<>B=?@/.=XZ=\7@>-Y@Y53MY87-9
D
*37-/@8?-\7U9>-
O
9=89-
;
/7=/>@Y!"#$%#
<->BB@7@9@
;
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O
98/>.
$
!0*""604,8"+"53M0
"
G5^ T3
-
3?BX!M#!+&"
-
""#
#!
9."4"
(
*L_M
"
33Q#$)%+*#
#!
#1/"804/
(
61
2
.*,60453M%
"
32^ )1$$"*#
#!
&
(
)"*"+,-"53M)
"
P1&![&*#
#!
&
(
)"*"+,-"53M0
"
P+d#S0*#
#
+!!
!
期
!!!!!!!!!!!!!
邢文婷!等$香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析
米(水稻和番茄的
53M
蛋白相似度较高"图
!
#采
用
29U.>89S
和
^6G3&*"
软件分析了
!"#$%#
与其它植物
53M
基因的进化关系!
N@@>.>X8
O
为
#"""
系统进化树分析表明!
!"#$%#
与水稻
&*:
#$%)
"
P1&![&*#
#和
&*#$%0
"
P+d#S0*#
#以及獐
茅
$/93%
"
3H[0")%#*#
#等植物的过氧化物酶基因
聚类到一起"图
%
#
B9B
!
1$0!5A
组织特异性表达分析
采用半定量
4](M24
方法!以
!"$6+,8
作为内
参!分别检测香蕉不同部位
!"#$%#74F3
转录
水平的变化结果表明$
!"#$%#
在香蕉不同部位
的表达水平有一定的差异!在根和果实中的表达量
较高!在茎中的表达量最低"图
$
#
B9C
!
1$0!5A
表达分析
为了研究
!"#$%#
对逆境胁迫的应答方式!对
不同胁迫条件处理的香蕉根系提取总
4F3
!以
!"$6+,8
为内参基因!进行实时定量
M24
分析所
采用的处理包括$生物胁迫"
_@?]4$
#和非生物胁
图
%
!
植物
3!"
%
3F9
锌指蛋白基因的系统进化树
节点上的数值表示
N@@>.>X8
O
重复
#"""
次的置信度
_-
;
*%
!
MB
D
9@
;
=/=>-?>X==@Y3!"
%
3F9
A-/?(Y-/
;
=X
O
X@>=-/.-/
O
98/>.
e89U=.8>/@\=..B@<>B=?@/Y-\=/?=9=Z=9
@YN@@>.>X8
O
X=
O
9-?8>-@/#"""
图
$
!
半定量
4](M24
检测
!"#$%#
在
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升!在
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倍"图
&
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此外!从图
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可见在非生物胁迫中!
3H3
处理后
!"#$%#
在
#!B
增加约
#"
倍!而在其它时间点
!"#$%#
表达变化不大经乙烯利和
53
处理后!
!"#$%#
表达逐渐上升!并都在
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达到最大值!
分别约为对照的
!&
倍和
0*!
倍在
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处理中!
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在
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上调表达!其表达量是对照的
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倍 !之后便下降!在
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低于对照!在
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不及对
图
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处理后
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在不同发育时期表达模式
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水平上的显著性差异
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响应逆境胁迫表达模式
不同小写字母表示处理间在
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水平上存在显著性差异
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诱导
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的表达其中!
!"#$%#
在
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干旱处理
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达到最大值&在冷处理
)B
表达
量就达到最大!为对照的
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倍!虽然之后有所下
降!但还是高于对照&经
F829
处理后
!"#$%#
在
)
B
是对照的
!*$
倍!但之后逐渐下降!在
!$B
仅为
对照的一半以上结果表明
!"#$%#
的表达均受
生物和非生物胁迫以及信号分子的诱导!可能参与
了香蕉对逆境胁迫的应答
%
!
讨
!
论
53M
参与植物生长发育和植物对各种胁迫响
应的过程)#&*本实验克隆到的
!"#$%#
编码的蛋
白序列与其它植物的
53M
蛋白具有较高的一致性!
其蛋白序列中包含
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和
3F#
完整的保守基序!
表明该蛋白确实为胁迫相关蛋白)#)*
!"#$%#
与
香蕉
3
基因组中的
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高度一致!表明这
!
个基因可能是直系同源基因!差异产生于最近的基
因复制事件)!$*
!"#$%#
在香蕉各个组织中均有表达!且对多
种信号激素处理也表现出上调响应!表明在该基因
的启动子中可能含有受这些激素调控的顺式作用元
件)!&*!并在香蕉的生长发育过程中起着重要作用
很多研究表明
53M
参与植物的胁迫响应过
程)#1(#0*
&*,#$%#
是第一个被鉴定的植物
3!"
%
3F#
锌指蛋白基因!该基因可被多种胁迫所诱导!
如低温(盐(重金属(伤害和
3H3
等在烟草中过
量表达该基因能增强烟草种子和苗期对干旱(冷和
盐胁迫的耐受性)#%*在本研究中!
!"#$%#
同样对
多种胁迫表现出上调响应!如干旱(低温(高盐和枯
萎病处理等!表明
!"#$%#
广泛参与香蕉响应多种
胁迫!是一个很重要的抗逆基因由于香蕉耐寒性
较差!在
1b
时香蕉的生长将受到影响!导致寒害发
生)!)*对于低温处理!在香蕉中
!"#$%#
响应明
显!说明该基因在香蕉响应低温胁迫中起着重要作
用在其它作物中也发现类似现象!如玉米的
3!"
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3F#
锌指蛋白基因
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和
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对冷胁
迫均表现为上调表达)#)*但在番茄中所有的
59(
53M.
对冷胁迫响应变化很小)#&*!其中可能的原因
是不同物种对冷或低温胁迫响应的方式存在差异!
通过不同的激素或代谢途径来适应冷或低温
胁迫)!+*
本试验从香蕉中获得了
53M
基因!并对该基因
和推导出的氨基酸序列进行了若干分析!再对香蕉
组织和胁迫的响应进行研究!说明该基因参与了香
蕉的生长发育及胁迫反应!然而对其具体的调控机
理并未进行深入的研究今后将对
!"#$%#
进行
过量表达研究!探讨其如何调控香蕉生长发育和响
应胁迫!以期能揭示
53M
在香蕉中的生理作用
参考文献!
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