全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$("!(!#
&修改稿收到日期$
!"#$("$("0
基金项目$中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金"
1233!"#$45#$
#&国家现代农业产业体系项目"
6789(%!
#
作者简介$王
!
卓"
#:0!
#!男!博士!主要从事香蕉分子生物学研究
;(<=->
$
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@
ABCDEF
!
#!*+ED<
"
通信作者$金志强!博士!研究员!主要从事香蕉分子生物学研究
;(<=->
$
#0*0:0)*:&*
!
#*%+ED<
香蕉肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达分析
王
!
卓#!徐碧玉#!贾彩红#!李健平#!刘菊华#!
张建斌#!苗红霞#!金志强#!"
"
#
中国热带农业科学院热带生物技术研究所%农业部热带生物技术重点开放实验室!海口
$&##"#
&
!
中国热带农业科学院海口
实验站%海南省香蕉遗传改良重点实验室!海口
$&"#"!
#
摘
!
要$肉桂醇脱氢酶"
67G
#在木质素合成过程中起关键作用通过
876;
"
H=
I
-F(=<
I
>-J-E=K-D/DJEGL7M/F.
#方
法从香蕉根系
EGL7
均一化全长文库中获得一个肉桂醇脱氢酶基因!命名为
!"#$%#
"
NM/3=/O
登录号为
PQ$0!$%%
#
!"#$%#
是香蕉
R53
基因编码框全长
EGL7
!包含一个
#"&&S
I
的最大开放阅读框"
T8Q
#!编码
%$0
个氨基酸蛋白质序列同源比对发现!其含有完整的醇脱氧酶的典型保守结构域!属于典型的
67G
蛋白系
统进化树比对分析表明!
R=67G#
与水稻
T.67G*
"
67G%::"&
#的亲缘关系较近组织特异性研究表明
!"#$%#
基因组成型表达于香蕉各个组织在耐病和感病品种中!
!"#$%#
均上调表达!但在耐病品种中
!"#$%#
在所有
时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种!表明
!"#$%#
基因在香蕉的抗病性中起着重要作用!
!"#$%#
可
以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因
关键词$香蕉&肉桂醇脱氢酶&基因克隆&表达分析
中图分类号$
U&0$
&
U&0*
文献标志码$
7
$"%&(%)*+%",#,
-
),!./
0
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4
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R17T\D/
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I
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Y
DJ2HD
I
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@
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Y
DJ2HD
I
-E=>7
@
H-EC>KCH=>9E-M/EM.+\=-ODC$&"#"!
!
6B-/=
#
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Y
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Y
FHD
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67G
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Y
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Y
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Y
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Y
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HM
I
DHKKBMMEC>=HEB=H=EKMH-.K-E.DJ67G
@
M/ME>D/MFJHD"
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HDC
I
!
E_+
6=_M/F-.B
#
C.-/
@
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I
M/HM=F-/
@
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I
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YI
M
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@
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K
YI
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Y
FHD
@
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YI
-E=>67G
I
HDKM-/+`B
Y
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M/MK-E=(
/=>
Y
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^
CM/EMDJR=67G#=>.DB=.B-
@
B.-<->=H-K
Y
KDT.67G*
"
67G%::"&
#
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I
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Y
M]
I
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@
+1/HM.-.K=/K=/F.C.EM
I
K-S>M_=H-MK-M.DJS=/=/==JKMH-/DEC(
>=K-D/QDE28)
!
KBMM]
I
HM..-D/DJ!"#$%#?=.FMEHM=.MF+VB->M-/HM.-.K=/K_=H-MK-M.KBMK-I
D-/KDJ
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!
ED<
I
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@
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I
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KB=KKB-.
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@
M/M-/S=(
/=/=.MMF>-/
@
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4
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$
S=/=/=
"
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I
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E_+6=_M/F-.B
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E-//=<
Y
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Y
FHD
@
M/=.M
&
@
M/M
E>D/M
&
M]
I
HM..-D/=/=>
Y
.-.
!!
木质素是由苯丙烷类单体聚合而成的酚类多聚
体!赋予植物机械强度和疏水性!在植物对环境适应
中起着重要作用研究发现在苔类地钱和红藻等非
维管植物中也存在木质素(#)在植物中木质素以三
维立体聚合物嵌入植物细胞壁!其木质素单体主要
分为
%
类$愈创木基木质素"
@
C=-=E
Y
>>-
@
/-/
!
N(
木质
素#*对
(
羟基苯基木质素"
B
Y
FHD]
Y
(
I
BM/
Y
>>-
@
/-/
!
\(
木质素#和紫丁香基木质素"
.
Y
H-/
@Y
>[-
@
/-/
!
9(
木质
素#这些单体在不同科的植物中其数量和比例不
同(!(%)肉桂醇脱氢酶"
E-//=<
Y
>=>EDBD>FMB
Y
FHD(
@
M/=.M
!
67G
#属于依赖于
L7G` 的酶类!在木质
素合成中有着重要作用!是木质素单体合成途径中
的还原酶之一
67G
主要在木质素单体合成过程
中最后一步起作用!其催化对
(
香豆酸*松柏醛及芥
子酸还原成相应的醇
67G
在木质素种类和功能
多样性中起重要作用(#)迄今!已从多种植物如烟
草()($)*桉 树(*(&)*草 莓(0)*拟 南 芥(:)*苜 蓿(#")*小
麦(##)*小立碗藓(#!)*蒿(#%)和茶(#))等中克隆了
67G
基因在已完成全基因组测序的香蕉
7
基因组中
预测出
&
个
67G
基因(#$)但尚未见香蕉
67G
基
因克隆及表达分析的相关报道
香蕉是热带*亚热带发展中国家重要的农作物
之一其果实由于富含蛋白质和碳水化合物!是一
些热带地区人民的主要粮食和国民收入的主要来
源(#*)然而香蕉枯萎病严重威胁香蕉的正常生
产(#&)木质素在植物抗病中起着重要作用!木质素
快速沉积或木质素类物质的生成能限制病原菌的生
长和侵染!进而起到抗病作用(#0(!")同样作为木质
素合成的末端酶!
67G
基因的表达往往也伴随着病
原菌的侵染而增加(!#(!!)!
67G
基因的表达与植物抗
病性密切相关因此!了解香蕉
67G
将有助于阐
明木质素合成的调控机理!为全面揭示香蕉木质素
代谢与香蕉枯萎病的密切关系奠定理论基础本研
究首次从香蕉中分离并克隆一个
!"#$%
基因!利
用生物信息学网站分析该基因的结构特性!采用荧
光定量技术分析该基因的表达模式!探讨
!"#$%
在枯萎病菌胁迫下香蕉根系中的表达调控!有助于
进一步了解香蕉抗枯萎病的调控机理
#
!
材料和方法
>+>
!
材料及处理
供试香蕉品种为+巴西蕉,"
E_+6=_M/F-.B
#和
+农科
#
号,"
E_+LD/
@
OMLD+#
#购自中国热带农业
科学院组培中心!苗龄为移栽大棚后约
*"F
的健康
杯苗!其中+巴西蕉,为枯萎病菌感病品种!+农科
#
号,为耐病品种香蕉枯萎病菌
)
号生理小种(
-&.
"/*&)01
2

3
0/&)J
3
4(*"5*
"
J+9
I
#
(&64+42HD
I
(
-E=>8=EM)
!
QDE28)
)!为中国热带农业科学院环境
与植物保护研究所张欣博士馈赠
>+?
!
方
!
法
>+?+>
!
病原菌的培养收集及接种香蕉
!
将香蕉枯
萎病生理
)
号小种孢子悬浮液接种于马铃薯葡萄糖琼
脂培养基"
G`7
#上!
0a
培养
&F
!用无菌水将孢子洗
下来!用
!
层
R-HDE>DKB
膜过滤!滤液
)"""H
%
<-/
离心
#$<-/
!弃上清!沉淀用
$"<[
无菌水重悬!再
)"""H
%
<-/
离心
#$<-/
!重复
!
次!收集
QDE28)
孢子
将+巴西蕉,"
E_+6=_M/F-.B777
#和+农科
#
号,"
E_+LD/
@
OMLD+#
#分为
!
组!每组
*"
棵幼苗
以蘸根接菌法接种
QDE28)
!接种浓度为每毫升
#
b#"
* 个孢子接种后
!
*
)
和
*F
取样!以未接种的
为对照"
F
#液氮中速冻后!置于
0"a
冰箱备
用!重复
%
次
>+?+?
!
文库的筛选
!
取
!
"
[
含文库质粒的大肠杆
菌
G\#"3
菌液涂于氯霉素平板上!随机挑取克隆
进行菌落
6`8
鉴定!挑取大于
0""S
I
的克隆(!%)
使用
:*
孔板进行碱裂解法提取质粒
GL7
!测序委
托北京华大基因技术公司完成测出的
GL7
序列
经过切除载体和接头序列后在
L631
核酸数据库
3[792/
和蛋白数据库
3[792]
中进行同源核苷
酸和蛋白序列检索应用
GL7R7L
*
H`DK`=H=<
和
R;N7)
等生物软件分析获得
EGL7
序列及其
编码蛋白质的结构特点!并与
L631
数据库"
BK(
K
I
$%%
???+/ES-+/><+/-B+
@
D_
%
S>=.K
#和香蕉
7
基
因 组 数 据 库 "
BKK
I
$%%
S=/=/=(
@
M/D%
KDD>.+BK<>
#中已知核酸和蛋白序列进行比较分析
>@?@A
!
1$2!3>
在香蕉不同器官的表达分析
!
选
取生长
0
个月的香蕉根*球茎*假茎*叶*花和果实按
照
V=/
等(!))的方法提取
8L7
每个样品取
)
"
@
总
8L7
!用
1/_-KHD
@
M/9C
I
MH9EH-
I
K
2R
#
8M_MH.M
2H=/.EH-
I
K=.M
合成
EGL7
第一链以香蕉根*球
茎*假茎*叶*花和果实的
EGL7
为模板!以
!"$(.
,*+
片段为内参!采用
82(`68
方法对其进行组织
特异性表达分析将
!"#$%#
在香蕉
7
基因组数
据库"
BKK
I
$%%
S=/=/=(
@
M/D%
KDD>.+BK<>
#
中进行比对!在序列
$c
端非保守区域设计
!"#$%#
基因表达引物
`
#
"
$c(N7N77NNN7N776NN7(
N26(%c
#和
`
!
"
$c(266676622N77N22N62(%c
#
R=7EK-/#
引物为
L` #
"
$c(6N7NN6267726777(
*"%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
N7(%c
#和
L` !
"
$c(7667N677NN2667776(%c
#
>@?@B
!
香蕉接种
C"DEB
后
1$2!3>
的表达
!
以
接种后不同时间点的香蕉根系
EGL7
第一链为模
板!引物同
#+!+%
!以
!"$(,*+
片段为内标!采用实
时荧光定量
6`8
检测
!"#$%#
的表达
6`8
反
应程序为$
:$a
预变性
%<-/
&
:$a
变性
&.
!
*"a
退火
#$.
!
&!a
延伸
!".
!循环
)"
次实时定量
6`8
采用
2=8=P=
公司的试剂盒!染料为
9538
NHMM/
!在吉泰生物科技公司
R]%""$`
荧光定量
6`8
仪上进行
>+A
!
数据统计分析
每个实验组均做
%
次生物重复!利用
979
软件
"
979:+"JDHV-/FD?.
#进行显著性分析结果用
P
Y
>`DK
软件进行绘图
!
!
结果与分析
?@>
!
1$2!3>
克隆与序列分析
通过对香蕉根系
EGL7
文库克隆的随机测序!
获得一个可能是香蕉肉桂醇脱氢酶基因的
EGL7
片段!将克隆测通后获得完整的
T8Q
"图
#
#测序
后经
3[792
比对发现!该序列与其他植物
67G
基
因序列具有较高一致性!表明该序列是香蕉
67G
基因编码框全长
EGL7
!命名为
!"#$%#
!
NM/3=/O
登录号为
PQ$0!$%%

!"#$%#
序列全长为
#)!&
S
I
!其中
$c
非翻译区
#*0S
I
!
%c
非翻译区
#0!S
I
!含
有一个
#"&&S
I
的
T8Q
!编码
%$0
个氨基酸残基
"图
!
#
R=67G#
推导的氨基酸可编码预期分子量
为
%:+!)OG
!等电点为
*+$$
在
NM/3=/O
中对
R=67G#
蛋白质进行保守结构域搜索和同源性分
析!结果表明
R=67G#
蛋白属于
67G#
家族成员
R=67G#
蛋白在
L
端具有醇脱氧酶的典型保守结
构域$包括
!
个
4/
!d结合位点和
#
个
L7G
"
`
#辅酶
结合位点"图
%
#为了研究
R=67G#
与其它各物
种间 的 进 化 关 系!利 用 软 件
R;N7 )+"
将
!"#$%#
基因的氨基酸序列和拟南芥*水稻的
67G
氨基酸序列利用软件
R;N7)+"
中的
L(Z
的
方法构建系统进化树由图
)
结果可知!所有
67G
基因大致可以分为
%
个类型
R=67G#
分属于
6>=..
#
类!它与
T.67G*
同源关系最近"图
)
#
?@?
!
香蕉
1$2!3>
组织特异性表达分析
采用半定量
82(`68
方法!以
!"$(,*+
作为内参!
分别检测香蕉不同部位
!"#$%#<8L7
转录水平的
变化结果表明!
!"#$%#
在假茎中表达量最高!是根
中的
*+!
倍在叶和果实中表达量较高!其表达量分
别是根系中相对表达量的
%+!
和
!+*
倍"图
$
#
图
#
!
!"#$%#
的全长
EGL7 6`8
产物凝胶电泳检测结果
7+
文库质粒克隆检测&
3+!"#$%#T8Q
扩增&
R+G[!"""
Q-
@
+#
!
1FM/K-J-E=K-D/DJKBM 6`8
I
HDFCEK.DJ
JC>(>M/
@
KBEGL7.M
^
CM/EMDJ!"#$%#
7+`>=.<-FE>D/-/
@
6`8
I
HDFCEK
&
3+!"#$%#
T8Q 6`8
I
HDFCEK
&
R+G[!"""
图
!
!
!"#$%#
编码的核酸和氨基酸序列
带下划线的碱基序列表示起始密码子&
"
表示终止密码子
Q-
@
+!
!
LCE>MDK-FM=/FFMFCEM=<-/D=E-F
.M
^
CM/EMDJ!"#$%#
2BM/CE>MDK-FM.M
^
CM/EM?-KBC/FMH>-/MF-/-K-=KDHEDFD/
&
"
?@A
!
不同抗性香蕉品种接种
C"DEB
后
1$2!3>
的表达
香蕉枯萎病是一种典型的土传病害!病菌从香
蕉根系入侵!形成整株危害!在香蕉整个生长周期均
可发病接种
%
周后!感病品种+巴西蕉,叶片明显
发黄*下垂!叶片周围干枯!植株生长明显减缓&耐病
品种+农科
#
号,则没有明显的发病症状"图
*
#
在感病品种+巴西蕉,中!
!"#$%#
的相对表达
量在接种
QDE28)
后逐渐下降!且差异达到极显著
"
7
#
"+"#
#&在接种
*F
时
!"#$%#
的相对表达量
达到最低!相对表达量值为
"+!:
!仅为对照的三分
之一"图
&
#在耐病品种+农科
#
号,中
!"#$%#
&"%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!!
王
!
卓!等$香蕉肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达分析
的相对表达量在接种
QDE28)
后显著增加"
7
#
"+"#
#!在接种
*F
时
!"#$%#
的相对表达量达到
最大!是对照的
)+#
倍"图
&
#因此!从相对表达量
的变化上看
!"#$%#
在感病品种+巴西蕉,中的表
达被抑制!而在耐病品种+农科
#
号,中的表达被激
活!表明该基因可能与香蕉的抗病反应密切相关
%
!
讨
!
论
木质素经苯丙烷生物合成途径合成!是植物中
主要的代谢产物之一!其含量仅次于纤维素的大分
子有机物质!在为植物提供机械力*运输水分和抵抗
外界逆境等方面起着重要作用(!$(!*)
67G
为催化
图
%
!
R=67G#
和其他植物
67G
的序列比对分析
图中从上至下依次代表的是枣椰*油棕*中国莲*木本棉*梅*甜菜*茶*烟草*苹果中相应的
67G
氨基酸序列&
划实线部分为
4/
!d结合位点!虚线部分为
L7G` 结合位点
Q-
@
+%
!
7>-
@
/^
CM/EM.DJR=67G#=/FDKBMH
I
>=/K67G.
2BM=<-/D=E-F.M
^
CM/EM.-/KBM<=
I
.?B-EBJHDI
KDKBMSDKKDI
HM.M/K=HM
$
7804+*19"(,
2
5*
:
4/"
!
;5"4*
<
&*+44+*
!
=45&)60+&(*
:
4/"
!
>0
23
*&)"/60/4&)
!
7/&+&)&)4
!
?4,"@&5
<
"/*.CS.
I
+@&5
<
"/*
!
#")455*"*+4+*
!
=*(0,*"+",0)4+,0*
:
0/)*
!
!"5&90)4,*("+4/
!d
S-/F-/
@
-/MF
!
=/FL7G` \S-/F-/
@
-/MF
图
)
!
R=67G#
蛋白与拟南芥和水稻
67G
蛋白的进化树
图中分支点的数字表示
3DDK.KH=
I
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度的百分比&括号内为氨基酸登录号
Q-
@
+)
!
B`
Y
>D
@
M/MK-EHM>=K-D/.B-
I
SMK?MM/KBMS=/=/=DJ67G#=/F67G
I
HDKM-/.JHD<$/"6*90
3
*,8"5*"+"=/FA/
2
B"",*@"
2BM/C-=S->-K
YI
MHEM/KDJ3DDK.KH=
I
_=>CM.S=.MFD/#"""HM
I
>-E=K-D/.
&
2BM=EEM..-D/LD+?=.
@
-_M/-/SH=EOMK.
0"%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
U82(`68
检测
!"#$%#
在
香蕉不同部位中的表达情况
8+
根&
8B+
球茎&
+`
假茎&
[+
叶&
Q+
花&
QH+
果实
Q-
@
+$
!
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不同抗性香蕉品种接种
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木质素单体生物合成的最后一个酶!在木质素种类
和功能多样性中起着重要作用(#)本研究获得
#
个
全长香蕉
67G#
基因在序列分析方面!该基因与
其它植物的
67G
基因具有较高一致性
R=67G#
编码氨基酸的分子量为
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!等电点为
*+$$
!
这与已报道的其它植物
67G
蛋白特征相似(%!#)
R=67G#
推导氨基酸序列中包含完整的醇脱氧酶的
典型保守结构域!包括
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个
4/
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#
个
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R=67G#
为含
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脱氢酶(0(:)&同时!
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R=67G#
属于典型的植物
67G
酶类()!&(0)聚类分
析结果表明
R=67G#
与水稻
T.67G*
亲缘关系较
近!同属于
6>=..
#
在其它植物中!
#
类
67G
编码
的酶不仅能与松柏醛*香豆醛*芥子醛等催化底物特
异结合!同样还能与脂肪醛*肉桂酰等物质结合生成
不同类型的木质素(*)这些结果均表明
!"#$%#
基因编码的确实为香蕉
#
类
67G
蛋白!可能在香蕉
木质素合成中起作用
在其他植物中!
67G
基因在根*茎*叶和花等组
织中均有表达(!&)本研究在根*球茎*假茎*叶*花和
果实中均检测到
R=67G#
表达!表明
R=67G#
在
香蕉组织中属于组成型表达!根据这一结果推出该
基因可能在香蕉的生长和发育过程中起着重要作
用在植物与病原菌互作时!木质素的含量*类型和
积累速度在不同植物与病原菌互作时存在差异(!0)
栓皮栎"
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#的
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在抗
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感病品种能积累更多的木质素!
67G
活性和木质素
的生物合及香蕉抗枯萎病能力成密切相关(!:)
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在感病品种+巴西蕉,"
E_+6=_M/F-.B
#中的
基因表达被抑制!而在耐病品种+农科
#
号,"
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#中被激活!
!"#$%#
基因表达与香蕉
抗病性正相关!说明该基因可能参与香蕉响应
QDE
28)
侵染的过程目前!香蕉抗病种质的创制是解
决香蕉枯萎病的有效方法之一!然而缺乏有效的抗
病种质的鉴定及筛选方法利用标记基因在苗期筛
选抗病苗能节约育种时间及效率
!"#$%#
在耐
病品种中表达趋势与感病品种相反且相对表达量的
倍数高于感病品种!因此该基因可以当作一个新的
抗枯萎病菌侵染的标记基因
本试验克隆了
!"#$%#
基因!并对其序列进行
生物信息学分析!对其组织和接种
QDE28)
的响应
研究说明该基因参与了香蕉的生长发育及抗病反
应今后将继续对该基因在香蕉抗枯萎中的作用机
制进行进一步的研究!以期能揭示
67G
在香蕉抗枯
萎病中的生理作用
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卓!等$香蕉肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达分析
参考文献!
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