全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(6): 626-630(2011)
收稿日期: 2011-03-17; 修回日期: 2011-09-22
通讯作者: 周宗山,副研究员,博士,主要从事果树真菌病害研究; Tel: 0429-3598268, E-mail: zszhou2000@hotmail. com。
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췍研究简报
欧李褐腐病病原菌鉴定
徐成楠, 周宗山*, 吴玉星, 迟福梅, 张红军
(中国农业科学院果树研究所, 兴城 125100)
Identification of the pathogen causing brown rot of Chinese Dwarf Cherry(Cerasus
humilis) 　 XU Cheng-nan, ZHOU Zong-shan, WU Yu-xing, CHI Fu-mei, ZHANG Hong-jun　 (Research
Institute of Pomology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Xingcheng 125100,China)
Abstract: One serious disease happened on the fruit of Chinese Dwarf Cherry in Liaoning Province recently.
The typical symptom was brown spot formed on the fruit surface. The spot spread quickly through the whole
fruits, then the fruits were rotten. There were tomentum round shaped mildew formed on the surface of sym-
ptomatic fruits. The pathogen was isolated from infected fruits. After pathogenicity tests in lab and field and
re-isolation, the isolate H1 was determined to be responsible for the disease. H1 colony on PDA was 70 - 75
mm in diameter, with concentric rings in grayish or light brown color after 7 days incubation at 22℃ with illu-
mination of 12 h near-UV / 12 h dark. The conidia were one-celled, hyaline, lemon-shaped, (10 -27) μm ×
(7 -17) μm on PDA, produced in branched monilioid chains. The rDNA ITS sequence of islolates H1 and
G1 had 100% similarity with those of Monilinia fructicola in GenBank. The amplification results with three
Monilinia specific primer pairs showed that only primer pair ITS1Mfcl and ITS4Mfcl could amplify a 356 bp
fragment. Based on the morphological characteristics and rDNA molecular analysis, the pathogen was finally
identified as M. fructicola.
Key words: Chinese Dwarf Cherry; Monilinia fructicola; morphological identification; ITS sequence analy-
sis; specific amplification
文章编号: 0412-0914(2011)06-0626-05
　 　 欧李[Cerasus humilis(Bge. ) Sok. ]为蔷薇科
樱桃属果树,别名钙果,原产中国,分布于我国的黑
龙江、辽宁、内蒙古、河北、山东、山西等省区。 多生
长在向阳山坡或沙丘边缘,资源相当丰富。 欧李株
高 0. 3 ~ 1. 5 m,多为 0. 5 ~ 0. 7 m 左右,是目前
世界上最矮小的木本果树。 果实可鲜食或加工,含
糖、蛋白质、维生素 C,特别是矿质元素铁和钙的含
量很高,每 100 果肉干分别含有 58 和 360 mg种仁
可作药用,中药称之为“郁李仁”可消毒化肿。 欧
李成花容易,根蘖更新能力强,抗逆性强[1]。 欧李
栽培上很少有病虫害发生,目前国内外尚无关于欧
李的病虫害报道。
随着欧李从自然生态环境的零散生长过度到
人工集约化连片栽培,病虫害的问题日益突出。 欧
李褐腐病是近年在辽宁省兴城市发生的一种严重
危害欧李果实的新病害,果实发病率高达 80%以
上,严重影响欧李的产量和品质。 目前对欧李褐腐
病的病原鉴定、病害发生流行规律及防治措施等均
未见报道,为病害的防治带来了较大的困难,该病
害已经成为制约当地欧李产业发展的一大障碍。
　
　 6 期 徐成楠,等:欧李褐腐病病原菌鉴定
为了明确该病的病原及提出有效防治方法,本文以
欧李果实为材料进行了病原菌的分离和鉴定工作,
并根据病原菌的形态特征,结合 rDNA-ITS 序列分
析等技术手段,对该病原菌进行了鉴定。
1　 材料与方法
1. 1　 病害症状观察和病原菌分离
田间观察病害特征并拍照,病果采自辽宁省兴
城市中国农业科学院果树研究所生产圃。 采用常
规组织分离法,从发病果实的病健交界处果皮及果
肉组织进行分离,共分离 30 个果实,120 个组织
块。 分离到的菌株经单孢分离纯化后在 PDA上进
行培养和形态观察,选取供试菌株 H1,并采集发病
果实表面菌丝(分生孢子堆)作为供试菌株 G1,将
纯化后的菌株转入冻存管中,4℃冰箱保存备用。
1. 2　 致病性测定
1. 2. 1　 室内离体欧李果实接种　 用无菌水配制成
浓度为 1 ×105 个 / mL的孢子悬浮液,用无菌的 20
mL医用注射器吸取悬浮液注射接种到经 70%酒
精表面消毒的健康欧李果实果肉中,无伤接种方法
为将孢子悬浮液滴在果实表面,设刺伤和无伤接种
2 个处理,每个处理重复 5 次,每次重复 20 个果
实。 以无菌水作对照,在 25℃保湿培养并每天观
察记录发病情况,并对接种后发病的果实进行病菌
再分离。
1. 2. 2　 田间接种 　 用无菌水配制成浓度为 1 ×
105 个 / mL 的孢子悬浮液,于 10 月初果实进入成
熟期时,选择发病较轻的植株随机选取健康欧李果
实进行孢子悬浮液接种,设刺伤和无伤接种 2 个处
理,每个处理 20 个果实,以无菌水作对照。 用塑料
袋包裹后喷雾保湿 72 h,然后定期观察发病情况,
并对接种后发病的果实进行病菌再分离。
1. 3　 病原菌形态学特征观察
将病原菌移接于 PDA 平板上,22℃暗培养 3
~ 4 d 后,用 4 mm 的打孔器在菌落边缘打孔取
样,将菌落转移至直径为 9 cm 的培养皿(含 12. 5
mL的 4% PDA培养基)中央,22℃下,12 h 光照 /
12 h黑暗培养,光照标准为 365. 5 nm近紫外灯光。
培养 3 d后开始每日测量菌落直径,记录菌落形态
特征,在光学显微镜下观察培养病原菌的分生孢子
和分生孢子梗形态,并测量其大小。 根据病原菌的
产孢特征及其在 PDA 培养基上的形态特征,参照
Lane[2]的方法进行病原菌鉴定。
1. 4　 病原菌核糖体 DNA-ITS序列的 PCR扩增与
分析
1. 4. 1　 基因组 DNA 的提取　 从培养基上直接刮
取菌丝放入 1. 5 mL灭菌离心管中,用研磨棒研磨
菌丝至粉末, 采用改良的 CTAB 法提取菌株
DNA。
1. 4. 2 　 PCR 扩增 　 采用真菌通用引物 ITS1 和
ITS4 进行 PCR 扩增。 25 μL PCR 反应体系包括
10 × PCR buffer 2. 5 μL, MgCl2 ( 25 mmol / L )
2. 5 μL,dNTP(10 mmol / L)0. 5 μL,模板 DNA 溶
液 1 μL,5 U / μL Taq酶 0. 2 μL,10 pmol / μL ITS1
和 ITS4 引物(由上海生工合成)各 0. 5 μL,超纯水
17. 3 μL。 反应程序为:94℃预变性 5 min;94℃变
性 40 s,52℃退火 40 s,72℃延伸 1 min,35 个循环;
最后 72℃延伸 10 min。 PCR产物送上海生工生物
工程技术服务有限公司测序。
1. 4. 3　 病原菌核糖体 DNA-ITS 序列同源性比较
对测得的供试菌株核糖体 DNA-ITS 区段的序列,
分别运用 GenBank 核酸数据库中的 BLAST 工具
软件,在 DNA 序列数据库中搜索同源 DNA 序列
并进行比较分析,根据 BLAST 搜索和比较的结
果,判断所获菌株的种类或其近缘的物种。
1. 5　 病原菌特异引物扩增
选用 Ioos等[3]针对 3 种褐腐菌 ITS 区段差异
设计的 3 对引物,对待测菌株 356 bp 特异性片段
进行 PCR扩增。 PCR 反应体系总体积 50 μL,反
应液为:10 × PCR buffer 5 μL,MgCl2(25 mmol / L)
5 μL,dNTP(10 mmol / L)2 μL,Taq 酶(5 U / μL)
0. 4 μL, (以上试剂均由上海生工提供),模板
DNA 2 μL,引物 (由上海生工合成)各 0. 5 μL
(20 μmol / L),超纯水 34. 6 μL。 反应条件:94℃
预变性 3 min;94℃变性 30 s,62. 5℃退火 30 s,
72℃延伸 1. 5 min, 30 个循环;最后 72℃ 延伸
10 min,4℃保存。 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶进
行电泳,检测特异性条带。
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植物病理学报 41 卷
2　 结果与分析
2. 1　 病害症状观察
病害发生初期果实表面上形成灰褐色圆形病
斑,随后病斑迅速蔓延扩展至全果,并使果肉变褐
软腐,病部表面产生散生的灰褐色绒球状霉层,最
后病果大部分或完全腐烂脱落,或干缩成僵果悬挂
枝条上经久不落(图 1-A、B)。
2. 2　 致病性测定　
室内离体接种结果表明,刺伤接种欧李果实在
接种 5 d 后开始发病,比无伤接种发病早 4 ~ 5 d,
病斑面积为(3. 0 ~ 10. 0) mm × (5. 0 ~ 12. 0) mm,
经室内接种的欧李在发病初期产生水渍状斑点,然
后逐渐扩展成圆形或椭圆形,绒状菌丝即病菌分生
孢子附着在果皮表面,比田间自然发病的菌丝生长
旺盛。 田间接种试验中,刺伤接种欧李果实在接种
6 d后开始发病,比无伤果实发病早 6 ~ 7 d,经刺
伤接种的果实平均发病率为 90% ,其症状与自然
发生相似,但是绒状的菌丝及病菌分生孢子更加旺
盛(图 1-C、D)。 在室内或田间接种试验中,对照
均不发病。 对接种发病后的病斑再分离,均能获得
与原分离菌株一致的病原菌。 根据柯赫氏法则,试
验中室内离体果实接种和田间接种的菌株 H1 均
为欧李褐腐病的致病菌。 根据菌株的培养形态特
征,初步确定该病原菌为美澳型褐腐病菌(Moni-
linia fructicola)。
2. 3　 病原菌的形态特征
菌株 H1 在 PDA上 22℃培养 7 d 的菌落直径
为 70 ~ 75 mm,菌落边缘比较整齐,具同心轮纹,基
内菌丝和气生菌丝中等发达、呈绒球状,菌落颜色
初期灰白,后期呈灰黄色或灰褐色、产孢量丰富、菌
落表面的分生孢子堆呈同心轮纹圆环,而且菌落生
长速度快,与 Lane[2]对美澳型核果褐腐菌 (M.
fructicola)的研究结论是一致的。 分生孢子梗二叉
状或不规则分枝,较长,无色,孢子链呈念珠状;顶
端串生分生孢子,分生孢子无色,单胞,柠檬形至椭
圆形,大小(10 ~ 27) μm × (7 ~ 17) μm(图 2-A、
B、C)在自然条件和人工培养基上均未发现有
性型。
Fig. 1　 Symptoms of Chinese Dwarf Cherry fruit brown rot
AB:Symptom in field; C:Symptom of inoculated fruit with strain H1 in lab; D:Symptom of inoculated with strain H1 in field.
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　 6 期 徐成楠,等:欧李褐腐病病原菌鉴定
Fig. 2　 Morphology of the pathogen causing brown rot on Chinese Dwarf Cherry fruit
A:Conidia 400 × ; B:Conidial chain 400 × ; C:Colony morphology.
2. 4　 rDNA ITS序列分析
经引物 ITS1 和 ITS4 对菌株 H1 和 G1 进行
PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测,各获得了 1 条
500 bp左右大小的清晰条带,经测序得到了长度
分别为 512 bp、510 bp 的片段,序列已在 GenBank
上登录 ( HQ893747、 HQ893748 )。 将该序列与
GenBank中已有的相关菌株的 ITS 序列进行同源
性比较,结果表明,菌株 H1 和 G1 序列与部分美澳
型核果褐腐菌 (M. fructicola ) 的同源性达到
100% ,与部分核果褐腐菌(M. laxa)的同源性达到
99% ,ITS序列分析结果支持 H1、G1 菌株为美澳
型褐腐菌(M. fructicola)。
2. 5　 特异性引物的扩增结果
经特异性引物 ITS1Mfcl 和 ITS4Mfcl 扩增,2
个供试菌株获得 356 bp 的 DNA 特异性片段
(图 3),而另外 2 对特异引物 ( ITS1Mlx and
ITS4Mlx、ITS1Mfgn and ITS4Mfgn)并未扩增出结
果。 此 3 对引物是 Ioos等[3]通过对 3 种褐腐病菌
ITS区段的差异设计的特异性引物,加上严格的
PCR退火温度能够阻止近似其他 2 种褐腐病菌的
扩增,据此,进一步证明了供试菌株 H1 和 G1 为美
澳型核果褐腐菌(M. fructicola)。
3　 讨论
危害核果类果树的链核盘菌主要有 3 个种:核
果链核盘菌[M. laxa(Aderh. et Ruhl. )Honey]、美
澳型核果链核盘菌[M. fructicola(Wint. )Honey]
和果生链核盘菌[M. fructigena(Aderh. et Ruhl. )
Fig. 3 　 PCR amplification pattern of Chinese
Dwarf Cherry fruit brown rot patho-
gen with 3 pairs of specific primers of
Monilinia spp.
M:Marker A; Lane 1-2:356 bp fragment amplified by prim-
ers ITS1Mfcl and ITS4Mfcl; Lane 3-4:No results amplified
by primers ITS1Mlx and ITS4Mlx; Lane5-6:No results am-
plified by primers ITS1Mfgn and ITS4Mfgn.
Honey],都可在开花期危害寄主,致花朵腐烂,结
果枝枯死,树枝形成溃疡。 美澳型核果链核盘
菌,2005 年在我国北京地区首次报道[4] ,该病原
菌是一种可危害多种水果的恶性真菌,在蔷薇科
果树尤其是核果类果树上发生最为严重,曾在北
美和澳大利亚的核果上引起巨大损失。 该病菌
可为害李子、桃、油桃、樱桃、杏、苹果、梨和葡萄
等多种市场占有率高、消费量大的水果,它既能
在果园中引起危害,又能危害储藏期果实,还可
在果实中潜伏侵染[5] 。 Monilinia 属真菌形态学
鉴定的主要依据是无性态的形态学特征、分生孢
子萌发特性、不同条件下的培养与生长特征等特
点,Lane[2]根据 3 个种Monilinia属真菌的菌落生
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植物病理学报 41 卷
长速度,菌落形态和颜色及产孢量等对褐腐病菌
进行研究,发现褐腐病菌 3 个种在培养性状上有
较大差异,其中美澳型核果褐腐菌表现为:菌落
颜色呈灰黄色、产孢量丰富、菌落表面的孢子堆
呈同心圆环,而且菌落生长速度快。 褐腐病菌通
常以无性世代存在,种间形态差异较小,仅仅依
据形态学研究方法很难进行鉴定。 本研究在田
间及室内培养均未发现褐腐病菌有性世代。
笔者根据所分离菌株 rDNA ITS 区段的研究,
结合 Ioos 等[3]根据褐腐病菌 3 个种 rDNA ITS 区
段差异设计的 3 对引物对它们进行鉴定,与 Zhang
等[6]对 M. fructicola 鉴定的结论一致。 本研究进
一步证明采用 Ioos等[3]提出的 62. 5℃的退火温度
可以准确对美澳型褐腐病菌进行特异性扩增。
美澳型核果褐腐病菌(M. fructicola)为世界
上的检疫性真菌,欧李作为该病原菌的新寄主是世
界范围内首次发现,笔者调查发现欧李果园中发病
后期的果实变得皱缩干瘪,成为僵果。 僵果是一团
被菌物菌丝完全穿透的干的果实组织,在地上或留
在枝条越冬,它们是来春最好的侵染源,僵果中的
分生孢子很容易脱落并随风雨传播,因此,彻底清
除越冬菌源,注意果园的卫生,及时喷施杀菌剂是
进行防治的必要措施。 对于欧李褐腐病的侵染、流
行以及防治措施亟待进一步深入研究。
欧李褐腐病是近年在辽宁兴城地区发生的一
种重要病害。 作者对该病害的发病症状进行了详
细调查,并利用病原菌形态学鉴定和分子生物学技
术相结合的手段首次在国内外对其病原进行了鉴
定,明确了其分类归属于美澳型核果褐腐菌(M.
fructicola),这些结果对进一步研究该病害的流行
及防治技术提供了科学依据。
参考文献
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责任编辑:曾晓葳
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