全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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#&上海市教委科研创新项目"
##23(#
#
作者简介$黄
!
骥"
#(--
#!男!博士!主要从事药用植物资源保护与持续利用方面的研究工作
4)56/7
$
8961
:.
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0819+;<9+=1
武陵山区蛇足石杉遗传多样性的
$%&
分析
黄
!
骥#!陈
!
浙!!李
!
菁%!商晗武!
"
#
上海师范大学 生命与环境科学学院!上海
!""!%$
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!
中国计量学院!浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室!杭州
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&
%
吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室!湖南吉首
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#
摘
!
要$采用
>?@A
分子标记对武陵山区蛇足石杉"
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#
$%&()$%%(*(
#
$
个居群进行遗传多样性的研究!结果表明$
"
#
#
,
对引物组合共扩增出条带
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条!其中
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条为多态性条带&在物种水平上!多态性条带百分率
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!有效等位基因数
-
;
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基因多样度指数
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多样性信息指数
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&在
居群水平上!
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!
-
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!
!B"+#*$
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E8611F1
多样性信息指数
.
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F
G
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&遗传多样性在居群间
有明显的差别!其中坪坝营"
AH2
#居群最高"
++,B&#+(*C
#!而铁峰山"
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#居群最低"
++,B-$+**C
#"
!
#居
群间的遗传分化较低!基于
D;/
(
0
基因多样性分析结果显示!居群间遗传分化系数
/
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E8611F1
(
0
居群分
化系数)"
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0
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F
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#%
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0
G
*为
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&
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分析显示!武陵山区蛇足石杉的遗传变异主要存在于居群内!居群
内的遗传变异分量为
-*+"*,
!占总变异的
,*+,,C
!而居群间的遗传变异分量为
!"+&"$
!占总变异的
!$+!%C
&居群
内存在极显著的遗传分化"
!
EI
B"+!$!
!
+
"
"+""#
#"
%
#由遗传分化系数"
/
EI
#估计!武陵山区蛇足石杉居群间的
基因流
-
5
B!+-$,
!表明蛇足石杉属于异交种"
$
#两两居群间的
D;/
(
0
遗传一致度"
.
D
#范围为
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"
"+(-($
&
L61O;7
检测结果显示!居群间的遗传距离与地理距离之间不存在显著的正相关关系"
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!
+B
"+&&,
#研究认为!遗传多样性与遗传结构主要决定于居群历史!较少干扰而稳定的居群偏向克隆生殖!遗传多样
性较低!而新建居群的遗传多样性则较高&克隆生长+生态位选择+异交!以及有效的孢子风媒传播等可能是其维持
较高遗传多样性水平的因素!而过度采挖等人类活动和生境片断化是导致蛇足石杉濒危的主要因素
关键词$武陵山区&蛇足石杉&
>?@A
&遗传多样性&遗传结构
中图分类号$
P%$-
Q
+*
&
P%$&
文献标志码$
>
()*)+#,-#.)/0#+
1
"212
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"
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VF10;ZY6O/F161!
U/08F9S1/Y;Z0/O
[
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G
7F/O6O/F161<86]/O6OXZ6
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5;1O6O/F1/1V8/16+J;600;00;G
6OO;Z1FXO8;
:
;1;O/=Y6Z/6O/F1W/O8/161<65F1
:
XF9Z
G
F
G
976O/F10FXO8/00
G
;=/;0/1J97/1
:
LF91O6/106Z;690/1
:
65
G
7/)
X/;:
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F7
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G
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G
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-
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G
976O/F1
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F
G
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G
976O/F10/17;Y;70FX
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976O/F161"
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G
976O/F1+
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F
G
976O/F10W60<;O;=O;<]60;(
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G
976O/F10
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G
976O/F1
G
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:
1/X/=61O
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;F
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G
8/=67"
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:
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G
8/=67
[
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G
F
G
976O/F1
:
;1;O/=[
61<
:
;1;O/=0OZ9=O9Z;6Z;
56/17
[
<;O;Z5/1;<]
[G
F
G
976O/F18/0OFZ
[
+I8;7;Y;7FXO8;
:
;1;O/=[
/1O8;7;00G
F
G
976O/F10W8/=86Z;[
=7F167Z;
G
ZF<9=O/F1/07FW;ZO861O8F0;FX1;W
[
F91
:G
F
G
976O/F10
W8/=86Z;]9/7O]
[
0;`967Z;
G
ZF<9=O/F1+>195];ZFXX6=OFZ0O86O5/
:
8O6XX;=OO8;
:
;1;O/=
G
ZFX/7;0FX!0)$%1
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:
ZFWO8
!
0;7;=O/Y;;XX;=OFX1/=8;61:
!
60W;760O8;;XX;=O/Y;W/1<)G
;Z067
FX0
G
FZ;0+
=)
1
>"/!0
$
J97/1
:
LF91O6/106Z;6
&
!"
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&
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&
:
;1;O/=[
&
:
;1;O/=0OZ9=O9Z;
!!
蛇足石杉"
!"
#
$%&()$%%(*(
#为孢子同型的多
年生石松类植物!是石杉科"
R9
G
;Z^/6=;6;
#石杉属
"
!"
#
$%&(
#中蛇足石杉组"
E;=O+2$%%(*($
#的模式
植物!是一个以
!
"
$
回等长二叉分歧+叶缘不皱曲
并具粗齿为主要特征的自然类群!广布于东亚+东南
亚+太平洋地区+俄罗斯+大洋洲和中美洲在中国
主要分布于长江以南海拔
%""
"
!,""5
+年均降水
量超过
#"""55
的亚热带常绿阔叶林区!具有多
个种下变异类型)#)!*其全草为提取治疗早老性痴
呆特效药物石杉碱甲的主要来源)%*资源研究显
示)$*!蛇足石杉多散生分布于各类群落中的相似生
境!因而具有较严苛的,小生境-选择特性!由于生活
史过程复杂而漫长!居群自然更新非常缓慢!一经破
坏便很难恢复经近
!"
年的地毯式采收!居群及其
生态过程遭到严重破坏!资源量越来越少!残存居群
仅剩少量低龄幼苗!较为完好的居群多分布于自然
保护区或国家公园!其生存状况已十分严峻而目
前对蛇足石杉除在分类学+资源调查和植物化学等
方面有过较多的研究报道外)!!$)-*!其它学科的研究
尤其是种内遗传多样性和居群遗传结构等保护生物
学的相关研究尚未见报道
横亘于湘鄂渝黔四省市交界地区的武陵山"
!,b
!&c
"
%"b"*cD
+
#",b"!c
"
###b%%c4
#是一个较为完整
的地理单元!为,华中植物区系-核心的川东鄂西中
心的主体!其区系起源古老+成分复杂+来源多歧+地
理过渡明显!是许多古老植物种+属的第四纪冰期避
难所!保留着大量的中国特有种+属),)&*由于其气
候和植被类型基本涵盖了中国蛇足石杉分布区多样
化的生态条件!是该种分布相对集中+种下变异类型
较多的地区!也是目前资源遭到严重破坏的地区之
一因此!本实验采用普遍适用于濒危植物遗传多
样性研究的
>?@A
分子标记技术)()##*对武陵山区
$
个具有典型群落代表意义的蛇足石杉居群的遗传多
样性进行了研究!并结合实地调查及以往的研究积
累!提出了蛇足石杉的具体保护措施!以期为有效地
保护和持续利用实践提供基础资料和依据
#
!
材料和方法
?+?
!
材
!
料
!"##
年
(
月!选择
$
个具有武陵山区典型群落
代表意义的居群进行采样"表
#
!图
#
#!其中!红石林
"
RE@
#居群分布于次生的华千金榆杂木林"
3(%
#
1
4")56%7(*(Y6Z+584$4))
#内!持续的采挖活动导致
居群个体数量不足
-"
株!且全为
!
龄级以下幼株&
图
#
!
武陵山区蛇足石杉采样居群位置
居群代号同表
#
?/
:
+#
!
T;F
:
Z6
G
8/=7F=6O/F1FXO8;065
G
7;<
G
F
G
976O/F10
FX!0)$%%(*(/1J97/1
:
L6/1O6/1F906Z;6
I8;
G
F
G
976O/F1=F<;06Z;O8;065;60/1I6]7;#
$&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
坪坝营"
AH2
#居群处于人工杉木林采伐后的一片迹
地!全为无分叉的
#
龄幼苗构成!个体数量超过
#""
株!由于未发现成年个体!推测该居群可能源于孢子
的萌发&扇子坪居群"
E3A
#位于重庆石柱黄水国家
森林公园内!伴生于原生的亮叶水青冈"
9(
:
");"1
57(
#群落内!有多达
%*"
株各龄级个体&铁峰山
"
I?E
#居群则分布于重庆万州铁峰山国有林场人工
柳杉林"
3%
<#
*6=$%(
>
6%*"4$
#下较阴湿+种间竞争
较少的台地上!各龄级个体数量更是达到近
-""
株
以上
!
个居群由于受到较好的保护!人为扰动较少!
个体数量较多且年龄结构合理!居群中甚至有超过
#"
个二叉分枝的丛生个体
采样时各居群样株间距大于
*5
!以避免采集
到亲缘关系较近的个体采集的新鲜幼嫩叶片立即
放入装有硅胶的自封袋中!带回实验室置于
,"d
冰箱中保存备用
?+@
!
方
!
法
?A@A?
!
基因组
-B$
提取和检测
!
取
"+*
:
干燥嫩
叶!用改良的
VI>H
法)#!*提取基因组
eD>
!
"+&C
的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度+完整性和产量!用紫
外分光光度计"
E
G
;aF7)#%""
#测定其浓度!用
"+#f
I4
稀释至
!"1
:
%
#
@
!保存于
!"d
冰箱备用
?A@A@
!
$%&
分析
!
>?@A
分析参照
NF0
等)(*的
方法!仅对体系进行了部分优化采用
?56_
$
%
@)$
$
"
H/F76]
#酶切组合进行限制性酶切&预扩增反
应采用不带任何选择性碱基的引物组合
4""
%
L""
!
利用红石林居群
!
组
eD>
样品"
RE@#
+
RE@!
#从
%-
对
4Q%
%
LQ%
引物组合中筛选出扩增图谱清晰
的
,
对进行选择性扩增反应"表
!
#预扩增和选择
性扩增的
AV_
反应均在
T;1;>5
G
AV_E
[
0O;5
(-""
"
A;Za/1475;Z+SE>
#上进行所用接头与引
物均由上海生工合成!
I
$
eD>
连接酶+
和
表
?
!
用于
$%&
分析的
C
个蛇足石杉天然居群
I6]7;#
!
AF
G
976O/F10FX!0)$%%(*$XFZ>?@A6167
[
0;0
居群代号
AF
G
976O/F1
=F<;
地点
@F=6O/F1
居群大小
AF
G
976O/F1
0/^;
采样数
E65
G
7;
0/^;
海拔
>7O/O9<;
%
5
经纬度
@F1
:
/O9<;
76O/O9<;
群落类型和生境
VF5591/O
[
O
[G
;g86]/O6O
红石林
RE@
湖南 古 丈 红 石 林
_;!
T9^861
:
VF91O
[
!
R9161
*"
"
," !- &!"
"
(!"
##"b"!c4
!&b$-cD
华千金榆次生杂木林&林缘+岩石及灌丛下阴湿处
E;=F1<6Z
[
XFZ;0O
"
3(%
#
4")56%7(*(Y6Z+584$4))
#&
E86<;61<5F/0O
G
76=;091<;ZZF=a0FZ08Z9]0
坪坝营
AH2
湖北咸丰坪坝营
A/1
:
]6
[
/1
:
!
h/61X;1
:
VF91O
[
!
R9];/
#""
"
#!" !% &*"
"
(*"
#"(b",c4
!(b*!cD
杉木人工林!采伐后的迹地
>ZO/X/=/67XFZ;0O
"
3"41
44
:
8(=(;(45$6;(*(
#!
6=9OO/1
:
]761aFXO8;
G
761)
O;扇子坪
E3A
重庆石柱黄水国家森林公园
R961
:
)
089/D6O/F167A6Za
!
E8/^89 VF91O
[
!
V8F1
:i
/1
:
%""
"
%*" !- #*""
"
#**"
#"&b!$c4
%"b"$cD
亮叶水青冈原生林!小溪边+岩石及灌丛下阴湿处
AZ/56Z
[
XFZ;0O
"
9(
:
");"57(
#!
67F1
:
O8;
i
9;]Z6<6
!
F1086<;61<5F/0O
G
76=;091<;ZZF=a0FZ08Z9]0
铁峰山
I?E
重庆 万 州 铁 峰 山 林 场
I/;X;1
:
0861
0O6O;XFZ;0O
!
J61^8F9V/O
[
!
V8F1
:i
/1
:
*""
"
-"" !* #"*"
"
##""
#"&b"&c4
%"b$&cD
柳杉人工林!林下台地
>ZO/X/=/67XFZ;0O
"
3%
<#
*6=$1
%(
>
6%*"4$
#!
O6]7;761<91<;ZWFF<0
表
@
!
$%&
接头和引物序列
I6]7;!
!
I8;0;
i
9;1=;FX6<6
G
O;Z061<
G
Z/5;Z0/1O8;
G
Z;0;1O>?@A;`
G
;Z/5;1O
eD>
接头和引物
><6
G
O;Z61<
G
Z/5;Z
引物编号
AZ/5;Z=F<;
核苷酸序列
E;
i
9;1=;FXO8;19=7;FO/<;6=/<
?56_
$
接头
?56_
$
6<6
G
O;Z
*c)VIVTI>T>VITVTI>VV)%c
%c)V>IVIT>VTV>ITTII>>)*c
@)$
$
接头
@)$
$
6<6
G
O;Z
*c)T>VT>IT>TIVVIT>T)%c
%c)I>VIV>TT>VIV>I)*c
预扩增引物
AZ/5;Z/1
G
Z;)65
G
7/X/=6O/F1
?56_
$
4)"" *c)T>VITVTI>VV>>IIV)%c
@)$
$
L)"" *c)T>IT>TIVVIT>TI>>)%c
选择性扩增引物
AZ/5;Z/10;7;=O/Y;
65
G
7/X/=6O/F1
?56_
$
Q%)V>> 4)V>> *c)T>VITVTI>VV>>IIVV>>)%c
?56_
$
Q%)>>I 4)>>I *c)T>VITVTI>VV>>IIV>>I)%c
?56_
$
Q%)T>> 4)T>> *c)T>VITVTI>VV>>IIVT>>)%c
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$
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$
Q%)>TI L)>TI *c)T>IT>TIVVIT>TI>>>TI)%c
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$
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$
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*&
#
期
!!!!!!!!!!!!!
黄
!
骥!等$武陵山区蛇足石杉遗传多样性的
>?@A
分析
A(
B
酶均购自宝生物工程"大连#有限公司
由于
?56_
$
%
@)$
$
限制性内切酶的活性温度
不同!酶切和连接采用二步法进行第一步"
@)$
$
酶切#$在
"+*5@
离心管中加入
$+"
#
@
模板
eD>
!
+"
#
@#"fH9XX;Z
!
"+*
#
@@)$
$
"
#"S
%
#
@
#!用
<!
M
补足至
!"
#
@
!
-*d
水浴
$8
&第二
步"
?56_
$
酶切与连接同步#$
!+"
#
@#"fI
$
H9XX)
;Z
!
"+*
#
@?56_
$
"
#" S
%
#
@
#!
4)6<6
G
O;Z
"
!"
#
5F7
%
@
#和
L)6<6
G
O;Z
"
!"
#
5F7
%
@
#各
#+"
#
@
!
"+*
#
@I
$
eD>7/
:
60;
"
*S
%
#
@
#!用
<!
M
补足至
#"
#
@
后再加入上述
@)$
$
酶切产物中!
%,d
水浴保
温
&8
以上
预扩增体系$
!+"
#
@#"fH9XX;Z
!
#+-
#
@
"
!+*55F7
%
@
#!
"+!
#
@A(
B
酶"
*S
%
#
@
#!
!"
#
5F7
%
@
的
4""
和
L""
引物各
#+"
#
@
!
eD>
酶
切连接产物
$+"
#
@
!用
<!
M
补足至
!"
#
@
预扩
增程序$
(*d*5/1
&
(*d%"0
!
*-d$*0
!
,!d#
5/1
!
%"
个循环&最后
,!d#"5/1
!预扩增产物稀释
!"
倍后用于选择性扩增
选择性扩增体系$
!+"
#
@#"fH9XX;Z
!
#+-
#
@
"
!+*55F7
%
@
#!
!"
#
5F7
%
@
的
4)
G
Z/5;Z
和
L)
G
Z/5;Z
各
#+"
#
@
!
"+!
#
@A(
B
酶"
*S
%
#
@
#!
$+"
#
@
预扩增产物!用
<!
M
补足至
!"
#
@
选择性
扩增程序$
(*d*5/1
&
(*d%"0
!
-*d$*0
!
,!d
#5/1
循环
#
次!以后每个循环
#
次退火温度降低
"+,d
!执行
#%
个循环&在
(*d%"0
!
*-d$*0
!
,!
d#5/1
下再执行
!"
个循环后!
,!d#"5/1
!终止
反应选择性
AV_
产物与双指示剂变性液"
(&C
去
离子甲酰胺!
#"55F7
%
@4eI>
"
G
R&+"
#!
"+#C
二
甲苯氰和溴酚蓝#按
!+*j#
的比例混合!于
(*d
进
行变性
*5/1
后立即放置于冰水混合物中取
-
#
@
热变性后的混合液上样!在
-C
变性聚丙烯酰胺
凝胶中
("J
恒功率电泳约
("5/1
电泳结束后采
用银染检测法进行
>?@A
指纹显色)#%*
?+@+D
!
数据统计分析
!
采用人工计带法判读电泳
图谱中扩增产物和分子量相同迁移位置上条带有
无分别计为
#
和
"
!构成
"
%
#
矩阵利用
AMA)
T4D4#+%#
软件计算以下遗传多样性参数$多态条
带百分率"
++,
#+观测等位基因数"
-
F
#+有效等位
基因数"
-
;
#+
D;/
(
0
基因多样度"
!
#+
E8611F1
多样
性信息指数"
.
!在物种水平上为
.
0
G
!在居群水平上
为
.
G
F
G
#+居群间遗传分化系数"
/
EI
#+基因流"
-
5
#+
成对居群间的
D;/
(
0
遗传距离"
C
#和遗传一致度
"
.
D
#!并据此用
SATL>
方法进行聚类!分析各居
群之间的遗传关系运用
JKD>LMN>#+**
软件
对居群内和居群间的遗传变异进行分子变异分析
"
>LMN>
#!得出居群间遗传分化系数 "
%
EI
#!
JKD>LMN>#+**
软件分析的显著性检验采用
#"""
次置换
AMAT4D4#+%#
软件和
JKD>LM)
N>#+**
软件的输入文件由
eV?>#+#
软件)#$*制
作采用
DIE2E
G
=!+##X
软件计算个体间的
D;/
g@/
相似性系数)#**!进行个体的
SATL>
聚类分
析用
DIE2E
G
=!+##X
软件的
L61O;7
检验居群间
遗传距离与地理距离的相关性
!
!
结果与分析
@A?
!
物种和居群水平的
$%&
遗传多样性
用
,
对引物组合对蛇足石杉
$
个居群的
#""
个
个体进行扩增!所得片段长度在
("
"
*%"]
G
之间
共得到
-#*
条清晰的条带!其中
*$(
条为多态性条
带在物种水平上!多态条带百分率为
&(+!,C
!
E8611F1
多样性信息指数
.
0
G
B"+!(&k"+#($
!
D;/
(
0
基因多样度
!B"+#,&k"+#%&
!观察等位基
因数
-
F
B#+&(%k"+%#"
!有效等位基因数
-
;
B#+!*,
k"+!$(
"表
%
#!表明蛇足石杉在物种水平上具有较
高的遗传多样性
由表
%
可知!各居群多态条带百分率变化范围
在
-$+**C
"
&#+(*C
之间!平均为
,#+$!C
!高低顺
序依次为坪坝营
#
红石林
#
扇子坪
#
铁峰山!其中
坪坝营居群最高!扇子坪居群"
++,B-*+*%C
#与
最低的铁峰山居群几乎相同各居群的
E8611F1
多样性信息指数"
.
G
F
G
B"+!"(
"
"+%#*
#+
D;/
(
0
基因
多样度"
!B"+#!*
"
"+#(,
#+观察等位基因数"
-
F
B#+-$-
"
#+&#(
#和有效等位基因数"
-
;
B#+#&$
"
#+%"-
#等遗传多样性参数的变化趋势均与多态条带
百分率的高低顺序一致
@+@
!
居群遗传结构
AMAT4D4
分析结果表明!武陵山区蛇足石杉
$
个居群间的遗传分化系数"
/
EI
#为
"+#*(
!即有
#*+(C
的遗传变异存在于居群间!
&$+#C
的遗传变
异存在于居群内!居群内的遗传分化大于居群间的
分化居群间基因流)
-
5
B"+*
"
#/
EI
#%
/
EI
*为
!+-$,
!表明居群间存在较大强度的基因交流根据
E8611F1
(
0
多样性信息指数的分析结果"表
%
#!计
算出
E8611F1
(
0
居群分化系数)"
.
0
G
.
G
F
G
#%
.
0
G
*
B
"+#*&
!即有
#*+&C
的遗传变异分布在居群间!
&$+!C
的遗传变异分布在居群内部!此结果与
AMAT4D4
的分析结果几乎一致
-&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
D
!
武陵山区蛇足石杉
C
个居群的遗传多样性水平
I6]7;%
!
T;1;O/=Y6Z/6O/F1FXO8;XF9Z
G
F
G
976O/F10FX!0)$%%(*(/1J97/1
:
5F91O6/1F906Z;6
居群
AF
G
976O/F1
样本数
E65
G
7;0/^;
多态条带数
DF+FX
G
F7
[
5FZ
G
8/=]61<
++,
%
C -
F
-
;
! .
红石林
RE@ !- $*% ,%+-- #+,%,k"+$$# #+!%%k"+!(% "+#*!k"+#*( "+!$(k"+!!-
坪坝营
AH2 !% *"$ &#+(* #+&#(k"+%&* #+%"-k"+%", "+#(,k"+#-$ "+%#*k"+!!(
扇子坪
E3A !- $"% -*+*% #+-**k"+$,- #+!#&k"+!&$ "+#$!k"+#*( "+!%%k"+!%"
铁峰山
I?E !* %(, -$+** #+-$-k"+$,( #+#&$k"+!*& "+#!*k"+#$* "+!"(k"+!#%
平均
>Y;Z6
:
; !* $%( ,#+$! #+,#$k"+$$* #+!%*k"+!&* "+#*$k"+#*, "+!*#k"+!!*
物种
E
G
;=/;0 #"" *$( &(+!, #+&(%k"+%#" #+!*,k"+!$( "+#,&k"+#%& "+!(&k"+#($
!!
注$居群代号同表
#
!下图+表等同&
++,+
多态条带百分率&
-
F
+
观察等位基因数&
-
;
+
有效等位基因数&
!+D;/
(
0
基因多样度&
.+E8611F1
信息多样性指数
DFO;
$
AF
G
976O/F1=F<;06Z;
:
/Y;1/1I6]7;#
!
O8;X/
:
9Z;061i
9/Y67;1O
&
++,+A;Z=;1O6
:
;FX
G
F7
[
5FZ
G
8/=]61<0
&
-
F
+M]0;ZY;<195];ZFX67;7;0
&
-
;
+4XX;=O/Y;195];ZFX67;7;0
&
!+D;/
(
0
:
;1;[
&
.+E8611F1
(
0/1XFZ56O/F1/1<;` +
表
C
!
蛇足石杉的
$;EF$
分析
I6]7;$
!
>167
[
0/0FX5F7;=976ZY6Z/61=;
"
>LMN>
#
XFZ!0)$%%(*(]60;?@A<6O6
变异来源
EF9Z=;FX
Y6Z/6O/F1
自由度
7
>
总方差
E95FX
0
i
96Z;0
平均方差
L;61
0
i
96Z;0
变异组分
N6Z/61=;
=F5
G
F1;1O0
变异百分率
A;Z=;1O6
:
;FX
Y6Z/6O/F1
%
C
+
$
!
EI
居群间
>5F1
:G
F
G
976O/F10 % #,*$+#(( *&$+,%% !"+&"$ !$+!%
"
"+""# "+!$!
居群内
J/O8/1
G
F
G
976O/F1 (- -!$*+*## -*+"*, -*+"*, ,*+,,
"
"+""#
总计
IFO67 (( ,(((+,#""
!!
注$
$
+
值表示比观察值变异大的概率!这个概率是通过把居群中的样本经过
#"""
次随机排列改变计算得到的&
!
EI
+
居群间遗传分化系数
DFO;
$
$
+)Y679;06Z;O8;
G
ZF]6]/7/O/;0FX86Y/1
:
65FZ;;`OZ;5;Y6Z/61=;=F5
G
F1;1OO861O8;F]0;ZY;[
#"""Z61)
G
;Z59O6O/F10FX/1G
F
G
976O/F10
&
!
EI
+I8;=F;XX/=/;1OFX
:
;1;O/=:G
F
G
976O/F10+
!!
>LMN>
分析结果"表
$
#也显示蛇足石杉的遗
传变异主要存在于居群内!占总变异的
,*+,,C
"
7
>
B(-
!
+
"
"+""#
#!只有
!$+!%C
的变异存在于居群
间"
7
>
B%
!
+
"
"+""#
#!居群内和居群间的遗传分化
均达到极显著水平!
>LMN>
估算的居群间遗传分
化系数
!
EI
B"+!$!
"
+
"
"+""#
#
@+D
!
居群间遗传距离和遗传一致度
由
AMAT4D4
计算出成对居群间的
D;/
(
0
遗
传距离"
C
#在
"+"%#"
"
"+",$&
之间!遗传一致度"
.
D
#
的范围为
"+(!,(
"
"+(-($
!其中!红石林和坪坝营
居群间的遗传一致度最高"
.
D
B"+(-($
#!遗传
距离最近"
CB"+"%#"
#!扇子坪与铁峰山居群间的
遗传一致度最低"
.
D
B"+(!,(
#!遗传距离最远"
C
B"+",$&
#"表
*
#根据
D;/
(
0
遗传距离进行的
SATL>
聚类分析显示"图
!
#!在遗传距离
"+"$"
附近明显分为
%
组$红石林和坪坝营居群聚为一组&
扇子坪和铁峰山居群各自单独聚为一组经
L61)
O;7
检验!居群间地理距离与遗传距离之间不存在显
著的正相关关系"
%B"+!-(
!
+B"+&&,
#
@+C
!
个体的聚类分析
$
个居群
#""
个个体进行
D;/g @/
相似性系
数的
SATL>
聚类分析结果显示"图
%
#!
RE@#"
与
RE@##
的相似性最高!为
"+(!&#
在相似性系数
表
G
!
蛇足石杉
C
个种群间的
B)#
(
0
遗传一致度
"对角线上方#与遗传距离"对角线下方#
I6]7;*
!
D;/
(
0
:
;1;O/=/<;1O/O
[
"
6]FY;:
F167
#
61<
:
;1;O/="
];7FW:
F167
#
65F1
:
!0)$%%(*(
G
F
G
976O/F10
居群
AF
G
976O/F1
红石林
RE@
坪坝营
AH2
扇子坪
E3A
铁峰山
I?E
红石林
RE@ "+(-($ "+(-"( "+(%("
坪坝营
AH2 "+"%#" "+(-*, "+(-,!
扇子坪
E3A "+"%(( "+"%$( "+(!,(
铁峰山
I?E "+"-%" "+"%%$ "+",$&
图
!
!
蛇足石杉居群间
D;/
(
0
遗传距离的
SATL>
聚类图
?/
:
+!
!
SATL><;1:
Z65FX!0)$%%(*(
G
F
G
976O/F10]60;(
0
:
;1;O/="+-
的附近大致可分为
%
组$坪坝营居群
&
个个体
与铁峰山居群全部个体聚为
$
组&坪坝营居群
#*
个
个体与扇子坪居群
!$
个个体聚为
&
组&扇子坪居群
,&
#
期
!!!!!!!!!!!!!
黄
!
骥!等$武陵山区蛇足石杉遗传多样性的
>?@A
分析
图
%
!
蛇足石杉各居群个体相似性系数的
SATL>
聚类分析
?/
:
+%
!
SATL><;1:
Z65FX!0)$%%(*(]60;[
=F;XX/=/;1O
!
个个体与红石林居群全部个体聚为

组结果显
示!
%
组内居群间的个体都有交迭现象!
#""
株个体
并没有完全按各自的居群聚类
&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
%!
讨
!
论
D+?
!
遗传多样性
人类活动所导致的生境片断化甚至丧失!可能
使原来广泛连续分布+并具有较高水平遗传多样性
的大居群片断化为地理隔离+范围狭小的各个小居
群!居群内个体数量减少!尤其是成年个体数量的减
少可能造成基因流水平下降!加剧居群内的近交和
遗传漂变!从而导致部分遗传多样性丧失)#-*!使这
些居群具有较高的灭绝风险)#,*因此!一般认为特
有种+濒危种和狭域种的遗传多样性水平较低)#&)!"*
虽然近年来高强度的采挖和生境片断化致使蛇
足石杉居群规模变小!野外已很少有成片分布的居
群!现存居群多为相互隔离并以幼龄个体为主构成
的小居群!但却具有较高水平的遗传多样性蛇足
石杉的遗传多样性不仅远高于已报道的拟蕨类其它
濒危物种!如中华水韭"
.)6$*$))4$4))
#
_>Ae
标记
的
$
个居群
++,
为
"+&#C
"
#!+("C
!物种水平
++,
为
*&+-C
)
!#
*
!
>?@A
标记的
,
个居群
++,
为
!*+!C
"
*%+&C
!物种水平
++,
为
-#+-C
)
##
*
&高
寒水韭"
.)6$*$)8
<#
)6
#
8;(
#
-
个居群
_>Ae
标记的
++,
为
,+-(C
"
!#+(-C
!物种水平
++,
为
*"+"C
)
!!
*
!
KEE_
标记的
++,
为
&C
"
%*C
!物种水
平
++,
为
&!C
)
!%
*
!而且也高于耳蕨属植物
+6;
<
)1
*58"=6*6=()"
)
!$
*
+观音座莲属植物
D4
:
6
#
*$%)
58(";6764*(
)
!*
*
+粗 梗 水 蕨 "
3$%(*6
#
*$%)
#
*$%1
767$)
#
)
!-
*和水蕨"
3$%(*6
#
*$%)*8(;5*%67$)
#
)
!,
*等
真蕨类物种
遗传多样性水平在一定程度上反映了物种的繁
育系统和交配方式)!&*虽然对蛇足石杉繁育系统
的研究尚未见报道!但结合前人的研究成果!可推测
其维持较高遗传多样性的繁育系统类型和可能的交
配方式
EF7O/0
等)!(*认为!同孢型蕨类藉独立生活的配
子体完成受精作用的方式可以有以下
%
种$"
#
#严格
意义上的自交"内配子体交配#)%"*!即受精作用发生
在由同一配子体产生的精子与卵细胞间&"
!
#自交!
即由同一孢子体上不同孢子形成的配子体分别产生
的精子和卵细胞结合&"
%
#异交!即由不同孢子体产
生的孢子形成的配子体上发育的精子和卵细胞之间
的受精作用)%#)%!*!此外!蛇足石杉还可利用芽胞进行
无性繁殖)%%*早期的研究认为同孢型蕨类以自交
为主)%$*!而近期的等位酶研究则揭示了该类群植物
具有从严格自交到异交的多样化生殖方式)%**但
对石松类而言!上述
!
种方式的自交极其罕见)%-*!
因此!异交可能是蛇足石杉主要的繁殖方式
某些石松类植物的孢子在人工条件下的萌发非
常困难!极少数萌发形成的配子体在培养基上也不
能正常发育)%,)%(*!可能由于这个原因!目前对蛇足石
杉和多数石松类植物有性过程的认识仍是空白然
而!有研究显示!适当扰动的生境有利于石松类植物
孢子萌发和完成配子体"有性#世代生活史)%-*!但无
性繁殖同时也对居群的扩展及其遗传多样性具有强
烈的塑造作用)$"*例如!在郁闭山毛榉和云杉林
"
=7F0;<];;=861<0
G
Z9=;XFZ;0O0
#下几无扰动的生
境中!多穗石松"
E
<
56
#
67"=(446*4"=
#居群完全
凭藉水平生长的根状茎进行无性繁殖)$#*!因此!居
群中几乎检测不到扩增位点)$"*本研究表明!位于
黄水国家公园内的扇子坪居群!由于受到较好的保
护!生境受扰动较少!其遗传多样性水平在
$
个研究
居群中最低!同样受到生境保护的铁峰山居群与其
类似!说明遗传多样性水平的降低可能由芽胞或分
株等无性繁殖所导致&而代表极端扰动生境的坪坝
营居群"采伐迹地#全部由未分叉的幼苗构成!这些
幼年个体可能完全来源于孢子的萌发!因而表现出
最高的遗传多样性水平
综上所述!蛇足石杉较高水平的遗传多样性!一
方面可能是遗传变异长期积累的结果!由于石松类
物种形成可上溯至晚志留纪到早泥盆纪!到石炭纪
发展到顶峰!广布全球)$!*!因此!蛇足石杉拥有一个
广泛连续分布且具丰富遗传基础的祖先!在经历多
次地史变迁后!绝大多数石松植物灭绝了!而该种不
仅存留至今而且依然广布!说明在其漫长的演化历
史上以异交为主的有性生殖带来的基因重组+突变
和祖先遗存的较高遗传多样性等因素的叠加累积效
应致使其在物种水平上保持着较高的遗传多样性&
另一方面!虽然近期的过度采挖和生境破坏使居群
内个体数目大大减少!从而片断化为不连续分布的
小居群!然而!与有花植物在相似条件下由于,小居
群遗传衰退-效应导致的遗传多样性下降不同!由于
其有性过程主要发生在配子体世代!成熟孢子体散
发的难以计数的孢子和庞大的地下孢子库却能在适
宜的条件下萌发成配子体!来自不同配子体的两性
配子完成受精继而发育为幼孢子体!因此!各居群仍
能保持较高水平的遗传多样性
D+@
!
居群遗传结构
物种的遗传多样性及其分布格局与影响基因交
流的生活史性状有关!例如繁育系统和分布范围等!
(&
#
期
!!!!!!!!!!!!!
黄
!
骥!等$武陵山区蛇足石杉遗传多样性的
>?@A
分析
其中!由于繁育系统控制着群体内和群体间遗传多
样性的分配!是决定植物居群遗传结构最主要的因
素)#&*
H900;7
)
$%
*对
%*
个物种的
_>Ae
数据进行
总结后发现!其中
!(
个远交物种居群间的变异占总
遗传变异的
"+(C
"
$#+%C
!而
-
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次印证了
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和
EF7O/0
)
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*对石松类植物繁育系
统的总结和上述根据居群遗传多样性水平推断的
结论
植物基因流的大小在很大程度上取决于繁殖体
的移动方式!风媒传粉植物的基因流大于动物传粉
和自花授粉植物)$-*石松类植物每株成熟孢子体
能产生数以千万计的孢子!这些轻若尘埃的孢子可
以藉风传播很远的距离孢子的风媒传播大大增强
了各居群间的基因交流!这种由风媒孢子产生的高
强度基因流对于蕨类植物居群 ,均质化-的作用远
远超过大多数风媒种子植物)%**
越来越多的证据证明!基因流强弱对群体的遗
传分化具有重要影响)$,*!如果说自然选择是导致居
群分化最主要的力量!那么基因流则是对抗自然选
择的重要因素)$&*
E76Oa/1
)
$(
*认为!当基因流小于
#
时!就不足以抵制居群内因遗传漂变而引起的居群
间遗传分化个体
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聚类结果显示!
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分析蛇足石杉居群间基因流
-
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为
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于遗传漂变而引起的居群间遗传分化
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等)#&*认为!居群的地理分布和遗传
多样性分布没有直接的相关性经
L61O;7
检验!本
研究表明蛇足石杉的遗传距离和地理距离间同样没
有显著的相关性"
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!
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#从居群位
置和
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居群聚类可看出!扇子坪与铁峰山居
群之间地理距离最近!但遗传距离反而最远!因此!
居群间地理距离与遗传距离并无显著的相关性!地
理隔离对蛇足石杉居群遗传分化没有显著影响
D+D
!
致危因素和保护措施
以上研究结果表明!蛇足石杉目前的濒危现状
并非由于其遗传多样性丧失造成的根据近
*
年对
蛇足石杉资源及收购情况的实地跟踪调查!由于毁
林修路+开荒+伐木等人类活动造成生境破坏和片断
化!以及对野生植株地毯式的采挖!致使居群自然更
新过程受阻!这些可能是造成蛇足石杉濒危的主要
原因加之蕨类植物在群落中的竞争力较弱+生活
史过程复杂而且漫长!一经破坏便很难恢复)*")*#*等
自身生物学特性!如不采取有效的保护措施!极有可
能使其濒危程度进一步加剧
参考其它濒危物种保护遗传学的研 究成
果)$$!*!*!结合蛇足石杉的分布+生物学特性和生存
现状!我们提出以下保护建议$"
#
#针对蛇足石杉遗
传多样性水平较高!但居群和个体数量都在急剧下
降的现状!应立即对现存居群实施及时有效的就地
保护!严禁地毯式采挖&"
!
#由于蛇足石杉孢子体生
长发育具有较严苛的,小生境-选择特性!例如!全由
孢子萌发小苗建立起来的坪坝营居群!虽然个体数
量不少!遗传多样性也最高!但其生境"无遮蔽的采
伐迹地#并不符合该种生长发育所需的,小生境-条
件!这些幼年个体很难成活!居群不久便会消亡因
此!保护其适生生境不被进一步破坏!或在更大尺度
上加强对相应森林群落的保护!以形成更多适宜蛇
足石杉生长发育的,小生境-!从而促使居群的自然
恢复更新&"
%
#加强对蛇足石杉保护的宣传力度!制
定科学合理的间采规范!使生境得到适当的扰动!以
促使更多的孢子萌发同时!鼓励当地农民采取野
生抚育!集中移栽管理等各种措施建立半人工居群!
使当地群众在保护的同时进行开发并能从中获益&
"
$
#积极开展和推进引种驯化研究!在适宜地区开展
人工栽培!使其在开发应用中得到保护
本研究旨在为蛇足石杉的保护生物学研究提供
遗传变异水平及遗传结构等遗传学背景信息!但一
个物种的濒危是多种内外因素共同作用的结果因
此!尚需进一步对蛇足石杉的进化历史+世代交替的
生活史过程+繁育系统等问题进行深入研究!以全面
认识其物种特性!准确揭示其濒危机制!从而制定出
科学合理的保护对策和行之有效的保护措施
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