全 文 ：广 西 植 物 Guihaia May２０１３,３３(３):４０６－４０９ http://journal．gxzw．gxib．cn
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１３．０３．０２１
杜次,彭清忠,田向荣,等．湘西蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量的测定[J]．广西植物,２０１３,３３(３):４０６－４０９
DuC,PengQZ,TianXR,etal．DeterminationofhuperzineA,BandCinHuperziaserratafromwesternHunanbyHPLC[J]．Guihaia,２０１３,
３３(３):４０６－４０９
湘西蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量的测定
杜 次１,２,彭清忠１,２,田向荣１,２,朱 越１,２,李 菁１,２
(１．吉首大学 生物资源与环境科学学院,湖南 吉首４１６０００;２．植物资源保护与利用
湖南省高校重点实验室,湖南 吉首４１６０００)
摘 要:采用超声萃取法提取湘西蛇足石杉总生物碱,用高效液相色谱法同时测定其石杉碱甲、乙和丙含量,并
分析其在植株不同部位的分布.结果表明:湘西４个样地蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量基本一致,分别达到
０．５‰、０．３‰和０．０４‰;但植株不同部位三种石杉碱含量差异显著,其中石杉碱甲和乙的分布均为叶＞茎＞根,石
杉碱丙则是根大于叶和茎.由此可知,湘西蛇足石杉具有资源优势,石杉碱在植株的分布具有明显的部位选择
性;采用HPLC可同时检测石杉碱甲、乙和丙,方法简单快速、准确可靠.
关键词:蛇足石杉;石杉碱甲;石杉碱乙;石杉碱丙;高效液相色谱法
中图分类号:Q９４６．８８ 文献标识码:A 文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１３)０３Ｇ０４０６Ｇ０４
DeterminationofhuperzineA,BandCin
HuperziaserratafromwesternHunanbyHPLC
DUCi１,２,PENGQingＧZhong１,２,TIANXiangＧRong１,２,ZHUYue１,２,LIJing１,２∗
(１．ColegeofBiologyandEnvironmentalSciencesJishouUniversity,Jishou４１６０００,China;２．KeyLaboratoryof
PlantResourceConservationandUtilization,ColegesandUniversitiesofHunanProvince,Jishou４１６０００,China)
Abstract:FordeterminingthecontentsofhuperzineA,BandCinthewholeherbanddiferentpartsofHuperziaserraＧ
tafromwesternHunan,totalalkaloidsofsampleswereextractedbyultrasoundwith２％tartaricacidandthenanalyzed
byHPLC,inwhichchromatographiccolumnwasDiamonsilC１８(２５０mm×４．６mm,５μm),mobilephasewasmethanolＧ
０．０８mol/LCH３COONH４,flowspeed１mL/min,columntemperature２５℃anddetectionwavelength３０８nm．ThereＧ
sultsshowedthatthecontentsofhuperzineA,huperzineBandhuperzineCinH．serratafrom４sampleplotsweresimiＧ
lar,andupto０．５‰,０．３‰and０．０４‰respectively．ThecontentsofhuperzineA,BandCinthediferentpartsofH．serＧ
ratahadsignificantdiferences,inwhichthedistributionofhuperzineAandBwasroot＜stem＜leaf,buthuperzineC
wasroot＞stemandleaf．Inconclusion,therearesuperiorresourcesofH．serrataforhuperzineproductioninwestern
Hunan,thedistributionofhuperzineindiferentpartsofH．serratahadhighselectivity,andtheHPLCmethodtomeasＧ
urethreekindsofhuperzinesimultaneouslywassimple,accurateandreliable．
Keywords:Huperziaserrata;huperzineA;huperzineB;huperzineC;HPLC
蛇足石杉(Huperziaserrata)是石松类石松科
石松属植物,作为传统中草药在我国民间已有上千
年的用药历史,其所含石杉碱次生代谢物是一类高
效、可逆且具有选择性的乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制
剂(Maetal．,２００５,２００６).临床实验证实石杉碱甲
治疗重症肌无力和早老年性痴呆症疗效显著(Liu
收稿日期:２０１２Ｇ１２Ｇ０９ 修回日期:２０１３Ｇ０２Ｇ１０
基金项目:国家自然科学基金(３１２６００８１);吉首大学研究生科研创新项目(Jdy１２０３７)
作者简介:杜次(１９８７Ｇ),男,湖南岳阳人,硕士研究生,主要从事植物生态学研究,(EＧmail)dc２００６sg＠１６３．com.
∗通讯作者:李菁,教授,主要从事植物生理生态学研究,(EＧmail)lkg＠jsu．edu．cn.
etal．,１９８６;Maetal．,２００７);石杉碱乙抑制 AchE
活性为石杉碱甲的１/１０,但其具有更长的活性持续
时间,因此能表现出更高的治疗指数(刘静等,
１９９９);石杉碱丙作为一种新的lycodine型生物碱,
其AchE活性抑制能力接近石杉碱甲(Liuetal．,
１９９４).近些年,由于提取石杉碱甲高额利润的驱
使,对蛇足石杉地毯式采收使得该类植物锐减,除了
寻找生产石杉碱甲的新途径外,充分利用蛇足石杉
资源、挖掘与石杉碱甲等效的石松生物碱,以及建立
科学、快速的检测方法对该类资源进行质量评价势
在必行.目前,有关石杉碱甲的测定研究较多,袁经
权等(２０１２)也曾同时测定石杉碱甲和乙的含量,但
尚没有石杉碱丙测定方法的研究,也没有同时测定
石杉碱甲、乙和丙含量的文献报道.因此,本研究尝
试建立了高效液相色谱法同时测定湘西蛇足石杉中
石杉碱甲、乙和丙含量的方法,并分析其植株不同部
位三种石杉碱分布差异,为合理保护和充分利用蛇
足石杉资源,评价该类资源品质和最佳提取部位提
供科学依据.
１ 材料与方法
１．１材料
仪器:岛津LCＧ２０AT高效液相色谱仪,包括LCＧ
２０AT型高压双泵、SPDＧM２０A型紫外检测器、CTOＧ
２０A柱温箱、进样器、色谱数据处理系统(LCＧsolution
软件).岛津AUY１２０型电子天平,德国BINDER电
热烘箱,Milipore超纯水处理系统,KQＧ２５０E型超声
波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).
试剂:石杉碱甲、乙、丙标准品(Sigma公司);甲
醇为色谱纯,醋酸铵、冰醋酸、酒石酸及其它试剂均
为分析纯.
样品:实验材料采自湖南永顺县杉木河、古丈县
高望界、保靖县白云山和凤凰县两头羊,经吉首大学
张代贵高级实验师鉴定为蛇足石杉.
１．２方法
１．２．１对照品溶液的制备 精密称取石杉碱甲、乙和
丙标准品１０mg,分别置于１００mL容量瓶中,用色
谱级甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,质量浓度分别为
１００μg/mL.精密吸取上述标准品母液,分别稀释
成６组浓度梯度的石杉碱甲、乙和丙混合溶液(μg/
mL):a(０．５、０．２、０．２)、b(２．０、１．０、１．０)、c(４．０、２．０、
２．０)、d(６．０、４．０、３．０)、e(８．０、６．０、４．０)和f(１０．０、８．０、
５．０).４℃冷藏保存备用.
１．２．２供试品溶液的制备 将采自４个样地的蛇足
石杉样品清洗干净,各选取１０棵具有２个二叉分支
的完整植株(２０~２５cm),每个样地的材料等分成
３份,各组间植株大小相近;同样选择１５棵植株,分
别收集根、茎、叶;选好的材料置于烘箱中５０℃烘
干,然后用研钵充分研碎,再次置于烘箱中５０℃烘
至恒重.精密称取０．２g粉末置于１００mL具塞锥
形瓶中,加入２％ 的酒石酸２０mL,称定,超声萃取
１h,再称重,用２％ 酒石酸补足失重.经０．４５μm
滤膜过滤,即得供试样品溶液.
１．２．３色谱条件 色谱柱为DiamonsilC１８(２５０mm×
４．６mm,５μm);流动相为甲醇Ｇ０．０８mol/L醋酸铵溶
液(３２∶６８,V/V;冰醋酸调pH至５．８);流速１mL/
min;检测波长３０８nm;柱温２５℃;进样量２０μL.
１．２．４样品分析 取样品溶液和标准品混合液,按
“１．２．３”色谱条件进行测定,利用峰面积外标法计算
石杉碱甲、乙和丙含量.
２ 结果与分析
２．１色谱分离
在本色谱条件下,石杉碱甲、乙和丙各组分分离
良好,峰型对称,无拖尾现象,不受样品中其它成分
干扰,理论塔板数按石杉碱甲计不低于６０００.对照
品混合物和供试样品中石杉碱甲、乙和丙的保留时
间分别为１１．７６、６．７９min和７．９３min(图１),整个
分离过程仅需１３min.
２．２方法学考察
２．２．１线性关系的测定 精密吸取上述６组对照品混
合液各２０μL进样,分别记录３种石杉碱的峰面积积
分值.以峰面积积分值A为纵坐标,质量浓度ρ(μg/
mL)为横坐标绘制标准曲线,线性回归方程:A甲＝
３８４２６ρ＋３５５５．２０,R２＝０．９９９０;A乙＝２５８７８ρ－１６１０,
R２＝０．９９８１;A丙＝３７３０５ρ－２８５２．１０,R２＝０９９９２.结
果石杉碱甲、乙和丙分别在０．５~１０．０、０２~８．０、０．２~
５．０μg/mL范围内线性关系良好.
２．２．２精密度试验 取f组对照品混合溶液２０μL,
按１．２．３项色谱条件重复进样６次,测定峰面积.结
果显示石杉碱甲、石杉碱乙及石杉碱丙的峰面积
RSD分别为０．４５％、１．１７％和０．５４％,表明测定方
法精密度良好.
２．２．３重复性试验 精确称取蛇足石杉全草(杉木河
７０４３期 杜次等:湘西蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量的测定
图１ 石杉碱标准品混合液(A)和蛇足石杉根(R)、茎
(S)、叶(F)及全草(P)提取物样品的HPLC图 HupA．
石杉碱甲;HupB．石杉碱乙;HupC．石杉碱丙.
Fig．１ HPLCchromatogramsofhuperzineA,BandC
standard mixtures,andsamplesolutionsextracted
fromroot(R),stem(S),foliage(F)andwholeplant
(P)ofHuperziaserrata HupA．HuperzineA;HupB．
HuperzineB;HupC．HuperzineC．
样品)粉末０．２g,按照１．２．２所述方法和１．２．３项色
谱条件提取、测定,实验重复６次.计算得样品石杉
碱甲含量的RSD为１．１８％,石杉碱乙含量的RSD
为１．７１％,石杉碱丙含量的RSD为０．８４％,结果表
明该方法具有良好的重复性.
２．２．４稳定性试验 取供试样品(杉木河样品)溶液,
分别于０、８、１６、２４、４８h进样２０μL,记录峰面积,计
算石杉碱甲、乙和丙含量的 RSD分别为１．８９％、
２．１７％和２．５４％,表明供试样品溶液在４８h内稳定
性良好.
２．２．５加样回收率试验 精密称取６份已知含量的
蛇足石杉全草(杉木河样品)粉末０．２g,分别加入适
量的对照品混合液f,按照１．２．２项方法制备供试
液,进样２０μL,记录峰面积,计算各对照品的加样
回收率.石杉碱甲、乙和丙的平均回收率分别为
１０２％,９９．２％和９８．８％,RSD分别为０．３２％,１．１０％
和０．４８％.
２．３样品石杉碱含量测定
分别对４个样地的蛇足石杉全草粉末进行处
理,HPLC测定,采用外标法定量:ρ石＝A石/A标×
ρ标,换算得供试样品中石杉碱的含量.结果表明,
永顺杉木河蛇足石杉全草中石杉碱甲含量(０．５１８±
０．００６)‰、石杉碱乙(０．３２５±０．００４)‰、石杉碱丙
(０．０４６±０．００１)‰;古丈高望界蛇足石杉全草中石
杉碱甲、乙和丙含量分别为(０．５１３±０．００５)‰、
(０３１７±０．００４)‰和(０．０４２±０．００１)‰;保靖白云山
分别为(０．５０４±０．００６)‰、(０．３１２±０．００３)‰和
(０．０４０±０．００１)‰;凤凰两头羊分别为(０．５１０±
０．００４)‰、(０．３１５±０．００５)‰和(０．０４３±０．００１)‰.
４个样地之间的石杉碱甲、乙和丙含量无显著差异.
同理测定了不同样地三种石杉碱在蛇足石杉
根、茎和叶中的分布情况,由表１可知,４个样地植
株不同部位的石杉碱甲、乙和丙含量存在显著差异.
即在蛇足石杉的叶、茎、根中,石杉碱甲和乙的分布
规律一致,均为叶＞茎＞根,且叶和茎中的含量明显
高于根中含量;石杉碱丙的含量则为根大于叶和茎.
３ 结论与讨论
由于石杉碱甲、乙和丙是具有相似结构的石松
类生物碱,同时对其进行测定有一定困难,我们通过
比较多种溶剂系统、优化流动相组成配比、调节缓冲
液pH值等方法首次建立对该三种石杉碱同时进行
８０４ 广 西 植 物 ３３卷
表１ 不同样地不同部位蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量的测定结果
Table１ ContentsofhuperzineA,BandCinthedifferentpartsofhuperziaserratafromdifferentregions
不同样地
Differentplots
不同部位
Differentparts
石杉碱甲 (‰)
HuperzineA
石杉碱乙 (‰)
HuperzineB
石杉碱丙 (‰)
HuperzineC
永顺杉木河
Shamuhe,Yongshun
根 ０．２０３ ０．１５１ ０．０８８
茎 ０．４５７ ０．２７８ ０．０３５
叶 ０．５８２ ０．３９５ ０．０３７
古丈高望界
Gaowangjie,Guzhang
根 ０．１９５ ０．１３５ ０．０８５
茎 ０．４３５ ０．２４６ ０．０３３
叶 ０．５６０ ０．３７０ ０．０３１
保靖白云山
Baiyunshan,Baojing
根 ０．１８４ ０．１２７ ０．０７９
茎 ０．４３３ ０．２４４ ０．０３０
叶 ０．５４６ ０．３６５ ０．０３４
凤凰两头羊
Liangtouyang,Fenghuang
根 ０．１８０ ０．１２４ ０．０９０
茎 ０．４３８ ０．２５３ ０．０３５
叶 ０．５５２ ０．３７５ ０．０３６
检测的HPLC方法.实验中采用二极管阵列检测
仪,紫外２１０~４００nm扫描,发现三种石杉碱的紫
外吸收图谱基本一致,分别在２３０nm和３０８nm处
有强吸收峰,为了减少样品中其它组分的干扰,选择
３０８nm作为检测波长.
蛇足石杉分布范围较广,受生长环境影响,其所
含石杉碱甲等生物碱有所差异(郭水良等,２００６;王
俊等,２００９),本研究调查了湘西４个样地蛇足石杉
全草中石杉碱甲、乙和丙含量,发现差异不显著,这
可能与采样地具有相同的生态因子和地理条件有
关;相比文献报道的不同产地蛇足石杉及其它石杉
科植物中石杉碱甲含量(平均０．３‰)(王俊等,２００３;
郭水良等,２００６;王俊等,２００９),湘西蛇足石杉中石
杉碱甲含量比较高,达到０．５‰,结果表明湘西蛇足
石杉具有资源优势,非常适合作为石杉碱甲工业生
产的原料;同时发现石杉碱乙的含量在０．３‰以上,
甚至高于一些地区蛇足石杉中石杉碱甲含量,具有
很好的开发利用潜力.本研究首次调查了蛇足石杉
中石杉碱丙含量,虽比较低,但该项研究为充分利用
蛇足石杉植物资源和寻找石杉碱甲替代产品提供了
参考数据.
石杉碱的生物合成过程复杂,目前还没有阐明
其次生代谢途径.本研究表明,湘西蛇足石杉中石
杉碱甲和乙在根、茎和叶各器官的分布具有相似的
规律,即叶＞茎＞根,该结果与孙远明等(２００２)采用
HPLC测定蛇足石杉中石杉碱甲的研究结果相吻
合.推测石杉碱甲和乙的生物合成途径可能相同,
首先在蛇足石杉的叶中合成,而后通过茎向地下部
根中运输.让人意外的是研究中发现石杉碱丙的分
布在蛇足石杉根中含量显著高于茎和叶,即地下部
分大于地上部分,此结果是否表明石杉碱丙与石杉
碱甲和乙有不同的次生代谢路径还有待考证.
湘西独特的山林地貌,温暖湿润的气候环境,为
蛇足石杉生长繁衍提供了有利生境,但是近些年高
强度采收,其野生聚群及生态过程严重破坏,资源日
趋枯竭,笔者实地调查了湘西各地区蛇足石杉资源,
很难发现大量野生聚群分布.故此希望人们能够重
视目前该类资源面临的现状,采收蛇足石杉地上部
分,既可保证药材的质量,又利于资源的合理和可持
续利用.
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９０４３期 杜次等:湘西蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量的测定