全 文 ：书西北植物学报!
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基金项目$国家公益性行业"农业#科研专项"
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#&农业部农作物种质资源保护项目"
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#
作者简介$夏乐晗"
#3(,
#!女!在读硕士研究生!主要从事柿种质资源与分子生物学研究
4)56.7
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"
通信作者$杨
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勇!硕士!副教授!主要从事柿种质资源研究
4)56.7
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柿
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体系优化及品种遗传多样性分析
夏乐晗!杨婷婷!杨
!
勇"!夏宏义!张永芳!王仁梓
"西北农林科技大学 园艺学院!陕西杨陵
&#!#""
#
摘
!
要$选用国家柿种质资源圃中
!$
个牛心柿和
!!
个野柿为实验材料!采用
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#正交试验设计!建立了最优
@A反应体系"
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反应体系中!含
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聚合酶
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I1J
模板
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#!并对不同引物的退火温度进行了优化!以探讨
@A标记在柿亲缘关系鉴定和品种分
类方面的应用结果显示$"
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#
"
条
@A引物对
$,
份材料共扩增出
#&,
个位点!其中多态性位点
#&"
个!多态率
达
3,+,K
&
$,
份材料的遗传相似系数在
"+,#3
#
"+(*!
之间"
!
#
HCLEJ
聚类分析显示!
@A标记能将
$,
份材
料完全区分开!其中$红花雄野毛柿(红花雌野毛柿单独被聚为一组!独立于牛心柿和野柿之外!与形态特征观察结
果一致&璧山牛心柿与野柿聚为一组!在形态特征上璧山牛心柿也更趋于野柿!且璧山牛心柿为四倍体!与其他牛
心柿"六倍体#不同!璧山牛心柿应属于野生柿研究表明!
@A标记是研究柿种质资源遗传多样性的有效手段&
$,
份材料存在着较高的遗传多样性!在一定程度上反映了品种的地理分布情况!也说明地理因素对柿的亲缘关系
有很大影响
关键词$
@A标记&柿&体系优化&遗传多样性
中图分类号$
M&(3
文献标志码$
J
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!
@A#分子标记是
A<76WG
等)#*在水稻
上提出的基于
@DJC
"单引物扩增反应#的新的目的
基因分子标记方法其依据植物基因中的
JBL
翻
译起始位点侧翼序列的保守性!设计单引物并对基
因组进行扩增
@A标记结合
O@@D
标记和
DJCI
标记的优点!操作简单!成本低廉!多态性丰
富!重复性好!引物设计简单且通用性良好!能有效
地产生与性状联系的标记!不仅可以作为
O@@D
和
DJCI
的有效补充!而且是一种能跟踪性状的新的
分子标记!有利于分子辅助育种)!)**该分子标记技
术已被成功应用于水稻)#*(花生),*(甘蔗)&*等常见农
作物!而且在园艺植物遗传多样性研究中的应用也
较为广泛!如龙眼)**(芒果)(*(柑橘)3*(石斛兰)#"*等
柿"
$%&
()
*&+"+%B:X0^ +
#原产中国!有
%"""
多
年的栽培历史)##*!柿属植物在世界上有近
$""
多种!
原产中国的有
*&
种
,
变种
#
变型)#!*中国是柿树
栽培面积最多(产量最高的国家!其次是日本(韩国
从柿种质资源的收集保存数量上来看!中国目前处
于世界领先地位!丰富的资源为柿属植物的遗传改
良和新品种培育提供了丰富的材料然而!由于柿
树童期长(遗传上高度杂合(自交不亲和及多倍体现
象普遍存在!再加上地区间的相互引种!导致同物异
名(同名异物和品种混乱的现象普遍存在!品种间的
亲缘关系不明确!给品种区分和育种工作带来诸多
困难!使得柿种质的遗传改良进展缓慢!不利于优良
品种的推广加之!地方偏远!未进行资源调查的地
方品种!给种质资源调查(收集以及遗传育种工作带
来困难)#%*对于中国柿种质资源的鉴定及亲缘关
系的研究!还有大量的工作要做全国各地种植柿
的省份比较多!有一类都被称为+牛心柿,!它是柿的
一个品种!果实外形似牛心!故以形状命名根据
#%"
项制表)#$*进行形态学上的观测鉴定!发现一些
+牛心柿,形态特征相似!似同一品种!而其他+牛心
柿,形态特征差异较大!不是同一品种为区别不同
品种!引进后在名称前加上地方名野柿在柿原产
地是一种自然杂交后的实生后代!多数没有经过嫁
接!可能是柿和柿的自然杂交后代!也可能是柿的变
种野柿的果实虽然小!但是实生苗和其它柿品种
亲和性好!具有较高的亲和力!尤其是可作为日本富
有系甜柿的砧木来利用
@A分子标记在柿属植
物中已有报道)#**!但是取材范围小!且目前尚无对
牛心柿和野柿的研究本研究以
!$
个牛心柿(
!!
个野柿为试材!利用
@A分子标记技术检测柿的
遗传多态性!为柿和其他物种的研究提供新型分子
标记技术!为开展相关研究提供借鉴
#
!
材料和方法
B+B
!
试验材料和试剂
试验用栽培品种
!$
个牛心柿(
!!
个野柿!均采
自国家柿种质资源圃"表
#
#
!"#%
年
$
月采摘幼嫩
叶片!低温保存带回实验室!提取
I1J

试验中选用
$"
条引物!其中
#
#
%,
号参照
A<7)
76WG
等)#*公布的引物合成!
%&
#
$"
号参照熊发前
等),*设计的引物合成"表
!
#!所有引物由上海生工
生物工程有限公司合成
I?!"""56W_9W
!
G1BC/
!
!"
#
聚合酶!
#"`2XTT9W
等均购自宝生物工程"大
连#有限公司
B+C
!
方
!
法
B?C?B
!
9D5
提取与检测
!
采用改良
ABJ2
法提取
I1J
!参照井赵斌等)#,*提取
I1J
的方法并稍作改
动
D16/9J
纯化
I1J
后!用紫外分光光度法和琼
脂糖凝胶电泳法检测其质量及完整性!稀释至
$"
0
>
%
"
?
!然后在
!"a
冰箱中保存备用
B?C?C
!
$%"&(%)
扩增程序及产物检测
!
CAD
扩
增反应参照熊发前等)#&*并稍作改进!在
4
]]
90GCAD
扩增仪上进行!扩增程序为
3$ a
预变性
%
5.0
&
3$a
变性
#5.0
!复性退火"
*"b*
#
a#5.0
!
&!a
复性
!5.0
!
%,
个循环&最后
&!a
延伸
*5.0

扩增反应结束后!加入
%
"
?
上样缓冲液"
,`?<6G)
.0
>
X^TT9W
#!取
,
"
?
扩增产物在
#+*K
的琼脂糖凝
胶中电泳!电极缓冲液为
#` BJ4
!
42
染色后!利用
凝胶成像系统采集图像
B?C?E
!
$%"&(%)
体系的正交优化设计
!
选取苍
山牛心柿为模板!以
@A为扩增引物!将
E
>
!F
(
!"
#
聚合酶(
G1BC/
(引物(
I1J
模板等
*
种影响因
$&$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
素设置
$
个不同水平)#(*"表
%
#!采用
?
#,
"
$
*
#正交试 验设计对柿
@A反应体系进行优化然后
表
B
!
供试材料和类型
B6^79#
!
B9/Q56Q9W.67/60GQ
=]
9/
编号
A试材
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9
种名
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染色体倍性
C7<.G
=
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原产地
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#
苍山牛心柿
A60
>
/:601.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
山东苍山
A60
>
/:60
!
@:60G<0
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!
孝义牛心柿
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湖北孝义
N.6<
=
.
!
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%
襄阳牛心柿
N.60
>=
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>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
湖北襄阳
N.60
>=
60
>
!
RX^9.
$
新昌牛心柿
N.0;:60
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
浙江新昌
N.0;:60
>
!
S:9
-
.60
>
*
新安牛心柿
N.0601.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
河南新安
N.
-
060
!
R9
-
060
,
宿县牛心柿
@X8.601.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
安徽宿县
@X8.60
!
J0:X.
&
恭城牛心柿
L<0
>
;:90
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
广西恭城
L<0
>
;:90
>
!
LX60
>
8.
(
阳朔牛心柿
P60
>
/:X<1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
广西阳朔
P60
>
/:X<
!
LX60
>
8.
3
舟曲牛心柿
S:e
X1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
甘肃舟曲
S:e
X
!
L60/X
#"
郧阳牛心柿
PX0
=
60
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
湖北郧阳
PX0
=
60
>
!
RX^9.
##
杭州牛心柿
R60
>
V:浙江杭州
R60
>
V:!
S:9
-
.60
>
#!
河北农大牛心柿
R9^9.0<0
>
G61.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
河北保定
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!
R9^9.
#%
洛阳牛心柿
?X<
=
60
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
河南洛阳
?X<
=
60
>
!
R9
-
060
#$
大丰牛心柿
I6T90
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
江苏大丰
I6T90
>
!
f.60
>
/X
#*
正阳牛心柿
S:90
>=
60
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
河南正阳
S:90
>=
60
>
!
R9
-
060
#,
临潼牛心柿
?.0Q<0
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
陕西临潼
?.0Q<0
>
!
@:6608.
#&
巴东牛心柿
26G<0
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
湖北巴东
26G<0
>
!
RX^9.
#(
澄江牛心柿
A:90
>-
.60
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
云南澄江
A:90
>-
.60
>
!
PX0060
#3
曹县牛心柿
A6<8.601.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
山东曹县
A6<8.60
!
@:60G<0
>
!"
株洲牛心柿
S:XV:湖南株洲
S:XV:!
RX
-
060
!#
临猗牛心柿
?.0
=
.1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
山西临猗
?.0
=
.
!
@:608.
!!
合阳牛心柿
R9
=
60
>
1.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
陕西合阳
R9
=
60
>
!
@:6608.
!%
齐镇牛心柿
M.V:901.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d,8d3"
陕西眉县
E9.8.60
!
@:6608.
!$
璧山牛心柿
2./:601.X8.0/:. $,+"+%B:X0^ + !0d$8d,"
重庆璧山
2./:60
!
A:<0
>e
.0
>
!*
凤山野生柿
[90
>
/:60Y.G9
]
9W/.55<0 $,+"+%\6W+
)
-./0*%E6_+ !0d,8d3"
广西凤山
[90
>
/:60
!
LX60
>
8.
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楼后北野柿
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)
-./0*%E6_+ !0d,8d3"
陕西眉县
E9.8.60
!
@:6608.
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野柿
)"#U.G9
]
9W/.55<0"# $,+"+%\6W+
)
-./0*%E6_+ !0d,8d3"
浙江杭州
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>
V:!
S:9
-
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>
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野柿
)"!U.G9
]
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浙江杭州
R60
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野柿
)"%U.G9
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浙江杭州
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丽水野柿
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丽水野柿
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云南丽水
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浙江上虞
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X
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伏山野柿
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河南伏山
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R9
-
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伏山野柿
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伏山野柿
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百战坪野柿
)"#26.V:60
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)
-./0*%E6_+ !0d,8d3"
河南百战坪
26.V:60
]
.0
>
!
R9
-
060
$#
百战坪野柿
)"!26.V:60
]
.0
>
Y.G9
]
9W/.55<0"! $,+"+%\6W+
)
-./0*%E6_+ !0d,8d3"
河南百战坪
26.V:60
]
.0
>
!
R9
-
060
$!
百战坪野柿
)"%26.V:60
]
.0
>
Y.G9
]
9W/.55<0"% $,+"+%\6W+
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河南百战坪
26.V:60
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R9
-
060
$%
百战坪野柿
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>
Y.G9
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河南百战坪
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>
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R9
-
060
$$
百战坪野柿
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>
Y.G9
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9W/.55<0"* $,+"+%\6W+
)
-./0*%E6_+ !0d,8d3"
河南百战坪
26.V:60
]
.0
>
!
R9
-
060
$*
红花雄野毛柿
P956]]
+ X0_0四川德阳
I9
=
60
>
!
@.;:X60
$,
红花雌野毛柿
P956]]
+ X0_0四川德阳
I9
=
60
>
!
@.;:X60
*&$
%
期
!!!!!!!!!!!!!
夏乐晗!等$柿
@A体系优化及品种遗传多样性分析
表
C
!
检测用的
$%"&
引物序列
B6^79!
!
B:9
]
W.59W/9
e
X90;9/X/9G.0@A=
/./
编号
A引物
CW.59W
序列"
*g
#
%g
#
@9
e
X90;9
编号
A引物
CW.59W
序列"
*g
#
%g
#
@9
e
X90;9
# @A! @A% @A$ @A* @A, @A& @A( @A3 @A#" @A## @A#! @A#% @A#$ @A#* @A#, @A#& @A#( @A#3 @A!" @A表
E
!
柿
$%"&(%)
反应体系
F
BG
!
H
I
"正交设计
B6^79%
!
?
#,
"
$
*
#
>
<067G9/.
>
0]
9W/.55<0@A水平
?9\97
模板
I1J
用量
B95
]
76Q9I1J
G>
9
%
0
>
E
>
!F浓度
E
>
!F
;<0;90QW6Q.<0
%"
55<7
%
?
#
G1BC/
浓度
G1BC/;<0;90QW6Q.<0
%"
55<7
%
?
#
引物浓度
CW.59W;<0;90QW6Q.<0
%"
"
5<7
%
?
#
!"
#
聚合酶用量
!"
#]
<7
=
59W6/9
G>
9
%
H
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! !" !+" "+% "+% #+"
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$ !" %+" "+* "+* !+"
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#% *" #+* "+* "+% #+*
#$ *" !+" "+$ "+! !+"
#* *" !+* "+% "+* "+*
#, *" %+" "+! "+* #+"
将条带的灵敏性(特异性及清晰度进行比较!从而进
行下一步的分析
B+C+H
!
引物筛选和退火温度的确定
!
根据正交试
验结果!选择最佳反应体系进行引物筛选和退火温
度的确定试验
B+C+I
!
数据统计与处理
!
对扩增清晰且易于辨认
的条带采用+
")#
,系统记录其位置!在相同迁移位置
有带的记为+
#
,!无带记为+
"
,!建立
@A标记的
"
(
#
矩阵利用
1B@P@)
]
;!+#
软件进行遗传相似
系数计算!并用
HCLEJ
程序构建聚类图
,&$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
!!
结果与分析
C?B
!
$%"&(%)
最优体系建立
C+B+B
!
正交试验设计
!
由正交试验结果"图
#
#可
以看出!不同的处理组合!由于
E
>
!F
(
G1BC/
(
!"
#
聚合酶(引物和模板
I1J
用量搭配组合的不同!扩
增结果存在着明显的差异其中!处理
&
!
#%
扩增结
果不清晰!处理
#*
!
#,
条带比较清晰!条带幅度大
但因图片所显示的条带不是很亮!所以适当增加
I1J
的体积!比照处理
#*
和
#,
的搭配组合!调整
后
!"
"
?@A优化体系为$
$"0
>
%
"
?
模板
I1J!+"
"
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!
!* 55<7
%
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>
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"
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"
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#"
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引物
#+"
"
?
!
*
H
%
"
?!"
#
聚合酶
"+!
"
?

C+B+C
!
引物筛选及最适退火温度
!
根据正交试验
结果所确定的柿属植物
@A最佳反应体系!
以苍山牛心柿和野柿
)"#
的基因组
I1J
为模板!对
本试验选定的
$"
条引物进行筛选通过反复试验!
从
$"
条引物中筛选出条带清晰(种间差异明显(多
态性好的
#"
个引物用于柿种质资源的遗传多样性
分析"表
$
#
对每一筛选出的引物进行最适退火温度的确
定根据"
*"b*
#
a
的温度)#3*设定范围!
CAD
仪自
动生成
#!
个温度梯度!分别为
$*+#a
(
$*+%a
(
$*+3a
(
$,+(a
(
$&+3a
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$3+#a
(
*"+$a
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*#+&
a
(
*!+(a
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*%+(a
(
*$+*a
和
*$+(a
根据电泳
检测结果!选择扩增条带数量多(条带清晰的作为最
适退火温度!扩增效果相同的情况下选择温度高的
作为最适退火温度!以确保
CAD
产物的特异性各
引物最适退火温度如表
$
所示
C?C
!
$%"&
标记的遗传多态性分析
C?C?B
!
$%"&
标记的多态性
!
本研究从
$"
条引物
中筛选出扩增条带清晰(多态性强的引物
#"
条利
用这
#"
条引物对
$,
份柿种质资源进行扩增!共扩
增出
I1J
位点
#&,
个!其中
#&"
个位点具有多态
性!占总位点的
3,+,K
!说明供试样品的遗传多样
性比较丰富引物
$
(
#&
(
!*
(
!&
(
%%
(
%3
的多态性比
率比较高!均为
#""+"K
&引物
!*
扩增的条带最多
"
!%
条#!引物
!&
扩增的条带最少"
#!
条#&与其他引
物相比!引物
!"
的多态性最小!总条带为
#(
!多态
性条带为
#,
!多态性比率为
((+3K
每条引物可扩
增出
#!
#
!%
条带!平均
#&+,
条产物条带介于
%""
#
%"""^
]
之间!以
*""
#
!"""^
]
居多"图
!
#
图
#
!
苍山牛心柿
@A反应体系正交试验优化结果
E+I?!"""56W_9W
&从左到右依次为
正交表
?
#,
"
$
*
#的
#
#
#,
个处理
[.
>
+#
!
B:9W9/X7Q/>
/:601.X8.0/:.@A/
=
/Q95<
]
Q.5.V9GY.Q:>
<067G9/.
>
0
E+I?!"""56W_9W
&
#
#
#,;]
<0G.0
>
Q<
QW96Q590Q/#,
"
$
*
#
表
H
!
柿
$%"&
引物筛选(最适退火温度及多态性分析
B6^79$
!
@979;Q9G@A]
W.59W/
!
600967.0
>
Q95
]
9W6QXW9/60G
]
<7
=
5]
:.;6067
=
/./.0
]
9W/.55<0
引物
CW.59W
序列"
*g
#
%g
#
@9
e
X90;9
退火温度
J00967.0
>
Q95
]
9W6QXW9/
%
a
总条带数
1<+6^0G/
多态性条数
1<+]
<7
=
5]
:.;
6^0G/
多态性百分率
C9W;90Q6
>
9]
<7
=
5]
:.; 6^0G/
%
K
@A@A@A@A@A@A@A@A@A@A合计
B平均
E960 #&+, #& 3,+,
&&$
%
期
!!!!!!!!!!!!!
夏乐晗!等$柿
@A体系优化及品种遗传多样性分析
图
!
!
引物
@A对
$,
份柿种质的
@A扩增
E+I?!"""
&
#
#
$,+
材料名见表
#
&下图同
[.
>
+!
!
@A]
7.T.;6Q.<0]
9W/.55<0
>
9W5
]
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=
X/.0
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W.59W@AE+I?!"""
&
#
#
$,+B:9/9W.670X5^9W/&
B:9/6596/ 9^7图
%
!
$,
份材料
@A数据聚类图
[.
>
+%
!
I90GW<
>
W65=
/./ 6^/9G<0@AC+C+C
!
聚类分析
!
利用
1Q/
=
/)
]
;!+#
软件计算出
#"
条引物扩增结果在不同种质之间的相似系数!
$,
份试材的相似系数值分布在
"+,#3
#
"+(*!
之间
其中!来自广西的阳朔牛心柿与云南的澄江牛心柿!
相似系数最大!数值为
"+(*!
&其次为舟曲牛心柿和
郧阳牛心柿(合阳牛心柿和齐镇牛心柿!相似系数均
为
"+(%"
!这可能是由于相互引种造成柿品种资源
混乱!出现了+同物异名,)3*从形态上看!阳朔牛心
柿与澄江牛心柿非常相似!舟曲牛心柿和郧阳牛心
柿(合阳牛心柿和齐镇牛心柿也几乎相同!说明用
@A标记可以鉴别同物异名品种来自四川的红
花雄野毛柿(红花雌野毛柿和其他
$$
份材料的相似
系数最小!为
"+,#3
!说明这两者和其他种质资源的
遗传差异很大)&*
用
HCLEJ
构建
$,
个柿品种的分子系统树
"图
%
#从聚类图可以看出!柿品种之间的亲缘关
(&$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
系比较复杂在相似系数
"+,("
的水平!可以将
$,
个品种分成
J
和
2
两大组!其中
J
组只有红花雄野
毛柿和红花雌野毛柿
!
个品种!
2
组又可以分为
A
"牛心柿组#(
I
"野柿组#
!
个组在相似系数为
"+&"(
的水平!可以将牛心柿组分为
$
个亚组!其中
第一亚组包括苍山牛心柿(孝义牛心柿(曹县牛心
柿(株洲牛心柿!第二亚组包括新安牛心柿(杭州牛
心柿(洛阳牛心柿(大丰牛心柿!第三亚组包括恭城
牛心柿(阳朔牛心柿(舟曲牛心柿(郧阳牛心柿(河北
农大牛心柿(临潼牛心柿(巴东牛心柿(澄江牛心柿(
临猗牛心柿(合阳牛心柿(齐镇牛心柿(伏山野柿
)
"%
!第四亚组包括新昌牛心柿(宿县牛心柿(正阳牛
心柿&在相似系数为
"+&"#
的水平!可以将野柿组分
为
%
个亚组!第一个亚组包括襄阳牛心柿(百战坪野
柿
)"#
(百战坪野柿
)"!
!第二亚组包括璧山牛心柿(
野柿
)"#
(伏山野柿
)"$
(伏山野柿
)"*
(伏山野柿
)",
(
伏山野柿
)"&
(百战坪野柿
)"$
!第三亚组包括凤山野
生柿(楼后北野柿(野柿
)"!
(野柿
)"%
(丽水野柿
)"#
(
丽水野柿
)"!
(上虞野柿(伏山野柿
)"#
(伏山野柿
)"!
(
百战坪野柿
)"%
(百战坪野柿
)"*

%
!
讨
!
论
分子标记在柿及其他果树遗传育种(品种鉴定(
亲缘关系分析等方面都有重要作用)!")!#*其中
DJCI
(
@@D
(
O@@D
和
J[?C
是应用最为广泛的几
种分子标记技术!但是它们都是传统意义上的随机
I1J
分子标记!得到的位点一般与目标性状基因距
离较远!不能很好地与目标性状连锁!这使得分子标
记在应用上与其目标有一定的偏差!因而限制了它
们的应用)!*
@A分子标记作为一种基于
CAD
技术的新型分子标记具有操作简单(引物具有通用
性(成本低廉(多态性高(可获得丰富的遗传信息等
诸多优点!能更好地反映物种的遗传多样性和亲缘
关系)#&*
@A分子标记技术已经被成功应用于多
种材料)#()!!*!并且能很有效地将材料中的不同品种
通过聚类分析区分开)*)(*侯小改等)!%*运用牡丹
#&
个品种验证了
@A体系良好的稳定性和可
靠性!并从
%,
个
@A引物中筛选出扩增条带清晰
多态性丰富的
!$
个引物陈香玲等)!$*从
(,
条引
物中筛选出
#(
条重复性好!条带清晰的引物对
%,
份菠萝种质资源进行
CAD
扩增!多态性比率为
,$+33K
!并且通过
HCLEJ
聚类分析!
@A标记
能将
%,
份菠萝种质完全区分开邓立宝等)#"*采用
形态观察和
@A分子标记研究相结合的方法对广
西西北部高原地区的
%#
份柿种质资源进行研究!多
态性带比例为
3*+,*K
!并且聚类分析结果显示与
表型分析的结果基本一致本研究采用
@A技术
从分子水平上论证了柿品种中存在的同物异名(同
名异物现象!并验证植物分子水平分类是形态分类
的一个重要补充在柿品种鉴别方面!
@A技术
所揭示的多态性是真实可靠的!弥补了柿传统分类
方法的不足!为柿种质资源的收集(保存(分类以及
有效利用提供理论基础
大多数关于
@A分子标记的研究中!
CAD
扩
增时所有引物均采用单一退火温度)$!,!3!%*本研究
对筛选出的引物逐一进行了退火温度的优化!发现
不同的引物有不同的最适退火温度!范围从
$*+"a
到
**+"a
!不同于
A<76WG
等)#*采用的统一温度
*"a
研究认为!在进行不同材料的
@A分析时!
可以对所用引物的退火温度进行进一步筛选以提高
扩增产物的特异性
本试验选取遗传差异较大的
!
份柿基因组
I1J
为模板用于引物的筛选!从
$"
条引物中筛选
出
#"
条适于柿属植物的多态性引物!在
$,
份材料
中都表现出较高的多态性!这说明柿属植物在系统
进化方面有较高的相关性利用这些引物能从部分
材料中扩增出一些特异性条带!这些特异性条带是
否与特定性状相关!还需要进一步实验证明
$,
份
材料中
#"
条引物共扩增出
#&"
个多态性位点!平均
每个引物有
#&
个多态性位点!多态性比率高达
3,+,K
!这说明来源于中国不同省份的
!$
个牛心柿
和
!!
个野柿存在着比较高的遗传多样性!适应环境
的能力较强)!!*同时!这也说明了
@A分子标记
在一定程度上反映了品种的地理分布情况!说明地
理因素对柿的亲缘关系研究有很大影响从聚类图
可以看出!在相似系数
"+,("
的水平!红花雄野毛柿
和红花雌野毛柿与其他品种分开!形态观察可以看
出他们的嫩叶呈深红褐色!花呈红色!其中红花雌野
毛柿的花器官各部位都有毛!明显区别于其他柿种
质资源!或可作为一个新种璧山牛心柿和其他牛
心柿存在较大的差异!在形态上可以看出璧山牛心
柿各器官都有茸毛!尤其是子房上密被白色茸毛!接
近于原始的野生性状!只是因为果实大小和当地的
牛心柿相近!才被称为+牛心柿,!本质上属于野生!
被聚在野柿一组是合理的另外!璧山牛心柿是四
倍体!也不同于其他牛心柿的六倍体!这也是对璧山
牛心柿的首次分子学研究本研究表明!丽水野柿(
百战坪野柿和伏山野柿聚在同一亚组!这与井赵斌
3&$
%
期
!!!!!!!!!!!!!
夏乐晗!等$柿
@A体系优化及品种遗传多样性分析
等的研究结果)#,*一致&野柿和百战坪野柿没有聚在
同一个亚组!这与耿攀等的研究结果)!**一致!原因
有待进一步阐明在相似系数分析中!
$,
份柿基因
型的遗传系数在
"+,#3
#
"+(*!
之间!说明
@A标
记能够用于柿种质资源的遗传多样性分析本研究
为进一步利用
@A标记技术进行柿种质亲
缘关系研究(系统进化分析和遗传多样性评价奠定
了基础
参考文献#
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