全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(6): 576-586(2011)
收稿日期: 2010-09-11; 修回日期: 2011-08-28
基金项目: 农业部“948”项目(2006-G26); 青岛市自然基金项目(10-3-4-5-5-jch)
通讯作者: 刘 新,教授,硕士生导师,主要从事植物逆境信号转导研究; Tel: 0532-88030224,E-mail: liuxin6080@yahoo. com. cn
并列第一作者: 林志强(1983 - ),男,山东东营人,主要从事葡萄抗病机制研究; E-mail: zhiqianglin622108@yahoo. com. cn;
郭秀萍(1987 - ),女,山东潍坊人,主要从事葡萄抗病机制研究; E-mail: guoxiuping1987222@163. com。
NO和 H2 O2 提高葡萄抗霜霉病的生理作用机制
林志强1#, 郭秀萍1#, 车永梅1, 卢 江2, 刘 新1*
( 1 山东省高校植物生物技术重点实验室 青岛农业大学, 青岛 266109; 2 中国农业大学食品与科学学院, 北京 100193)
摘要: 以对霜霉病具有不同抗性的 3个葡萄品种 Fredonia、西拉和赤霞珠为材料,研究一氧化氮(NO)和过氧化氢(H2O2)在
调控葡萄抵御霜霉病菌感染过程中的生理机制。 结果表明:接种葡萄霜霉病菌后 3 个葡萄品种叶片中 NO和 H2O2 含量均有
猝发现象,H2O2 猝发早于 NO,抗性强的品种 Fredonia的变化快而显著;外施一定浓度的 NO供体硝普钠(SNP)和 H2O2 均可
减缓霜霉病菌侵染过程,降低感病率和平均病情指数,并且能够不同程度地提高抗性弱的葡萄品种赤霞珠叶片的过氧化物酶
(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、β-1,3-葡聚糖酶(Glu)和几丁质酶(Cht)活性,增强葡萄过敏性坏死反应;而 NO和 H2O2 的
清除剂 2-4,4,5,5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)和抗坏血酸(AsA)在一定程度上能够提高感病率和平均病情指数。
推测 NO和 H2O2 可以通过提高 POD、PAL、Glu和 Cht病程相关蛋白活性,进而增强葡萄对霜霉病的抗性。
关键词: 葡萄霜霉病; NO; H2O2; 病程相关蛋白; 抗病性
The physiological mechanisms of NO and H2O2 in increasing resistances of grape-
vine to Plasmopara viticola 　 LIN Zhi-qiang1, GUO Xiu-ping1, CHE Yong-mei1, LU Jiang2,
LIU Xin1 　 ( 1 Key Laboratory of Plant Biotechnology in University of Shandong Province, Qingdao Agriculture University,
Qingdao 266109, China; 2 College of Food and Science, China Agricultural University, Beijing 100193, China)
Abstract: In order to investigate the roles and mechanisms of nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide
(H2O2) in the process of grapes against Plasmopara viticola, three grape cultivars (Cabernet Sauvignon, Syr-
ah and Fredonia) with different resistance to P. viticola were used in this study. The results showed that NO
and H2O2 burst occurred in the three cultivars inoculated with P. viticola, and H2O2 burst was earlier than
NO, the high resistant variety (Fredonia) changed rapidly and significantly. Exogenous NO donor sodium ni-
troprusside (SNP) and H2O2 could slow down P. viticola infection process, decrease the incidence and the
average disease index. At the same time, 2-(4-carboxyphenyl) -4, 4, 5, 5-tetramethylimidazoline -1-oxyl-3-
oxidepotassium salt (cPTIO, a NO scavenger) and ascorbic acid (AsA, a H2O2 scavenger) increased the rate
of infection and the average disease index. The activities of POD (peroxidase), PAL (phenylalanine ammo-
nialyase), Glu ( β-1, 3-glucanase) and Cht ( chitinase) in Cabernet Sauvignon, a susceptible cultivar,
increased at varying degrees when treated with NO and H2O2, it increased the hypersensitive response of
Cabernet Sauvignon. The results suggested that the activities of pathogen-associated enzymes (POD, PAL,
Glu, and Cht ) were induced by NO and H2O2, and thus enhanced the resistance of grape against P. viticola.
Key words: grape downy mildew; nitric oxide; hydrogen peroxide; pathogenesis-related proteins; disease-
resistance
中图分类号: S432. 23　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)06-0576-11
　
　 6 期 　 林志强,等:NO和 H2O2 提高葡萄抗霜霉病的生理作用机制
　 　 由葡萄霜霉病菌[Plasmopara viticola (Berk.
Et Curtis) Ber. et de Toni] 引起的葡萄霜霉病
(grape downy mildew)是一种世界性真菌病害,在
葡萄栽培过程中极易发生,严重影响葡萄植株的生
长和果实的产量及品质,研究葡萄抵御霜霉病的作
用机制具有重要的理论和实践意义。
植物受到病原菌侵染时能够通过一系列信号
转导过程产生一定的抗病性。 有报道,一氧化氮
(nitric oxide,NO)和过氧化氢(hydrogen peroxide,
H2O2)是植物响应多种生物胁迫的信号分子[1 ~ 3]。
如,真菌激发子处理豌豆叶片时检测到大量的 NO
产生[1];拟南芥在受到大丽轮枝菌毒素侵染 80
min之后,NO的积累出现峰值[2,3];受到黑色根霉
菌侵染的番茄以及受到真菌激发子侵染的烟草,同
样有 NO形成[4]。 H2O2 是生物细胞代谢过程中产
生的一种活性氧,植物细胞在受到多种生物及非生
物胁迫时,能诱导 H2O2 产生,进而调控一系列胁
迫响应的信号转导。 H2O2 可以作为第二信使参与
番茄对病原胁迫的响应[4];从曲霉菌和青霉菌中
提取出赭曲霉毒素 A(ochratoxin A,OTA)能诱导
拟南芥活性氧促发,H2O2 在 20 h 时大量积累[5];
水稻感染白叶枯病菌后 H2O2 含量稳定增加,10 h
可达到峰值,6 h时过氧化氢酶相关基因显著地被
诱导表达[6];Patykowski等[7]发现 2 个抗病性不同
的番茄品种 cv. Corindo和 cv. Perkoz在受到灰霉
病菌侵染后均能检测到 H2O2 含量升高,并且抗病
品种较感病品种出现的早、生成量更高。 这些结果
显示 NO和 H2O2 均与植物抗病性密切相关。 本
实验室先前研究表明,NO 和 H2O2 参与葡萄抵御
霜霉病的过程,可能是葡萄响应霜霉病菌入侵的早
期信号物质[8]。 NO和 H2O2 提高葡萄抗霜霉病的
作用机制尚不明确。
植物受病原菌侵染后产生的信号物质往往通
过一系列传递过程最终诱导防御基因表达形成病
程相关蛋白以提高自身的抗病性,过氧化物酶
(peroxidase,POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine
ammonialyase,PAL)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glu-
canase,Glu)和几丁质酶( chitinase,Cht)是植物受
到病原菌侵染产生的重要病程相关蛋白,NO 和
H2O2 是否可以通过调控葡萄植株中 POD、PAL、
Cht及 Glu 的活性进一步影响葡萄的抗病性? 目
前尚未见报道。
本文以对霜霉病具有不同抗性的 3 个酿酒葡
萄品种 Fredonia、西拉和赤霞珠为材料,检测葡萄
叶片感染霜霉病菌后 NO 和 H2O2 含量变化及外
源 NO 和 H2O2 对霜霉病菌入侵后的赤霞珠叶片
内 POD、PAL、Cht 及 Glu 几种病程相关蛋白活性
的影响,探究 NO 和 H2O2 在葡萄抵御霜霉病过程
中的生理机制,为深入了解葡萄抵御霜霉病的作用
机理、品种抗病性鉴定及抗病育种提供参考。
1　 材料与方法
1. 1　 材料与处理
1. 1. 1　 供试材料
(1)供试菌株　 葡萄霜霉病菌,采自青岛农业
大学葡萄实验基地易感霜霉病葡萄品种霞多丽发
病叶片。
(2)供试葡萄品种 　 赤霞珠 (Cabernet Sau-
vignon)、西拉(Syrah)和 Fredonia 3 个葡萄品种,
盆栽于青岛农业大学生命科学学院植物逆境生理
实验室。
1. 1. 2 　 处理 　 取赤霞珠、西拉和 Fredonia 植株 3
~ 6 叶位健康叶片以蒸馏水(dH2O)为对照,外施
H2O2(0. 01 % 、0. 1 %和 1. 0 % );硝普钠( sodium
nitroprusside,SNP,NO 供体) (0. 01、0. 1 和 1. 0
mmol·L -1);2-4,4,5,5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧
化物(2-(4-carboxyphenyl) -4,4,5,5-tetramethylimi-
dazoline-1-oxyl-3-oxidepotassium salt, cPTIO, NO
清除剂) (0. 1、1. 0 和 10 mmol·L -1 );抗坏血酸
(ascorbic acid,AsA,H2O2 清除剂)(0. 2、2. 0 和 20
mmol·L -1)轻轻的用毛刷涂抹于叶片背面,然后
以 8 ×104 个 / mL孢子悬浮液,喷雾至叶片背面,于
培养箱中培养,测定处理后不同时间 3 个葡萄品种
叶片内 NO 和 H2O2 含量及蛋白酶活性的变化。
光照培养箱光 /暗周期 16 h / 8 h,光照强度为 80
μmol·m -2·s -1,湿度 100 % ,温度 20℃。 每个处
理均设置 3 个独立试验,每个试验重复 3 次。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 病情调查及病情指数计算　 病情调查及病
情指数计算参照 Sha等[9]的方法,测定葡萄品种间
对霜霉病抗性的差异,采用 Desaymard[10]的 10 级
分级标准。
1. 2. 2　 霜霉病菌活性测定　 从田间感病葡萄品种
775
　
植物病理学报 41 卷
霞多丽上采集受霜霉病侵染的叶片,清水冲去旧孢
子囊,20℃、相对湿度 100 %下培养 24 h,待新孢子
囊长出后,用毛刷刷下孢子囊,分别浸于 dH2O、
0． 01%的 H2O2、 0. 1 mmol·L -1的 SNP、1. 0 mmol
·L -1的 cPTIO和 2. 0 mmol·L -1的 AsA溶液中,
静置不同的时间后用载玻片萌芽法测定孢子囊生
活力。
1. 2. 3　 NO 和 H2O2 含量测定 　 NO 含量测定采
用试剂盒法(南京建成生物工程研究所),取 0. 1 g
处理过的叶片加 0. 9 % NaCl 0. 9 mL,匀浆;12 000
× g离心 10 min,取上清,沸水浴 5 min;12 000 × g
离心 5 min,取上清,稀释 10 倍用于检测。 在 550
nm波长下,测定吸光度值,按照试剂盒说明,计算
出组织中的 NO水平。
参照 Kärkönen 等[11]报道的方法,取新鲜材
料,称重,加预冷丙酮研磨成浆;3 000 rpm 离心 10
min,取上清,依次加入硫酸钛和浓氨水;5 000 rpm
离心 10 min 后弃上清,洗涤 5 次,用硫酸溶解沉
淀,在 415 nm波长下,测定吸光度值,计算组织中
H2O2 的含量。
1. 2. 4 　 DAB 染色 　 取经 dH2O、H2O2、AsA、SNP
和 cPTIO处理的叶片,接种霜霉病菌 48 h,浸泡在
0． 1 %DAB染液中,确保叶片被染液完全浸没,然
后抽真空 30 min,置于黑暗处室温保存 15 h( 出现
棕色斑),所染叶片用 80 %酒精于 60℃脱色 15 ~
20 min,检测过敏性坏死反应。
1. 2. 5　 蛋白酶活性测定　
(1)POD活性测定[12] 　 pH 7. 2 PBS(磷酸缓
冲液)0. 7 mL +酶液 0. 3 mL +愈创木酚 3. 0 mL,
在 470 nm波长下,测定吸光度值。
(2)PAL 活性测定 　 缓冲液 2. 9 mL + 0. 02
mol·L -1苯丙氨酸 1. 0 mL +酶液 0. 1 mL,40℃
水浴中反应 10 min,HCl终止反应,在 290 nm波长
下,测定吸光度值。
(3)Glu活性测定　 取待测样品 0. 3 g,加 5 倍
量的 0. 05 mol·L -1乙酸钠缓冲液(pH 5. 0),研磨
匀浆,15 000 × g离心 15 min,上清液在 4℃下透析
过夜。 取上清液为待测酶液,以昆布多糖为反应底
物,按照 Shi 等[13]的方法测定 β-1,3-葡聚糖酶活
性,以每克鲜组织每分钟产生 1 μg 还原糖的酶量
为一个酶活性单位(U)。
(4) Cht 活性测定 　 取待测样品 0. 5 g,于
-15℃冷冻固定后加 3. 0 mL 预冷的磷酸缓冲液
(pH 6. 4),匀浆后冷提 2 h,10 000 × g 离心 10 min,
上清液为待测酶液,取酶液 0. 5 mL,与 0. 5 mL胶状
几丁质(5 mg·mL -1)及 0. 1 mL 缓冲液于 40℃保
湿 1 h,流水冷却、离心,取上清液 0. 5 mL,加 0. 8
mol·L -1四硼酸钾(K2B4O7)0. 1 mL,沸水中加热 3
min,冷却后加对二甲氨基苯甲醛(DMAB)试剂 3
mL,混匀,37℃保湿 20 min,冷却后测 OD585值。 根
据标准曲线计算反应液中 N-乙酰葡萄糖胺的含量,
以每小时每克鲜组织从胶状几丁质中释放 1 μg N-
乙酰葡萄糖胺为一个酶活性单位(U)。
1. 2. 6 　 数据统计方法　 测定结果用 DPS 数据处
理系统作方差分析。 数据均源于 3 次独立的试验
结果。
2　 结果与分析
2. 1　 葡萄品种赤霞珠、西拉和 Fredonia 室内离
体叶片接种霜霉病菌的抗性表现
　 　 为探明接种霜霉病菌后不同葡萄品种的抗性
表现,观测了接种霜霉病菌对赤霞珠、西拉和 Fre-
donia感病情况的影响。 表 1 显示,接种霜霉病菌
后,3 个葡萄品种赤霞珠、西拉和 Fredonia 均感病,
但不同抗病性的品种间存在显著差异,Fredonia感
Table 1　 Resistance of leave discs of 3 grape cultivars after inoculation with Plasmopara viticola
Grape cultivar
Number of
inoculated leave
Number of
infected leave
Incidence / %
Average disease
index
Cabernet Sauvignon 97 79 81. 44 53. 32 ±7. 50(A)
Syrah 115 49 42. 61 24. 79 ±8. 54(B)
Fredonia 108 7 6. 48 5. 95 ±3. 03(C)
875
　
　 6 期 　 林志强,等:NO和 H2O2 提高葡萄抗霜霉病的生理作用机制
病率和病情指数最低,分别为 6. 84 %和 5. 95,对
霜霉病抗性最强,属高抗品种;赤霞珠感病率和病
情指数最高,分别为 81. 44 %和 53. 32,抗性最弱,
属高感品种。
2. 2 　 NO 和 H2O2 参与调控霜霉病菌感染葡萄
过程
2. 2. 1　 接种霜霉病菌后葡萄品种赤霞珠、西拉和
Fredonia叶片中内源 NO和 H2O2 含量变化　 为了
证明 NO 和 H2O2 参与葡萄对霜霉病的应答,检测
了接种霜霉病菌后葡萄叶片中 NO 和 H2O2 含量
的变化。 图 1 表明,在测定时间范围内,未受到霜
霉病菌侵染的葡萄叶片内源 NO含量无显著变化,
接种霜霉病菌后 3 个葡萄品种叶片内源 NO 含量
均有猝发现象。 与感病品种赤霞珠相比,高抗品种
Fredonia的 NO猝发最早,接种 6 h时达最大值,且
变化最大,NO含量增加 47. 56 % (P <0. 01);西拉
和赤霞珠在接种 18 h 后 NO 水平达最大值(P <
0． 05),表明 NO参与霜霉病菌侵染葡萄叶片过程。
Fig. 1　 Dynamics of endogenous NO level in
grape leaves after inoculation with
Plasmopara viticola
“*”: P <0. 05; “**”: P <0. 01.
　 　 由图 2 得知,未接种霜霉病菌的葡萄叶片内源
H2O2 含量随时间延长无显著变化,且品种间差异
不显著。 接种霜霉病菌后 3 个葡萄品种叶片的内
源 H2O2 含量均有猝发现象,西拉和赤霞珠叶片
H2O2 含量分别在 2 h和 3 h时达最大值,抗性品种
Fredonia的叶片 H2O2 猝发较早且含量变化最显
著,接种 1 h 后达最大值,增加 29. 25 % ,4 h 后
H2O2 含量再次升高,增加 17. 33 % 。
Fig. 2　 Dynamics of H2O2 level in grape lea-
ves after inoculation with Plasmopara
viticola
“**”: P <0. 01.
2. 2. 2　 NO和 H2O2 供体及清除剂对赤霞珠霜霉病
抗性影响　 为进一步证实 NO和 H2O2 参与葡萄抗
霜霉病过程,用 NO的供体 SNP和清除剂 cPTIO预
处理高感葡萄品种赤霞珠叶片,然后接种霜霉病菌。
结果表明:在一定浓度范围内 SNP可不同程度降低
赤霞珠感病率,增强了其对霜霉病的抗性,其中以
0. 1 mmol·L -1 SNP 处理效果最显著,与对照相比
感病率和病情指数显著降低(P <0． 01);用 NO的清
除剂 cPTIO处理后,赤霞珠的感病率显著增大,以
1. 0 mmol·L -1 cPTIO 处理的作用最显著,感病率
增加 11. 70 % (P <0. 01)(图 3)。
图 4 表明,在测定浓度范围内,不同浓度的
H2O2(0. 01 % 、 0. 1 %和 1. 0 % )处理均能降低赤
霞珠叶片感病率,其中以 0. 1 % H2O2 处理作用最
显著(P < 0. 05),平均病情指数降低 14. 15 % 。
H2O2 清除剂 AsA(0. 2、 2. 0 和 20. 0 mmol·L -1)
处理后接种葡萄霜霉病菌的赤霞珠叶片出现病斑
的时间比对照平均提前 1 ~ 2 d;感病率和平均病情
指数显著增大(P < 0. 05)。 综合图 1、图 3 和图 4
的结果,证明 NO 和 H2O2 参与葡萄抵御霜霉病的
过程。
975
　
植物病理学报 41 卷
Fig . 3　 Effects of SNP and cPTIO on resistance of Cabernet Sauvignon
against Plasmopara viticola
A: dH2O; B1: 0. 01 mmol·L -1 SNP; B2: 0. 1 mmol·L -1 SNP; B3: 1. 0 mmol·L -1 SNP;
C1: 0. 1 mmol·L -1 cPTIO; C2: 1. 0 mmol·L -1 cPTIO; C3: 10. 0 mmol·L -1 cPTIO; “**”: P <0. 01.
Fig. 4　 Effects of H2O2 and AsA on resistance of Cabernet
Sauvignon against Plasmopara viticola
A: dH2O; D1: 0. 01% H2O2; D2: 0. 1% H2O2; D3: 1. 0% H2O2; E1: 0. 2 mmol·L -1 AsA;
E2: 2. 0 mmol·L -1 AsA; E3: 20. 0 mmol·L -1AsA; “*”: P <0. 05.
2. 2. 3　 NO和 H2O2 供体及清除剂对葡萄霜霉病
菌孢子活性影响　 NO和 H2O2 能够提高葡萄抵御
霜霉病的能力,为研究其作用机制,首先观测了不
同浓度的 NO供体 SNP、H2O2 供体 H2O2、NO清除
剂 cPTIO和 H2O2 清除剂 AsA 对霜霉病菌孢子囊
萌发的影响。 用染色活性检测方法测定孢子囊萌
芽后的存活性,结果显示低浓度的 SNP、H2O2、cP-
TIO和 AsA 对霜霉病菌孢子没有显著的杀伤作
用,而当浓度较高时,显著抑制孢子活性 ( P <
0． 01),并且浓度越大,短时间内即可降低孢子的
活性(表 2)。
为进一步证明 NO 和 H2O2 不是通过抑制孢
子活性参与对霜霉病的应答,用不同浓度的 SNP、
H2O2、cPTIO 和 AsA 预处理萌芽的霜霉病菌孢子
囊,离心并用无菌水洗去残留的处理试剂,然后用
处理后的萌发孢子囊接种健康赤霞珠叶片,测定其
对赤霞珠叶片的感病率和平均病情指数的影响。
结果表明:低浓度 SNP、H2O2、cPTIO 和 ASA 处理
后的孢子囊不能改变赤霞珠的感病情况,感病率和
病情指数均无明显变化;而当浓度较高时,感病率
和平均病情指数迅速降低,且达到显著水平(P <
0. 01,表 3)。 由此进一步说明,低浓度的 NO 和
H2O2 抵御葡萄霜霉病的机制,不是通过抑制霜霉
病菌孢子囊活性而起作用的。
085
　
　 6 期 　 林志强,等:NO和 H2O2 提高葡萄抗霜霉病的生理作用机制
Table 2　 Effects of SNP, H2O2, cPTIO and AsA on sporangia
germination of Plasmopara viticola / %
Treatment
Time / min
0 15 30 60 90
dH2O　 　 　 　 82 ± 1. 0 84 ±1. 3 83 ±1. 8 82 ±2. 0 88 ±2. 1
SNP(mmol·L -1)0. 01 85 ±2. 3 79 ±1. 3 81 ±2. 1 88 ±0. 5 89 ±1. 8
0. 1 86 ±0. 5 83 ±1. 0 81 ±1. 5 79 ±2. 1 79 ±1. 4
1. 0 82 ±2. 1 58 ±1. 9 39 ±2. 2 41 ±3. 2 38 ±2. 1
H2O2 / % 0. 01 84 ±2. 3 81 ±1. 8 88 ±2. 2 87 ±1. 8 82 ±1. 3
0. 1 79 ±1. 9 83 ±2. 0 81 ±1. 0 79 ±1. 5 81 ±2. 1
1. 0 82 ±0. 5 36 ±2. 1 38 ±1. 5 41 ±1. 9 36 ±2. 1
cPTIO (mmol·L -1)0. 1 83 ±2. 1 85 ±1. 5 78 ±0. 5 76 ±1. 8 80 ±1. 9
1. 0 78 ±1. 5 79 ±0. 5 81 ±1. 9 73 ±2. 1 79 ±0. 9
10. 0 71 ±2. 0 46 ±1. 0 37 ±1. 6 33 ±0. 9 36 ±1. 9
AsA (mmol·L -1)0. 2 83 ±0. 5 81 ±1. 3 89 ±1. 6 84 ±2. 1 78 ±2. 1
2. 0 79 ±1. 5 76 ±0. 9 78 ±2. 4 73 ±3. 4 73 ±1. 9
20. 0 67 ±2. 1 39 ±0. 9 35 ±1. 5 36 ±1. 0 33 ±2. 4
Table 3　 Effects of Plasmopara viticola after treatment with SNP, H2O2,
cPTIO and AsA on incidence of Cabernet Sauvignon
Treatment
Number of
inoculated leave
Number of
infected leave
Incidence / %
Average disease
index
dH2O　 　 　 　 103 84 81. 55 51. 21 ±3. 50
SNP(mmol·L -1)0. 01 107 82 76. 64 49. 38 ±2. 19
0. 1 96 70 72. 92 48. 32 ±2. 08
1. 0 115 41 35. 65 23. 21 ±7. 28
H2O2 / % 0. 01 104 86 82. 69 52. 38 ±1. 32
0. 1 98 73 74. 49 48. 79 ±2. 83
1. 0 112 46 41. 07 20. 32 ±1. 50
cPTIO (mmol·L -1)0. 1 99 79 79. 80 52. 38 ±2. 54
1. 0 103 83 80. 58 53. 18 ±2. 78
10. 0 115 42 36. 52 18. 78 ±4. 83
AsA (mmol·L -1)0. 2 98 74 75. 51 48. 90 ±5. 34
2. 0 109 79 72. 48 45. 96 ±2. 91
20. 0 103 38 36. 89 17. 35 ±6. 29
　 　 综合表 2、表 3 结果得知,低浓度的 NO 和
H2O2 不是通过影响霜霉病菌孢子活性进而参与对
霜霉病的作用,它们可能作为信号分子参与葡萄对
霜霉病的应答。 因此,本研究随后所用 SNP、
H2O2、cPTIO和 AsA的浓度分别为 0. 1 mmol·L -1、
0. 1 % 、1. 0 mmol·L -1和 2. 0 mmol·L -1。
2. 2. 4　 SNP 和 H2O2 及霜霉病菌接种对赤霞珠
叶片过敏性坏死反应的影响 　 赤霞珠叶片接种
霜霉病菌 48 h,DAB 染色后观察发现,接种部位
出现少量的枯斑,说明过敏性坏死反应很微弱;
不接种霜霉病菌的叶片没有坏死斑点。 当用
SNP和 H2O2 预处理后再接种霜霉病菌,结果显
示与蒸馏水处理接种相比其枯斑数量明显增多,
且褪绿斑变成了枯死斑,叶面上出现典型的过敏
性坏死反应,H2O2 单独处理比 SNP 效果更为明
显。 当用 SNP和 H2O2 共同处理时过敏性坏死反
应更为显著,霜霉病侵染的部位出现了较为明显
的坏死斑点(图 5)。
185
　
植物病理学报 41 卷
2. 3　 NO 和 H2O2 对接种霜霉病菌的赤霞珠叶
片病程相关酶蛋白活性影响
2. 3. 1　 NO和 H2O2 对接种霜霉病菌的赤霞珠叶片
POD活性影响　 由图 6 可知,接种霜霉病菌后赤霞
珠叶片的 POD活性呈现先升高后降低的变化趋势,
处理4d时达到最大值;外施H2O2 、NO供体SNP、
H2O2 和 SNP共处理均能显著提高接种霜霉病菌的
赤霞珠叶片 POD活性,且 H2O2 和 SNP共处理效果
最显著,3 d时 POD活性最高(P <0． 01);一定浓度
的 H2O2 和 NO清除剂 AsA及 cPTIO单独处理叶片
POD活性无明显变化,但可以轻微抑制接种霜霉病
菌所引起的 POD活性升高。
Fig. 5　 Induction of hypersensitive response of Cabernet Sauvignon leaves to
Plasmopara viticola infection by SNP and H2O2
a: dH2O; b: dH2O + P. viticola; c: H2O2 + P. viticola; d: SNP + P. viticola; e: SNP + H2O2 + P. viticola.
Fig. 6　 Effects of NO, H2O2, cPTIO , AsA and Plasmopara viticola inoculation on
activities of POD in Cabernet Sauvignon leaves
A: H2O2, AsA and P. viticola inoculation on the activities of POD in Cabernet Sauvignon leaves;
B: NO, cPTIO and P. viticola inoculation on the activities of POD in Cabernet Sauvignon leaves. “**”:P <0. 01.
285
　
　 6 期 　 林志强,等:NO和 H2O2 提高葡萄抗霜霉病的生理作用机制
2. 3. 2　 SNP和 H2O2 对接种霜霉病菌的赤霞珠叶
片 PAL活性影响 　 图 7 表明,葡萄霜霉病菌侵染
的赤霞珠叶片其 PAL活性先升高后降低,处理 5 d
时 PAL活性达到最大值。 外施 SNP、H2O2 及 SNP
和 H2O2 共处理后接种霜霉病菌的赤霞珠叶片
PAL活性与单独接种霜霉病菌的对照相比都有不
同程度的增加,其中 H2O2 与 SNP 共处理 PAL 活
性增幅最大,处理 3 d时 PAL活性与 0 d相比增加
102. 99 % (P < 0． 01) (图 7);与 dH2O 处理比较,
单独外施 ASA和 cPTIO对 PAL活性影响不明显;
但能够部分降低霜霉病菌侵染所引起的 PAL 活性
的变化。
2. 3. 3　 SNP和 H2O2 对接种霜霉病菌的赤霞珠叶
片 Glu活性影响　 在测定时间段内,随着接种霜霉
病菌时间延长赤霞珠叶片内 Glu 活性亦表现出先
升高后降低的变化趋势 (图8 ) 。SNP 、H2 O2及
Fig. 7　 Effects of NO, H2O2 and Plasmopara viticola inoculation on activities of PAL
in Cabernet Sauvignon leaves
A: H2O2, AsA and P. viticola inoculation on activities of PAL in Cabernet Sauvignon leaves;
B: NO, cPTIO and P. viticola inoculation on activities of PAL in Cabernet Sauvignon leaves. “**”: P <0. 01.
Fig. 8　 Effects of NO, H2O2, cPTIO, AsA and Plasmopara viticola inoculation on
activities of Glu in Cabernet Sauvignon leaves
A: H2O2, AsA and P. viticola inoculation on activities of Glu in Cabernet Sauvignon leaves;
B: NO, cPTIO and P. viticola inoculation on activities of Glu in Cabernet Sauvignon leaves. “**”: P <0. 01.
385
　
植物病理学报 41 卷
Fig. 9　 Effects of NO, H2O2, cPTIO, AsA and Plasmopara viticola inoculation on
activities of Cht in Cabernet Sauvignon leaves
A,C: Effects of H2O2, AsA and P. viticola inoculation on activities of Cht in Cabernet Sauvignon leaves;
B,D: Effects of NO, cPTIO and P. viticola inoculation on activities of Cht in Cabernet Sauvignon leaves. “**”: P <0. 01.
SNP和 H2O2 共处理后接种霜霉病菌的赤霞珠叶
片 Glu活性与单独接种霜霉病菌的对照相比都有
不同程度的增加,其中外施 SNP 与 H2O2 4 d 时赤
霞珠叶片的 Glu活性分别增加 50. 25%和 58. 03%
(P <0. 01),而 AsA 和 cPTIO 可以降低感染霜霉
病后葡萄品种赤霞珠叶片 Glu活性的升高,表明一
定浓度的 NO和 H2O2 可提高 Glu活性。
2. 3. 4　 SNP和 H2O2 对接种霜霉病菌的赤霞珠叶
片 Cht活性影响　 几丁质酶是一种重要的病程相
关蛋白。 接种霜霉病菌后赤霞珠叶片中几丁质内
切酶(图 9-A,B)和外切酶(图 9-C,D)活性先升高
后降低,接种 4 d 时活性达最大值。 SNP、H2O2 及
SNP和 H2O2 共处理后接种霜霉病菌的赤霞珠叶
片 Cht活性增高幅度显著(P < 0. 01)大于单独接
种霜霉病菌的对照(图 9);ASA 和 cPTIO 处理可
大大降低霜霉病菌所引起的 Cht 活性的增加
(P <0. 01),表明 NO 和 H2O2 的作用与提高赤霞
珠几丁质酶活性相关。
485
　
　 6 期 　 林志强,等:NO和 H2O2 提高葡萄抗霜霉病的生理作用机制
3　 讨论
以对霜霉病具有不同抗性的 3 个葡萄品种赤
霞珠、西拉和 Fredonia 为材料,研究 NO 和 H2O2
在调控葡萄抵御霜霉病菌感染过程中的作用和
机制。 研究发现:接种霜霉病菌后 3 个品种内源
H2O2 和 NO 含量均有猝发现象,抗性强的品种
Fredonia H2O2 和 NO 猝发早;低浓度的 SNP 和
H2O2 对霜霉病菌孢子活性影响不大,但能显著
降低赤霞珠感病率,减小病情指数;NO 及 H2O2
的清除剂 cPTIO和 AsA处理赤霞珠叶片时,葡萄
感病严重,平均病情指数增强,这与 Zhang 等[14]
的研究结果一致。 由此推测:低浓度的 H2O2 和
NO不是直接杀菌,而是作为信号物质参与调控
葡萄抵御霜霉病菌侵染过程,进一步确证了本实
验室前期的研究结果[5] 。
本试验结果显示:NO 和 H2O2 均能显著提高
霜霉病菌侵染的赤霞珠叶片病程相关蛋白酶
(POD、PAL、Cht和 Glu)活性,增强葡萄对霜霉病
的抗性,并且 NO 和 H2O2 共同作用时效果最显
著。 一定浓度的 NO 及 H2O2 的清除剂 cPTIO 和
AsA单独处理对赤霞珠葡萄叶片的病程相关蛋白
酶活性没有明显影响,但对霜霉病菌侵染后叶片不
同病程相关蛋白酶活性存在差异,其中 cPTIO 和
AsA能大大抑制霜霉病所引起的几丁质酶活性的
升高,说明几丁质酶可能是 NO 和 H2O2 作用的主
要下游蛋白。 Zhang 等[15]的研究表明,SNP 释放
的 NO可降低月季切花萎蔫率,抑制 PAL 活性升
高,使月季插花寿命延长。 本研究表明,在葡萄感
染霜霉病菌过程中,H2O2 和 NO 都能不同程度提
高赤霞珠葡萄叶片 PAL活性,且 NO比 H2O2 作用
显著,在霜霉病菌侵染过程中 PAL 活性受 NO 调
控升高,触发葡萄防卫反应,增强对霜霉病抗性,这
与 Hao等[16]研究结果较一致,而与 Zhang 等[15]研
究结果不同,其原因可能是不同生理过程中 NO对
PAL活性的影响存在差异。
据本研究结果推测:葡萄受到霜霉病菌侵染
后,NO和 H2O2 猝发,诱导 POD、PAL、Cht 和 Glu
活性增强以抵御霜霉病菌的入侵。 植物体可以通
过酶途径和非酶途径产生 NO[17],H2O2 亦可以经
过细胞壁过氧化物酶、NADPH 氧化酶和光合电子
传递过程等形成[18],外源 NO 和 H2O2 处理能够诱
导 PAL、PR-1、GST 和 CHS 等抗病和防御相关基
因的转录,提高植物抗性[10,18]。 葡萄抵御霜霉病
过程中 NO 和 H2O2 的来源怎样? 在信号转导链
中二者是否存在上下游关系? NO和 H2O2 诱导葡
萄叶片 POD、PAL、Cht 和 Glu 活性增强的机制是
什么? 尚需要提供分子和细胞水平上的证据,进一
步证明二者与几丁质酶之间的关系。 NO 和 H2O2
在抵御病原菌侵染过程中其作用机制是否存在差
异? 中间是否有其他信号组分的参与? NO 和
H2O2 之间是否存在相互作用? 这些问题都有待进
一步研究证实。
参考文献
[1] 　 Srivastava N, Gonugunta V, Puli M, et al. Nitric
oxide production occurs downstream of reactive oxygen
species in guard cells during stomatal closure induced
by chitosan in abaxial epidermis of Pisum sativum[J] .
Planta, 2009, 229(4): 757 -765.
[2] 　 Shi F M, Li Y Z. Verticillium dahliae toxins-induced
nitric oxide production in Arabidopsis is major depen-
dent on nitrate reductase[ J] . BMB Rep. , 2008, 41
(1): 79 -85.
[3] 　 Shi F M, Yao L L, Pei B L, et al. Cortical microtu-
bule as a sensor and target of nitric oxide signal during
the defence responses to Verticillium dahliae toxins in
Arabidopsis[J] . Plant Cell Environ. , 2009, 32(4):
428 -438.
[4] 　 Fan B, Shen L, Liu K, et al. Interaction between ni-
tric oxide and hydrogen peroxide in postharvest tomato
resistance response to Rhizopus nigricans[ J] . J. Sci.
Food Agric. , 2008, 88(7): 1238 -1244.
[5] 　 Peng X L, Xu W T, Wang Y, et al. Mycotoxin Och-
ratoxin A-induced cell death and changes in oxidative
metabolism of Arabidopsis thaliana [ J] . Plant Cell
Rep. , 2010, 29(2): 153 - 61.
[6] 　 Wu Y Q, Luo X M, Duan C J, et al. Determination
of elicitation of hypersensitive response on nonhost
plants by Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( in Chi-
nese) [ J] . J. Guangxi Agric. Sic. , 2007, 38 (6):
631 -633.
[7] 　 Patykowski J, Urbanek H. Activity of enzymes related
to H2O2 generation and metabolism in leaf apoplastic-
fraction of tomato leaves infected with Botrytis cinerea
[J] . J. Phytopathol. , 2003, 151(3): 153 -161.
585
　
植物病理学报 41 卷
[8] 　 Lin Z Q, Li X D, Hou L X, et al. Changes of signal
substances in grape cultivars in response to Plasmopara
viticola ( in Chinese) [ J] . Plant Protection(植物保
护), 2010, 36(2): 50 -55.
[9] 　 Sha Y X, Wang G Z, Fan Z Q. Classification on the
resistance of different wine grape cultivars to downy
mildew ( in Chinese) [ J] . Acta Agriculturae Boreali-
occidentalis Sinica(西北农业学报), 2006, 15 (5):
114 -117.
[10] Desaymard P. Notations et methodes de notation en
Phytopharmacie[J] . Phytiatrie Phytopharmacie, 1968,
(2): 163 -173.
[11] Kärkönen A, Warinowski T, Teeri T H, et al. On the
mechanism of apoplastic H2O2 production during lignin
formation and elicitation in cultured spruce cells-perox-
idases after elicitation[J] . Planta, 2009, 230(3): 553
-567.
[12] Fang Y L, Song S R, Zhang Y F, et al. Relationship
of downy mildew resistance with leaf POD and PPO
activities of different grapevine varieties ( in Chinese)
[J] . Acta. Bot. Boreal. -Occident. Si. (西北植物学
报), 2007, 27(2): 392 -395.
[13] Shi Y M, Yan J Q, Fei X N, et al. Induced by TMV
infection of tomato purification and activity of Glu ( in
Chinese)[J] . Acta Phytophysiologica Sinica(植物生
理学报), 1993, 19(4):333 -338.
[14] Zhang L J, Song G Z, Bai S, et al. Effect of exoge-
nous H2O2 on germination rate and activities of main
antioxi-dase in soybean (G lycine m ax L. ) seedlings
under sow temperature( in Chinese) [J] . Soybean Sci-
ence(大豆科学), 2008, 27(1): 97 -101.
[15] Zhang S Y, Rao J P, Gao H. Effects of nitric oxide on
ethylene synthesis and metabolism of cut rose during
vase ( in Chinese) [ J] . Journal of Northwest A & F
University(西北农林科技大学学报), 2007, 35
(11): 171 -175. 180.
[16] Hao G P, Du X H, Sh R J. Nitric oxide accelerate the
suspension cell growth and flavonoids production of
Ginkgo biloba L. ( in Chinese)[J] . Acta Bot. Boreal.
Occident. Si. (西北植物学报), 2007, 27(2): 272 -
277.
[17] Besson-bard A, Pugin A, Wendehenne D. New in-
sights into nitric oxide signaling in plants[ J] . Annu.
Rev. Plant Biol. , 2008, 59(1): 21 -39.
[18] Gonzalez-Teuber M, Pozo M J, Muck A, et al. Glu-
canases and chitinases as causal agents in the protection
of Acacia extrafloral nectar from infestation by phyto-
pathogens[ J] . Plant Physiol. , 2010, 152: 1705 -
1715.
[19] Zhang Z, Hao J, Zhao Z, et al. Beta-Arrestins facili-
tate ubiquitin-dependent degradation of apoptosis sig-
nal-regulating kinase 1 ( ASK1 ) and attenuate H2O2 -
induced apoptosis[ J] . Cell Signal, 2009, 21 (7 ):1195 -
1206.
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