全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""()"!*
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#
!(!$%!("+
收稿日期$
!"#$("(!$
%修改稿收到日期$
!"#$(##(#*
基金项目$贵州省农业科学院研究生科研创新基金
作者简介$罗昌国"
#,)&
#!男!博士!主要从事果树抗病基因工程和分子生物学研究&
-(./01
$
12345/6
77
23
7
8
!
!#46943.
"
通信作者$章
!
镇!教授!博士生导师!主要从事果树分子生物学研究&
-(./01
$
85/6
7
85
!
6
:
/29;<2946
富士苹果
1.2345!"6
基因克隆及其
对白粉病的抗性分析
罗昌国#!袁启凤#!裴晓红#!吴亚维#!郑
!
伟#!章
!
镇!"
"
#
贵州省果树科学研究所!贵阳
**"""+
%
!
南京农业大学 园艺学院!南京
!#"",*
#
摘
!
要$
!"#$
是植物抗病相关的一个大转录因子家族基因!为了揭示
!"#$)"
基因在调控白粉病抗性方面的
作用!以富士苹果"
%&()*+,-)./0&=3>?594@9A2
:
0
#为试材!利用特异引物进行
BC(DEB
基因克隆!并用实时荧光
定量
DEB
方法分析组织中基因的表达及接种苹果白粉菌和用
#..31
F
&#水杨酸"
GH
#喷施处理后对基因表达的
影响&结果表明$"
#
#克隆到的片段长度为
#!)"I
J
!包含一个完整的开放阅读框!长
#""!I
J
!编码
$$)
个氨基酸!
其氨基酸序列与
1.!"#$)"
(
23!"#$#
)
!
)
$
等
%
个序列一致性为
)%9,+K
%该基因与拟南芥
1.!"#$)"
同源!
故命名为
%*!"#$)"4
!
L;6=/6?
登录号为
MN##!,"
&"
!
#基因表达分析表明!
%*!"#$)"4
在苹果根(茎(叶(花
均有表达!其中根(叶(花中表达量基本相当!茎中表达量最低&"
$
#该基因明显受苹果白粉菌和
GH
的强烈诱导表
达且持续时间较长!并且两者表达趋势相同(出现最高表达量的时间相近&研究推测!富士苹果容易感白粉病的主
要原因可能与
%*!"#$)"4
的持续长时间的高表达有关&
关键词$苹果%
OBPQ
转录因子%白粉病%抗病性%水杨酸
中图分类号$
R%*
%
R%,
文献标志码$
H
#$%&&
(
%)1.2345!"6*+&+&,-
.
/
00
$+
1&23456+5
0
%&5+4%7%82+9
:
;$2+8<49+55
FSTE5/6
77
23
#
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7
#
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D-WN0/3536
7
#
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7
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7
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J
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7
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J
36[;\3
J
3X<;>
]
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JJ
1;9%&()*+,-)./0&
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7
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7
I
]
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J
\036DEB/.
J
10V04/\036I
]
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7
[
J
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J
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]
806
77
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J
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J
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7
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F
&#
GH
"
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#
9
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#
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J
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7
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J
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J
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7
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7
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J
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J
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J
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"
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J
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J
3X<;>
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J
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J
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%
J
3X<;>
]
.01<;X
%
<0[;/[;>;[0[\/64;
%
[/104
]
104/40<
"
GH
#
!!
苹果白粉病*
5+*+)
7
8&-9&-(0+.9/08&
"
-19;-@9
#
G/1.36
+是苹果叶片主要病害之一!危害范围
遍及世界各地&中国云(贵(川(陕西关中(甘肃天
水(山西南部等是苹果白粉病的重灾区!尤其在主栽
品种富士和早熟品种,美国
%
号-较为严重*#(!+&深
入了解苹果白粉病的发生流行规律(发掘抗病相关
基因(培育抗病品种是解决苹果白粉病的有效方法&
!"
世纪
+"
年代
P06
7
5等就开始关注苹果抗白
粉病基因资源!并在西伯利亚海棠"
%&()9+4().&
#和
祖密海棠"
%&();(,/
#发现了对苹果白粉病具有高
度抗性的基因
5
#
和
5
!
*
#
!
$
+
&后来还发现了
56<
(
56*
(
56,
等苹果白粉病抗性相关的基因*)+&植物
的
!"#$
基因直到
#,,)
年才被发现和命名*+!此后
有关
!"#$
基因报道越来越多!并发现其主要功能
之一是与植物的抗病性和生长相关*+(+&
!"")
年
-4?;
]
等才认识到小麦
!"#$
基因与白粉病抗性之
间 关 系*%+!
!""
年
G5;6
等 进 一 步 证 实 了 大 麦
23!"#$#
(
23!"#$!
编码的蛋白通过与
%=1
基
因编码的蛋白互作来调控白粉病抗性的机理*,+&
!"#"
年
D/6<;
]
等也证实了与大麦
23!"#$#
(
23!"#$!
同源的拟南芥
1.!"#$#%
(
1.!"#$)"
也参与了白粉病抗性的调控*#"+&白粉病除了涉及上
述抗性相关基因层面外!还有另一个与之密切相关的
信号物质水杨酸"
GH
#!这一点已在葡萄的白粉病研
究上有所体现*##(#!+&湖北海棠上已报道了一个与抗
性相关的
%8!"#$)"4
基因*#$+!本实验主要开展
了富士苹果上与
%8!"#$)"4
同源的
!"#$
基
因在白粉病抗性方面初步的研究!希望对增进了解
基因调控苹果白粉病抗性的分子机制方面有所
裨益&
#
!
材料和方法
@9@
!
材
!
料
试验于
!"##
"
!"#!
年在贵州省果树科学研究
所进行!供试材料为富士苹果"
%&()*+,-)./0&
=3>?594@9A2
:
0
#&
@9A
!
基因克隆与序列分析
采用
BC(DEB
方法从叶片的
4` UH
模板中克
隆目的基因&以拟南芥"
19&4/*+
7
)/).8&/&>&
#
1.6
!"#$)"
核苷酸为种子序列通过
=1/[\6
在苹果基
因组数据库"
5\J
$))
7
;63.04[9>;[;/>4590/[./90#
中和
UE=W
"
5\J
$))
XXX964I0961.96059
7
3@
)
7
;6(
I/6?
)#中分别查找到苹果较相近核苷酸序列和苹
果属植物相似
-GC
序列!采用
D>;.0;>*
设计引物!
经筛选后最终获得基因全长克隆用的特异引物!上
游引物
a
*b(CCHHCCCECLEHH(
HCCLEHHLEE($b
#(下游引物
a
*b(HHHHLHHHLLHCHHCLEECHECE($b
#&
DEB
反应体系为模板
4` UH#
#
F
"
*"6
7
#
F
&#
#!
#"c
DEB=2VV;>!9*
#
F
!
a
7
E1
!
#9*
#
F
"
!*..31
F
&#
#!
F
"
!9*..31
F
&#
#!上下游引物
各
#9"
#
F
"
#""6
7
#
F
&#
#!
#9"S>?&
@
酶!用超纯
水补足至
!*
#
F
&
DEB
程序为
,)d).06
%
,)d
$"[
!
*+d$"[
!
!d!.06
!
$*
个循环%
!d
延伸
#".06
&取
!"
#
F
的
DEB
产物!在
#9"K
琼脂糖凝
胶电泳分析&目的片段回收(连接(克隆参照相应说
明书!随机挑取
*
个以上单菌落进行测序"测序结果
正确且结果之间一致性很好的序列
*
个或以上#&
经测序后在
=03Na!9!
软件上分析!预测其编码
区和编码蛋白!并在
UE=W
上进行
=1/[比对分析&
@9B
!
基因表达材料处理和组织表达分析
组织表达$取
#"
年生左右富士苹果根(茎(叶(
花的样品!根系为直径
"9*4.
以下细根!叶片为成
熟叶片"枝条顶部自下
)
"
*
叶#&
白粉病处理$用苹果白粉菌"
5+*+)
7
8&-9&-(6
0+.9/08&
#接种
!
年生的盆栽苹果苗!分别于
"
(
+
(
%
(
#"
(
!)
(
)%5
后取叶样&
GH
处理$用
#..31
F
&#的
GH
喷施
!
年生的
盆栽苹果苗!于
"
(
!
(
+
(
#"
(
!!
(
)+5
后取叶样&
上述试验每处理
$
次重复&采用
ECH=
法分
别提取相应样品的
BUH
!并反转录成单链
4` UH
作为下一步的
DEB
模板用&
@C!
!
荧光定量
7#6
分析
分别以组织(苹果白粉菌和
GH
处理的单链
4`(
UH
为模板!采用
H=W$""
实时荧光定量系统进行
基因表达分析&实时荧光定量
BC(DEB
上游引物
为
R(a
*b(ELHHCHHLCEEEHHCHLC(
LE($b
#(下游引物为
R(a
*b(ECECHH(
LCLHCHHEHHLLCHLE($b
#&内参基因引物上(
下游引物分别为
a<\2I2106A
"
*b(HLLHCLECH(
$%$!
#!
期
!!!!!!!!!!
罗昌国!等$富士苹果
%*!"#$)"4
基因克隆及其对白粉病的抗性分析
EHLEELHCLHL($b
#和
a<\2I2106 B
"
*b(LE(
ELHHLHHECLHELHLHHCE($b
#&反应体系为$
模板
4` UH#
#
F
"
#"6
7
#
F
&#
#!上下游引物分别
为
"9!*
#
F
!
GQ=B
$
59-,/ABA?&
@
Ca
"
C/P/B/
#
#"
#
F
!
<
T%9*
#
F
&反应程序为$
,*d
!
).06
%
,*d!"[
!
+"d!"[
!
!d)"[
!
)"
个循环&数据
分析采用
H=W$""[
]
[\;.
软件和
!
&
##
E\的方
法*#)+&每处理重复检测
$
次&
!
!
结果与分析
AC@
!
1.2345!"6
克隆及序列分析
基因扩增片段主带十分明显!大小约
#$""I
J
左
右"图
#
!
H
#&经进一步克隆测序表明目的片段具有
一个完整的开放阅读框!长度为
,,,
个核苷酸!编码
$$$
个氨基酸"图
!
#&其推导的氨基酸序列
U
端具有
FY
和
OBPQLRP
的保守结构域!
E
端具
E^
)(*
E^
!!(!$
Z^ Z
保守结构域!属于
!"#$
家族基因
L>32
J%
/
成员&基因进化分析表明!其与湖北海棠
%86
!"#$)"4
(杨树
5.!"#$,
(葡萄
C3!"#$$
(拟南芥
1.!"#$)"
(水稻
D)!"#$+
"水稻基因组网
5\J
$))
>04;9
J
1/6\I0313
7]
9.[29;<2
)
06<;^9[5\.1
中登录号为
FTE
.
T[",
7
!*"+"
!本文记为
T[",
7
!*"+"
#及大麦
23!"#$#
(
23!"#$!
(
23!"#$$
等基因在起源
上有较近关系"图
$
!
H
#&氨基酸序列比对结果表明
%8!"#$)"4
与其他
+
种植物的
%
个同源基因之间
的一致性为
)%9,+K
"图
$
!
=
#&鉴于模式植物拟南芥
基因组研究比较深入!故命名为
%*!"#$)"4
!
L;6(
=/6?
登录号为
MN##!,"
&进一步的蛋白三级结构显
示!
a
H\OBPQ)"
结构十分相似!具
有类似的
)
个
&
折叠"图
#
!
=
(
E
#&
ACA
!
1.2345!"6
在组织中的表达特性
为了解基因在组织中所扮演的角色!采用实时
荧光定量
DEB
对
%*!"#$)"4
在组织中的表达情
况进行分析&结果表明!其在根(茎(叶(花组织中都
有表达!除茎表达量较低外!其他几个组织中基因表
达量基本相当!而茎的表达量仅为叶片的
#
)
)"
"图
)
#&说明了
%*!"#$)"4
参与了这些组织的生命
活动!尤其在植物的抗性中&植物的茎生命活动相
对较简单!参与抗性活动相对较少%而叶(花(根的生
命活动复杂!参与植物的抗性则相对较多&
%*6
!"#$)"4
叶(花(根中表达量比茎中高!预示着该
基因在苹果抗性中的积极作用&
ACB
!
1.2345!"6
受苹果白粉病菌诱导表达特点
!"#$
调控植株对白粉病的抗性在大麦*,+和
拟南芥*#"+上已经证实!富士苹果极易受到白粉病的
图
!
!
富士苹果
%*!"#$)"4
基因的
核苷酸系列及推导的氨基酸序列
A0
7
9!
!
A21(1;6
7
\5[;
_
2;64;3V%*!"#$)"4
3V%&()*+,-)./0&=3>?594@9A2
:
0/6<0\[
<;<24;_
2;64;
图
#
!
富士苹果
%*!"#$)"4
基因克隆片段"
H
#及拟南芥
H\OBPQ)"
"
=
#和
a
E
#推导蛋白的三级结构
A0
7
9#
!
E136;<%*!"#$)"43V%&()*+,-)./0&=3>?594@9A2
:
0
"
H
#
/6<\5;\;>\0/>
]
[\>24\2>;3VH\OBPQ)"
"
=
#
/6<
J
>;<04\;
E
#
J
>3\;06
)%$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
危害!通过接种苹果白粉菌的方法分析了
%*6
!"#$)"4
在病原菌侵染过程中的作用&实时荧光
定量
DEB
分析显示$接种苹果白粉病菌后!
%*6
!"#$)"4
受到诱导上调表达!在
+
(
%
(
#"
(
!)
(
)%5
时的表达量分别为
"5
的
,
(
!!
(
)"
(
),
(
))
倍!
"5
至
!)5
表现为表达量逐渐升高的趋势!最高出现在
!)
5
!
)%5
出现下降"图
*
#&负调控植株白粉病抗性的
!"#$
如果在白粉菌入侵过程中表达量高则有利
于病原的发生流行!相反则抑制病原菌的发展&与
拟南芥*#"+和湖北海棠*#$+相比!接种白粉菌后!
%*6
!"#$)"4
的表达不但表达量高!而且持续时间长!
这可能是富士苹果易感白粉病的主要原因之一&
图
$
!
%*!"#$)"4
基因系统进化树"
H
#和氨基酸序列比对"
=
#
进化树上数值为枝展值%
a<9
苹果%
a59
湖北海棠%
D\9
杨树%
e@9
葡萄%
H\9
拟南芥%
Z@9
大麦%
T[9
水稻%图
=
中方框内示一致性大于
*K
序系
A0
7
9$
!
C5;;@312\036/>
]
\>;;3V%*!"#$)"4
"
H
#
/6<\5;0<;6\0]
3V/.063/40<[[;
_
2;64;
"
=
#
C5;
]
\>;;06<04/\;\5;I33\[\>/
J
9a<9%&()*+,-)./0&
%
a59%&()8(
7
-8->)/)
%
D\9
"
5+
7
(().+,->.+)&c5:4+-&>&
#
c5:.+,->.+)&
%
e@9C/./)3/>/
E
-9&
%
H\919&4/*+
7
)/).8&/&>&
%
Z@92+9*-(,3(
F
&9-
%
T[9D9
G
;&)&./3&9C5;
J
/6;[06<04/\;\5/\\5;0<;6\0]
X;>;.3>;\5/6*K
*%$!
#!
期
!!!!!!!!!!
罗昌国!等$富士苹果
%*!"#$)"4
基因克隆及其对白粉病的抗性分析
AC!
!
诱导
;2D6?E!"=
表达特点
GH
是一种植物白粉病抗性相关的植物激素!
进一步去分析
GH
诱导
%*!"#$)"4
表达情况表
明$
#..31
F
&#的
GH
喷施处理后!在
+
(
%
(
#"
(
!)
(
)%5
的表达量分别为
"5
的
!9,
(
*9*
(
%9+
(
!!+9#
和
+9#
倍!
!!5
表达量最高!
)+5
出现下降&
%*6
!"#$)"4
受到诱导表达的总体趋势和白粉病处理
相似!但是又有一些明显的不同之处!即
#"5
内诱
导表达比较缓和!而在
!!5
受到强烈诱导表达"图
+
#&无论直接通过接种苹果白粉菌的方式!还是间
图
)
!
%*!"#$)"4
在组织中的表达
A0
7
9)
!
C0[[2;[;^
J
>;[[0363V%*!"#$)"4
7
;6;06%&()*+,-)./0&
J
1/6\[
图
*
!
接种苹果白粉病菌后
%*!"#$)"4
表达
A0
7
9*
!
-^
J
>;[[0363V%*!"#$)"4
06>;[
J
36[;\35:-(0+.9/08&
图
+
!
GH
处理后
%*!"#$)"4
表达
A0
7
9+
!
-^
J
>;[[0363V%*!"#$)"4
06>;[
J
36[;\3;^3
7
;632[GH
接通过白粉病抗性相关的
GH
来处理!都能诱导
%*!"#$)"4
表达!说明该基因是一个调控富士苹
果白粉病抗性的关键基因&
$
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讨
!
论
植物抗病的分子机制主要体现在植物对病原菌
的免疫反应上!一是通过病原相关分子识别模式
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发植物产生相应的免疫反应
DCW
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基因对病原菌致病因子"或病
原菌效应因子#识别反应!即病原效应因子激发的免
疫反 应
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"
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下游信号通路很多!包括
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(
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(
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(
-` G#
(
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(
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(
BTG
等!不同的信号通
路有些是相对独立甚至是相互拮抗的%有些是相互
信赖(处于一个大的调控网络之中*#+&植物病原菌
按寄生的营养方式可分为活体营养型"
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J
504
#
和死体营养型"
6;4>3\>3
J
504
#!活体营养型主要依赖
于水杨酸
GH
激素的平衡来调节抗性!而死体营养
型中则依赖于茉莉酸
MH
和乙烯
-C
的积累*#%(!#+&
近年来!越来越多研究表明!
!"#$
基因在
GH
信
号通路中扮演着十分重要的角色*!"!!(!$+&本研究
中!苹果白粉菌是典型活体营养型病原菌!
%*6
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都受苹果白粉菌和
GH
诱导上调表达(
趋势也相仿!表明了该基因可能通过
GH
信号通路
来调控富士苹果的白粉病抗性&然而!
!"#$)"
基
因的表达或调控方式在不同的物种甚至近缘物种上
可能存在较大的差异!表现为时间上和强度上差异&
在拟南芥上!
OBPQ)"
是一个负调控植物白粉
病抗性的转录因子!其基因的表达会抑制抗病信号
通路
-` G#
和抗病物质亚麻荠素"
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#的合
成过程*#"+&大麦上则通过
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"
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1342[H
#来抑制
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)
!
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同
源#!进而提高其抗白粉病的能力&
aFH
是在大麦
中发现的
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"
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#抗病蛋白!具有
B
蛋白的
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在细胞质通过
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通路来识别白粉菌"
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#的致病效应因子
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!继
而将
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与位于细胞核中的
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联系
起来&
23OBPQ#
)
!
在
DCW
中亦起负调控的作用!
因此
OBPQ
就将两抗病信号通路
-CW
和
DCW
联系
起来*,+&野生型拟南芥接种白粉菌"
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在
苹果白粉菌接种后
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时表达量达到最高的
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倍*#$+!而富士苹果
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在接种苹果白粉
菌
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前表达量表现逐渐增高的趋势!
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才达到
最高的
),
倍&结合其他植物的研究!我们推测
%*!"#$)"4
持续长时间的高量表达可能是导致
富士苹果容易感白粉病的主要原因之一!且与
GH
(
-CW
或
DCW
信号通路关联!但其详细的信号通路还
有待深入研究&此外!
%*!"#$)"4
是否调控了
B
类抗白粉蛋白或受到
B
蛋白的调控有待揭示&
参考文献!
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基因克隆及其对白粉病的抗性分析