全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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基金项目$中央高校基本科研业务费专项资金%华东师范大学大夏科研基金"
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#
作者简介$李秋萍"
#+0)&
#!女!在读硕士研究生!主要从事苔藓植物种质资源保存研究&
12345
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6789:78
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通信作者$王
!
健!助理研究员!主要从事苔藓植物分类及种质资源保存研究&
12345
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<38
=!
>4?:6789:6@9:78

56
;
69863
!
#%$:7?2
藓类植物孢子生活力的快速检测方法初探
李秋萍#!吴思苹#!鲁蓓蓓#!张
!
煜!!王
!
健#"!朱瑞良#
"
#
华东师范大学 生命科学学院!上海
!""!(#
%
!
成都市石室小学!成都
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#
摘
!
要$通过对温度和光照条件的实验探索!筛选出金发藓"
!"#
$
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#和细叶小羽藓"
./
0
#"(#/1*+
+(&"
0
)
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##*+
#
!
种藓类孢子萌发的最适条件&采用碘

碘化钾染色法(
AAB
染色法(红墨水染色法(亚甲基蓝染色
法对
%
种藓类植物孢子的生活力进行测定!并将测得的生活力结果与孢子萌发率进行了比较分析&结果表明!亚
甲基蓝染色法测定的藓类植物孢子平均生活力百分率与孢子平均萌发率最为接近!且染色效果明显!可用于苔藓
植物孢子生活力的快速测定&亚甲基蓝染色法测得的孢子生活力"
2
#与其离体萌发率"
$
#的相关性达到极显著水
平"
&C":+*%
#!其回归方程为
$
C&03)(*D#3"%+2
"
!
#
":"#
#!可通过孢子生活力方便预测萌发率&
关键词$苔藓植物%孢子生活力%孢子萌发率%检测方法
中图分类号$
E+($$#
文献标志码$
F
!"#
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%&()(*)%+,-().+&+/-+001
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0
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I
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Z
?U2?VV6V
!
H
!
,HX637W4?826WT?@
!
AABX637W4?826WT?@
!
X6@48]VW34848
=
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38@26WT
Z
5686>596VW34848
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26WT?@<6X6VW9@46@>3V6@?8V4\V
I
6746V?U2?VV6V>
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I
3X48
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3>454W
Z
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Z
5686>596VW34848
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=
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!
6
9V6@U?XWT6X3
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Z
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I
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I
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I
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26WT
Z
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V
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$
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Z
?
I
T
Z
W6
%
V
I
?X6Y43>454W
Z
%
V
I
?X6
=
6X2483W4?8X3W4?
%
@6W67W4?826WT?@
!!
苔藓植物是一类以孢子作为有性繁殖方式的高
等植物!为了长期保护珍稀(濒危的种类!国际上针
对苔藓植物配子体的保存研究工作已经开展)#!*!但
是关于苔藓植物孢子的保存研究较少!原因可能在
于苔藓植物孢子体生长具有季节性!很难获得成熟
的孢子体材料&而要进行苔藓植物孢子保存研究首
先要能够成功地测定孢子的生活力&目前!主要还
是通过对材料的组织培养!根据离体萌发率来评价
苔藓植物孢子的生活力!该方法耗费时间长并需要
复杂的无菌操作!而一些珍稀(濒危种类不具备较多
的孢子材料用于离体萌发检测&因此!探索快速又
节省材料的孢子生活力检测方法具有重要意义&
目前!已经有多种方法成功地应用于种子和花粉
生活力的检测)$**!但是关于苔藓和蕨类等孢子植物
孢子的生活力检测还未见报道!笔者通过选择几种常
用的种子及花粉生活力测定方法对
%
种藓类植物孢
子生活力进行测定!并将测定结果与孢子离体萌发率
进行比较!旨在寻找一种简单(快捷的苔藓植物孢子
生活力检测方法!为苔藓植物孢子保存研究中的萌发
率快速检测体系的建立提供技术支持!也为蕨类植物
等其他孢子植物的孢子活力检测提供参考&
#
!
材料和方法
9:9
!
实验材料
参试的
%
种藓类植物"表
#
#中金发藓的孢子材
料于
!"##
年采自浙江西天目山!其余
)
种藓类植物
的孢子都于
!"#!
年分别采自四川(云南两地!在野
外将新鲜材料放置于培养皿中带回实验室于人工智
能气候培养箱"温度
#)_
!光照周期
#!T
明暗交
替#培养!直至孢子体成熟!凭证标本存于华东师范
大学植物标本馆"
OLPK
#&
9:
!
孢子萌发率测定
通过对温度"变化周期
#!T

#!T
!设计
!"_

#$_
(
!)_

#0_
和
$"_

!$_$
个水平#(光照
强度"变化周期
#!T

#!T
!其中夜晚光照强度为
"
G!白天光照强度设计成
!"""
"
!!""
(
$"""
"
$!""G和
("""
"
(!""G\$
个水平#的正交实验
设计!采用
,8?
I
培养基和无菌水
!
个条件培养金
发藓和细叶小羽藓的孢子!共设置
+
个不同培养条
件的实验组!每个
,8?
I
培养基做
$
个平行重复!每
个条件做一个无菌水对照组&保持培养环境相对湿
度为"
0"` )
#
a
!每天观察并记录孢子萌发情况&
实验所用的
,8?
I
培养基参照李晓毓等)0*的方
法配制!其中硫酸亚铁"
b6Lc
(
+
*O
!
c
#调整为
":"!)
=

G
!硫酸锰"
d8Lc
(
+
(O
!
c
#调整为
":""*)
=

G
!蔗糖和琼脂均为
#a
!
I
O):0
!高压灭菌后分
装到培养皿中待用&选取饱满(未开裂的成熟孢蒴!
先用无菌水清洗
$
次!然后用
*)a
酒精消毒
#248
!
再用无菌水清洗
$
次!接着用
":)a
次氯酸钠
"
P3B5c
#消毒
#248
!再用无菌水清洗
$
次!并
在
#:)2G1
I
管中挤破孢蒴!制成
#2G
孢子悬液!
接种到
,8?
I
培养基上&接种后每天在显微镜下统
计萌发率!直到萌发率稳定&
无菌水培养通过将
$
"
(2G
无菌水倒入培养
皿中!再将消毒过的孢子悬液接种到培养皿中!封口
膜密封好&接种后每天在显微镜下统计萌发率!直
到萌发率稳定&
9:;
!
孢子生活力测定
9<;<9
!
=
:
>7=
染色法
!
参照杨发君等)$*的测定方
法!选取成熟藓类孢蒴置于
#2G1
I
管中!加入几
滴
H
!
,H
染液!充分振荡使孢子从孢蒴中完全释放
并悬浮均匀!用吸管吸取适量孢子悬液于载玻片上!
盖上盖玻片并在光学显微镜下计数!孢子壁被染成
淡蓝色的孢子具有生活力!未染色的缺失生活力&
9<;<:
!
??@
"
!
!
$
!
)>
氯化三苯基四氮唑#染色法
!
参照张志良等)+*方法配制成
":)a AAB
染液!取成
熟的孢蒴打开将孢子直接撒在载玻片上!加
!
滴染
液!用解剖针将孢子搅拌均匀!盖上盖玻片!置于
$)
_
恒温箱中
$"248
&然后在显微镜下观察!具有活
力的孢子被染成红色!无色的为没有活力的孢子&
9:;:;
!
红墨水染色法
!
将成熟的藓类孢蒴放入
#
2G
的
1
I
管中!加入几滴
)a
普通红墨水!充分振
荡使孢子从孢蒴中完全释放并悬浮均匀!水浴
#T
后用吸管吸取适量孢子液于载玻片上!并在光学显
表
9
!
实验材料
A3>56#
!
d3W6X435V38@48U?X23W4?8?U7?567W4?8V
种名
L
I
6746V
采集地
B?567W4?8V4W6
采集时间
B?567W4?8W426
生境
O3>4W
金发藓
!"#
$
%&()*+("++*,-
浙江西天目山
J6VWA43829dW:
!
NT6
;
438
=
!"##:##
土生!海拔
+!"21
I
4
=
369V
!
F5W4W9@6+!"2
反扭藓
5++-##//,"+/#/
云南贡山
Q?8
=
VT38
!
-98838 !"#!:"*
石生!海拔
#(((21
I
454WT47
!
F5W4W9@6#(((2
梨蒴珠藓
6/&%&/+/
0
"+
7
"&+8
云南贡山
Q?8
=
VT38
!
-98838 !"#!:"*
石壁生!海拔
#("(2c8754UU
!
F5W4W9@6#("(2
卵叶泥炭藓
9
0
)/
:
,*+"4/%*+
四川黑水
O64VT94
!
L47T938 !"#!:"0
土生!海拔
$)*+21
I
4
=
369V
!
F5W4W9@6$)*+2
侧枝匍灯藓
!#/
:
"+,*++/2+"4(;
云南金平
R48
I
48
=
!
-98838 !"#!:##
岩面薄土生!海拔
#+!*2
c8X?7]<4WT3WT4853
Z
6X?UV?45
!
F5W4W9@6#+!*2
近缘紫萼藓
<&++//
77
,8
四川黑水
O64VT94
!
L47T938 !"#!:"0
树干生!海拔
$%+#2
c8WX66WX98]V
!
F5W4W9@6$%+#2
细叶小羽藓
./
0
#"(#/1*++(&"
0
)
$
##*+
上海华东师范大学
13VWBT483P?X235K84Y6XV4W
Z
!
LT38
=
T34
!"#!:"(
土生!海拔
#)21
I
4
=
369V
!
F5W4W9@6#)2
*!#!
#"
期
!!!!!!!!!!!!!
李秋萍!等$藓类植物孢子生活力的快速检测方法初探
微镜下计数!被染成红色的孢子不具生活力!未染色
的孢子具有生活力&
9:;:A
!
亚甲基蓝染色法"也称吕氏碱性美兰染色
法#
!
参照杨发君等)$*的方法配制染液!将成熟的孢
子置于载玻片上!加
#
滴
":#a
的亚甲基蓝溶液!用
解剖针搅拌均匀!盖片染色
!248
&在光学显微镜
下观察!凡是染成蓝色的为有活力的孢子!没有染蓝
或染色较浅的为不具活力的孢子&
以上实验中每种方法均重复
$
次!每个重复选
取
$
个视野观察!然后计算孢子活力的百分率和孢
子萌发率&孢子活力百分率和孢子离体萌发率的计
算公式如下$
!
孢子活力
C
"有生活力孢子数孢子总数#
e#""a
!
孢子萌发率
C
"已萌发的孢子数孢子总数#
e#""a
9:A
!
数据分析
采用
L[LL#+:"
程序对实验结果进行统计分
析!均值的多重比较采用邓肯氏"
.98738
#新复极差
检验和
GL.
法检验!检验水平
#
C":")
&相关性分
析通过将孢子生活力百分率与萌发率进行对比!通
过线性回归分析的方法!研究孢子生活力与萌发率
之间的相关性&
!
!
结果与分析
::9
!
光照和温度条件对
:
种藓类孢子萌发率的影响
表
!
显示!在相同光照条件下! 种藓类的孢子
萌发率均在
!)_

#0_
下最高!且
,8?
I
培养基高
于无菌水培养%而在相同温度条件下! 种藓类的孢
子萌发率均以
("""
"
(!""G光强下最低!其余
!
个光强处理接近!但
$"""
"
$!""G下
,8?
I
培养
基与无菌水培养更接近%同时!金发藓孢子萌发率最
高值"
*+:#!a
#出现在
!)_

#0_
(
$"""
"
$!""
G下
,8?
I
培养基上!而细叶小羽藓孢子萌发最高
值"
0*:)#a
#出现在
!)_

#0_
(
$"""
"
$!""G下无菌水培养中&综合以上结果筛选出适合于金发
藓和细叶小羽藓孢子萌发的最佳组织培养条件为光
强
$"""
"
$!""G(温度
!)_

#0_
!湿度保持在
"
0"` )
#
a
!此时金发藓和细叶小羽藓孢子的萌发率
在
,8?
I
培养基上分别为
*+:#!a
和
0%:()a
!而且
在这个条件下的无菌水和
,8?
I
培养基所培养的孢
子萌发率差异最小!绝对差值仅为
#a
左右&
表
:
!
不同光照和温度条件下金发藓和细叶小羽藓孢子萌发率
A3>56!
!
L
I
?X6
=
6X2483W4?8X3W6V?U!3("++*,-38@.3+(&"
0
)
$
##*+
98@6X@4UU6X68W54
=
TW48W68V4W46V38@W62
I
6X3W9X6V

a
种名
L
I
6746V
温度
A62
I
6X3W9X6

_
光照强度
G4
=
TW48W68V4W
Z

G!"""
"
!!""
,8?
I
无菌水
LW6X456<3W6X
$"""
"
$!""
,8?
I
无菌水
LW6X456<3W6X
("""
"
(!""
,8?
I
无菌水
LW6X456<3W6X
金发藓
!3("++*,-
!"

#$ $):$+ !):** (":($ $#:!* $":+) !#:!*
!)

#0 *0:+) *$:+! *+:#! *0:") %+:*% *!:0%
$"

!$ %#:!0 (#:0( %":$% (#:%( )$:+( ($:#$
细叶小羽藓
.3+(&"
0
)
$
##*+
!"

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!)

#0 0*:(! 0$:"% 0%:() 0*:)# 0%:+# *):$0
$"

!$ 0):"* *%:"% 0%:)+ *0:%( 0(:$! *%:#+
图
#
!
(
种孢子染色方法效果比较
F:
金发藓孢子
H
!
,H
染色结果%
M:
金发藓孢子
AAB
染色结果%
B:
反扭藓孢子红墨水染色结果%
.:
反扭藓孢子亚甲基蓝染色结果
b4
=
:#
!
S6V95WV?UU?9X]48@V?UV
I
?X6VVW34848
=
26WT?@V
F:AT6VW34848
=
6UU67W?UV
I
?X6V?U!3("++*,-<4WTH
!
,H
%
M:AT6VW34848
=
6UU67W?UV
I
?X6V?U!3("++*,-<4WTAAB
%
B:AT6VW34848
=
6UU67W?UV
I
?X6V?U53/,"+/#/<4WTX6@48]
%
.:AT6VW34848
=
6UU67W?UV
I
?X6V?U53/,"+/#/<4WT26WT
Z
5686>596
0!#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
表
;
!
A
种孢子生活力测定方法比较
A3>56$
!
B?2
I
3X4V?8?UU?9X26WT?@V?8V
I
?X6Y43>454W
Z
@6W67W4?8
处理方法
AX63W268W26WT?@
有生活力
f43>454W
Z
缺失生活力
P?Y43>454W
Z
清晰度
.6U484W4?8
染色时间
LW34848
=
W426
H
!
,H
孢子壁呈蓝色
L
I
?X6<354V>596
未着色
K8VW3486@
不清晰
K87563X )248
AAB
未着色
K8VW3486@
未着色
K8VW3486@ & $"248
红墨水
S6@48]
未着色
K8VW3486@
红色
S6@
清晰
B563X
$)_
水浴
#T
$)_>3WT#T
亚甲基蓝
d6WT
Z
5686>596
蓝色
M596
未着色或染色较浅
K8VW3486@?X54
=
TWVW3486@
清晰
B563X !248
表
A
!
B
种藓类新鲜孢子平均萌发率及
A
种方法测得的孢子平均生活力
A3>56(
!
FY6X3
=
6
=
6X2483W4?8X3W6V38@Y43>454W
Z
?UV4\2?VV6V>3V6@?8U?9X@6W67W4?826WT?@V
种名
L
I
6746V
平均萌发率
FY6X3
=
6
=
6X2483W4?8
X3W6

a
平均生活力
FY6X3
=
6Y43>454W
Z

a
H
!
,H
AAB
红墨水
S6@48]
亚甲基蓝
d6WT
Z
5686>596
金发藓
!"#
$
%&()*+("++*,- *+:#!` $:$"7 +#:#)` #:$0> & +):"$` #:"*3 0":$(` #:!+7
反扭藓
5++-##//,"+/#/ *+:))` !:#$> +":"%` !:"$3 & *#:()` (:$%7 0(:)!` $:)$3>
梨蒴珠藓
6/&%&/+/
0
"+
7
"&+8 0*:)"` !:%(> & & +%:#"` !:""3 +#:!!` ":*+>
卵叶泥炭藓
9
0
)/
:
,*+"4/%*+ 0#:!#` !:0*> & & +0:%)` ":)03 0(:$*` !:(+>
侧枝匍灯藓
!#/
:
"+,*++/2+"4(; 0+:!0` #:0(> +0:#*` #:()3 & *%:$!` !:%*7 0+:+#` #:(%>
近缘紫萼藓
<&++//
77
,8 +0:%0` #:#"3 +$:!#` #:#"> & +#:0%` #:0"> ++:0*` ":#"3
!!
注$
&
表示无法分辨染色效果的孢子&平均生活力和平均萌发率以平均值
`
标准差表示!
$
次重复% 种藓类孢子独立进行生活力与萌发率的差异显著性比
较!同行字母不同者表示在
":")
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::
!
不同测定方法下藓类孢子活力的比较分析
采用
(
种不同染色方法对
%
种藓类孢子活力的
测定结果见表
$
&其中!
H
!
,H
染色法只能将有活力
的孢子壁边缘染成淡蓝色!经过
$)_
温水浴(敲击
孢子外壁以及延长染色时间等处理!其染色效果都
不明显!不利于孢子生活力的统计"图
#
!
F
#%
AAB
染色法对
%
种藓类的孢子都没效果!孢子和孢子壁
基本都不着色"图
#
!
M
#%红墨水法和亚甲基蓝染色
法的染色效果都很明显!都可用于藓类孢子生活力
的检测!但是红墨水染色法需要经过
#T
的水浴处
理!增加了操作的复杂性"图
#
!
B
(
.
#&
::;
!
各方法孢子活力与萌发率检测结果比较
%
种藓类孢子生活力的不同测定方法所得结果
见表
(
&结果表明!反扭藓的孢子活力在红墨水法
与
H
!
,H
和亚甲基蓝
!
种方法间都有显著性差异!
而其在亚甲基蓝法与
H
!
,H
法间无显著性差异%近
缘紫萼藓的孢子活力在亚甲基蓝法与
H
!
,H
和红墨
水
!
种方法间都有显著性差异!而在
H
!
,H
与红墨
水
!
种方法间无显著性差异%其他
(
种藓类的孢子
生活力在各种染色法间差异均达显著水平"
!
#
":")
#&同时!
H
!
,H
染色法(
AAB
染色法和红墨水
染色法所测得的孢子平均生活力百分率与平均萌发
率之间均存在显著性差异!只有亚甲基蓝染色法测
得的平均生活力百分率与其平均萌发率之间不存在
显著性差异&
另外!用
L[LL
软件对上述
%
种藓类亚甲基蓝
染液测得的孢子生活力与萌发率数据进行回归分
析!设亚甲基蓝染色法所测的孢子平均生活力为
2
!
离体萌发法测得的孢子平均萌发率为
$
!求得回归
方程
$
C&03)(*D#3"%+2
!相关系数为
":+*%
&且
经检测得生活力与萌发率的回归关系达到极显著水
平"
!
#
":"#
#&根据所建立的回归方程!可以通过
测得孢子的生活力来预测孢子的离体萌发率&
$
!
讨
!
论
苔藓植物的孢蒴一般在春季和夏秋季成熟!金
发藓孢蒴采集最佳时间是春夏之交!卵叶泥炭藓的
成熟孢蒴获得最佳时间是夏季!而反扭藓(梨蒴珠
藓(侧枝匍灯藓和近缘紫萼藓等
(
种藓类的成熟孢
蒴从春季到秋季都可获得)#"*&除了金发藓以外!本
研究所涉及的
)
种藓类孢蒴均在孢蒴成熟的最佳时
间获得!并将野外采集的材料带回实验室中置于人
+!#!
#"
期
!!!!!!!!!!!!!
李秋萍!等$藓类植物孢子生活力的快速检测方法初探
工智能气候培养箱中培养!直至孢子体成熟&有研
究显示!
*
月份采集的金发藓孢子
$@
就可以达到最
高萌发率"
*):)a
#
)
##
*
!而本研究中采于
##
月份的
金发藓孢子第
(
天才开始萌发!第
0
天才达到最高
萌发率"
*+:#!a
#!这表明藓类植物孢子活力强弱可
能与季节因素具有一定的相关性&
苔藓植物的孢子遇到适宜的温度(湿度和光照
即开始萌发!在适宜的条件下!本实验中的金发藓和
细叶小羽藓孢子在无菌水和
,8?
I
培养基中萌发率
差异不大!说明苔藓植物孢子萌发初期对外界的养
分要求并不苛刻!利用孢子自身提供的营养即可萌
发&而且!无菌水培养的孢子萌发得更快"
!
种藓类
孢子接种于无菌水中第
!
天即开始萌发!形成萌发
管!第
%
天萌发率就趋于稳定%而在
,8?
I
培养基中
第
(
天才开始萌发!第
0
天萌发率趋于稳定#&虽然
无机营养对孢子的萌发不起关键作用!但对孢子萌
发后原丝体的生长与发育起到一定的作用"无菌水
比
,8?
I
培养基培养的金发藓孢子萌发后的原丝体
较细!且细胞中的叶绿体稀少#&
由于孢子休眠等原因)#!*!有些苔藓植物孢子即
使在适宜的环境条件下也不能萌发!因此找到一种
检测孢子生活力的方法对于孢子的保存研究至关重
要&然而生活力只能代表孢子潜在的萌发能力!其
与离体萌发率的关系是孢子生活力测定方法准确性
判断的主要依据&本实验的
(
种染色法中只有亚甲
基蓝染色法所测得的平均生活力百分率与孢子的平
均萌发率最为接近!染色效果也明显!且此方法操作
简便!染色快速!无需恒温水浴等处理!适合于藓类
孢子生活力的快速检测&
H
!
,H
染液只能将孢子外
壁染成淡蓝色!可能由于孢子中的淀粉含量较低引
起!有研究也证明藓类植物孢子中的脂肪含量特别
高!明显高于其他营养成分)#$*&
AAB
法被广泛用
于种子活力的测定!是最有希望代替种子常规发芽
试验的方法)%0*!但却不能用于苔藓植物孢子活力的
测定!有研究也证明
AAB
法在花粉的活力测定中
不起作用)()*!说明苔藓植物孢子在呼吸及孢壁结构
方面与种子有很大的区别!而与花粉相似&
本研究通过对
%
种藓类植物孢子生活力检测方
法的比较分析!证明亚甲基蓝染色法适用于藓类孢
子的活力测定!并通过对活力检测结果与萌发率之
间关系的回归分析!推导出萌发率"
$
#与生活力"
2
#
之间的回归方程为
$
C&03)(*D#3"%+2
!根据这个
方程通过测定的孢子生活力就可以推测出孢子的离
体萌发率!为进一步开展对苔藓植物孢子保存研究
中的萌发率检测提供了快速(简便的方法!通过这种
方法还可以在种质资源保存中选择活力比较高的孢
子进行保存&在接下来的孢子超低温保存研究中!
将进一步使用该方法测定藓类植物孢子超低温保存
后的生活力!并分析其与萌发率的相关关系&
参考文献!
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