全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(４): ３５７￣３６２(２０１４)
收稿日期: ２０１２￣０９￣０６ꎻ 修回日期: ２０１４￣０５￣１４
基金项目: 山西农业大学“中青年学术带头人及学术骨干”专项资金ꎻ山西省自然科学基金(２０１２０１１０３２￣５)
通讯作者: 牛颜冰ꎬ教授ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻＴｅｌ:０３５４￣６２８７２０５ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｎｉｕｙａｎｂｉｎｇｂｅｓｔ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０４.００３
白术矮化病毒病病原的分子鉴定和部分序列分析
牛颜冰∗ꎬ 时晓丽ꎬ 赵慧琪ꎬ 张西梅ꎬ 赵保佳
(山西农业大学生命科学学院ꎬ太谷 ０３０８０１)
摘要:本试验在生物学接种的基础上ꎬ利用非序列依赖性 ＰＣＲ扩增(ｓｅｑｕｅｎｃｅ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＳＩＡ)对白术矮化病毒
病病原进行了分子鉴定ꎬ序列测定及分析ꎮ 结果发现ꎬ具有矮化症状的白术为黄瓜花叶病毒(Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬＣＭＶ)所
侵染ꎮ 为明确 ＣＭＶ白术分离物(ＣＭＶ￣Ａｍ)的分类地位ꎬ本研究进一步克隆了 ＣＭＶ￣Ａｍ的外壳蛋白基因(ＣＰ)和移动蛋白基
因(ＭＰ)全序列ꎮ 序列比对分析表明ꎬＣＭＶ￣Ａｍ与 ＣＭＶ亚组ⅠＢ中株系 ＸＪ２序列同源性最高ꎬ核苷酸、氨基酸序列同源性分别
为 ９８.９％、９９.１％ꎮ 氨基酸序列同源性聚类分析表明ꎬＣＭＶ￣Ａｍ与中国大多数 ＣＭＶ分离物一样ꎬ属于 ＣＭＶ亚组ⅠＢꎮ
关键词:白术ꎻ 黄瓜花叶病毒ꎻ 系统进化树分析
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ
ｉｓｏｌａｔｅ ｆｒｏｍ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ ＮＩＵ Ｙａｎ￣ｂｉｎｇꎬ ＳＨＩ Ｘｉａｏ￣ｌｉꎬ ＺＨＡＯ Ｈｕｉ￣ｑｉꎬ
ＺＨＡＮＧ Ｘｉ￣ｍｅｉꎬ ＺＨＡＯ Ｂａｏ￣ｊｉａ (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉｇｕ ０３０８０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ ｄｗａｒｆ ｄｉｓｅａｓｅꎬ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ(ＳＩＡ)ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＳＩＡ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ (ＣＭＶ ) ｉｎ ｄｗａｒｆ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ ｌｅａｖｅｓ. Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ＣＭＶ ｉｓｏｌａｔｅ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ (ＣＭＶ￣Ａｍ)ꎬ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ (ＣＰ) ａｎｄ
ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ (ＭＰ) ｃｏｄｅｄ ｂｙ ＣＭＶ￣Ａｍ ＲＮＡ３ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＣＭＶ￣Ａｍ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ２ ｂｅｌｏｎｇｓ ｉｎ ＣＭＶ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ⅠＢꎬ ｗａｓ
９８.９％ ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ９９.１％ ｉｎ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｄｅｎｔｉｔｙꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＰ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＭＶ￣Ａｍ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ＣＭＶ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ⅠＢ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚꎻ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎻ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
中图分类号: Ｓ４３２.４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０４￣０３５７￣０６
白术(Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ.)为菊
科(Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ)苍术属多年生草本植物ꎬ其干燥根
茎为著名的传统中药材ꎬ与人参齐名ꎬ素有“北参
南术”之誉ꎮ 白术主产于浙江于潜、安徽亳州、河
北安国和山西绛县等地ꎮ 白术因具健脾益气、燥湿
利水、止汗和安胎等功效ꎬ被«神农本草经»列为上
品ꎮ 近年来有研究表明ꎬ白术还具有预防流感、抗
炎、止腹泻、抗氧化、延缓衰老、降血糖、抗凝血和抗
肿瘤等作用[１~４]ꎮ 另外ꎬ最近韩国和日本等国的美
容护肤品中也大量使用白术提取物ꎮ 白术现今已
成为我国出口创汇的十大拳头中药品种之一ꎮ 白
术多为栽培ꎬ现已少野生[５]ꎮ ２０１１ 年笔者对山西
绛县和河北安国等白术主产区的病毒病害进行调
查ꎬ发现许多白术表现出典型的矮化症状ꎻ为明确
白术矮化病病原ꎬ本研究利用生物学方法、病毒
ｄｓＲＮＡ分离技术、非序列依赖性 ＰＣＲ 扩增(ＳＩＡ)
和 ＲＴ￣ＰＣＲ等手段ꎬ对表现矮化症状的白术样品进
行了病毒分离检测与鉴定ꎬ确定其被 ＣＭＶ 所侵
植物病理学报 ４４卷
染ꎮ 并对 ＣＭＶ￣Ａｍ 的 ＲＮＡ３ 多聚蛋白基因和运
动蛋白基因进行了克隆、测序与序列分析ꎬ初步确
定了 ＣＭＶ￣Ａｍ 属于 ＣＭＶ亚组ⅠＢꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
病样采自山西绛县和河北安国白术种植田中
表现出典型矮化症状的病株叶片ꎮ
主要试剂:莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶
(Ｍ￣ＭＬＶ)和 ＲＮａｓｉｎ 核酸酶抑制剂等ꎬ购自 Ｐｒｏ￣
ｍｅｇａ公司ꎻ克隆载体 ｐＭＤ １８￣Ｔ 购自 ＴａＫａＲａ 公
司ꎻＴａｑｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ、 Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ
和琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 回收试剂盒等ꎬ购自生工
(Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ)公司ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 生物学接种试验 取白术病样叶片在磷酸
盐缓冲液中研磨ꎬ将其汁液摩擦接种于苋色藜、昆
诺藜和普通烟等指示植物ꎬ进行症状观察ꎮ
１.２.２ 植物病原双链 ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)的提取 参照
Ｎｉｕ等[ ６ ~ ７ ]和 Ｔｚａｎｅｔａｋｉｓ等[ ８ ]的方法进行ꎮ
１.２.３ 非序列依赖性 ＰＣＲ(ＳＩＡ)和特异引物 ＰＣＲ
检测 以所提取的病样 ｄｓＲＮＡ 为模板ꎬ进行 ＳＩＡ
和特异引物 ＰＣＲ 扩增ꎬ同时以健康白术作为阴性
对照ꎮ 所用的随机引物和特异引物见表 １ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５－３)
ＸＴＮ２６９ ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＮＮＮＮＮＮ
ＸＴＮ１７７ ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧ
ＣＭＶ ＣＰ￣Ｆ ＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣ
ＣＭＶ ＣＰ￣Ｒ ＴＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡＧＡＣＴＧＧＴＡＧＣＡＣＣ
ＣＭＶ ＭＰ￣Ｆ ＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＣＡＴ
ＣＭＶ ＭＰ￣Ｒ ＡＹＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＲＣＧＹＴＣＡＣＴＣＣＣ
反转录反应体系及反应程序为:ｄｓＲＮＡ模板 ４
μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ ＸＴＮ２６９ １ μＬ、 ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ( １０ ｍ
ｍｏｌ / Ｌ) １ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ８.７ μＬꎬ９０ ℃水浴 ５ ｍｉｎꎬ迅
速冰上冷却 ３ ｍｉｎꎻ再加入 ５×ＲＴ￣ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ４ μＬ、
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０. ５ μＬ、 Ｍ￣ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ ０.８ μＬꎬ４２ ℃ １ ｈꎬ７０℃ １５ ｍｉｎꎬ反应结束
后反应产物保存于－２０ ℃ꎮ ＰＣＲ 反应体系及反应
程序为:ｄｄＨ２Ｏ １８.７５ μＬ、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２.５ μＬ、
ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅｓ(１０ ｍ ｍｏｌ / Ｌ) ０. ５ μＬ、锚定引物
(ＸＴＮ１７７)或特异引物(ＣＭＶ ＣＰ￣Ｆ / ＣＭＶ ＣＰ￣Ｒ
或 ＣＭＶ ＭＰ￣Ｆ / ＣＭＶ ＭＰ￣Ｒ )１ μＬ、Ｔａｑｐｌｕｓ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ ０. ２５ μＬ、 ｃＤＮＡ ２ μＬꎮ 反应程序为:
９４ ℃３ ｍｉｎꎬ９４ ℃ ３０ ｓꎬ５２ ℃ ３０ ｓꎬ７２ ℃ １.５ ｍｉｎꎬ
３５个循环ꎻ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎬ４ ℃ 保存ꎮ 反应结束后ꎬ
进行琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ
１.２.４ ＰＣＲ产物克隆及序列分析 利用琼脂糖凝
胶回收试剂盒回收目的片段ꎬ并将其与 ＰＭＤ １８￣Ｔ
ｖｅｃｔｏｒ进行连接转化ꎬ阳性克隆通过 ＰＣＲ 和酶切
鉴定后送至北京华大基因研究中心进行测序ꎮ 登
录 ＧｅｎＢａｎｋ对所得序列利用 ＢｌＡＳＴ 进行检索ꎬ采
用 ＤＮＡｓｔａｒ 软件包中的 ＳｅｑＭａｎ 程序对测序亚克
隆进行拼接ꎬ拼接序列用 ＥｄｉｔＳｅｑ 程序修改和保
存ꎮ 结合 ＮＣＢＩ￣ＧｅｎＢａｎｋ 部分共享数据ꎬ利用
ＤＮＡＭＡＮ软件对所测序列与已报道的分离物序
列进行核苷酸序列、氨基酸序列的同源性比较分
析ꎬ运用 ＭＥＧＡ ４.１ 软件构建系统进化树ꎬ以同属
的花生矮化病毒(ＰＳＶ)为外群ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 生物学接种结果
白术病样叶片的汁液在 ３ 种指示植物上均引
起了明显的病毒病症状ꎮ 接种 ７ ｄ 后ꎬ普通烟都呈
现系统花叶症状ꎻ苋色藜和昆诺藜均呈现坏死斑症
状ꎬ符合 ＣＭＶ的发病特点[ ９ ]ꎮ
２.２ ＳＩＡ检测
以 ＸＴＮ２６９ / ＸＴＮ１７７ 为引物ꎬ以提取的
ｄｓＲＮＡ为模板进行 ＳＩＡ检测ꎬ得到大小在 ５００~７５０
ｂｐ之间的多条条带ꎬ但以 ７４９ ｂｐ处的条带最亮ꎬ而
健康样品中则未扩增出任何片段(图 １)ꎮ 经克隆、
测序和序列比对发现ꎬ所扩增的病毒基因组条带均
为 ＣＭＶꎬ证明白术被 ＣＭＶ 所侵染ꎬ并将该分离物
命名为 ＣＭＶ￣Ａｍꎮ
２.３ 特异引物 ＰＣＲ检测
为了进一步确定 ＣＭＶ￣Ａｍ 的分类地位ꎬ本试
验以提取的白术感病叶片中的 ｄｓＲＮＡ为模板 ꎬ
８５３
４期 牛颜冰ꎬ等:白术矮化病毒病病原的分子鉴定和部分序列分析
Ｆｉｇ. １ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＳＩＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
Ｍ: ＤＬ ２０００ＴＭ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻＬａｎｅ１: Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔꎻ
Ｌａｎｅ ２: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ.
ＣＭＶ￣ＣＰ￣Ｆ / ＣＭＶ￣ＣＰ￣Ｒ(用于扩增 ＣＭＶ外壳蛋白
基因 ＣＰ )、 ＣＭＶ￣ＭＰ￣Ｆ / ＣＭＶ￣ＭＰ￣Ｒ (用于扩增
ＣＭＶ移动蛋白基因 ＭＰ)为引物进行特异引物
ＰＣＲ检测ꎮ 扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ
分别 得 到 大 小 为 ６５７ｂｐ ( ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号:
ＪＱ３６２３９４) (图 ２￣Ａ)、 １３６２ｂｐ (ＧｅｎＢａｎｋ 登录号:
ＪＱ６１２５２６)(图 ２￣Ｂ)的目的片段ꎬ而健康样品中未
扩增出相应大小的片段ꎮ
２.４ 序列相似性分析
利用 ＤＮＡＭＡＮ 软件对 ＣＭＶ￣Ａｍ 编码的 ＣＰ
基因序列与来自美国、中国、日本、韩国、印度、澳大
利亚和匈牙利的 ２０ 个分离物进行核苷酸序列、氨
基酸序列同源性比较分析 (表 ２)ꎮ 结果表明
ＣＭＶ￣Ａｍ ＣＰ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＪＱ３６２３９４)基因序
列与 ＣＭＶ 各亚组代表株系序列同源性都高于
７０％ꎬ而与 ＰＳＶ代表株系的序列同源性低于 ７０％ꎻ
ＣＭＶ￣Ａｍ与 ＣＭＶ 亚组Ⅰ代表株系核苷酸和氨基
酸序列同源性(９０％以上)远高于与亚组Ⅱ代表株
系的同源性 ( ９０％以下)ꎮ 因此ꎬＣＭＶ￣Ａｍ 属于
ＣＭＶ亚组Ⅰꎮ
为了进一步研究 ＣＭＶ￣Ａｍ 的起源与进化关
系ꎬ使用 ＭＥＧＡ ４.１软件ꎬ并以同属的 ＰＳＶ 株系为
外群ꎬ对该分离物和已报道的其他 ＣＭＶ 株系构建
ＣＰ基因的氨基酸序列系统进化树(图 ３)ꎮ 从进化
树中可以看出ꎬＣＭＶ￣Ａｍ 与亚组ⅠＢ 代表株系形
成一个独立分支ꎬ该分离物与亚组ⅠＢ的 ＸＪ２株系
和 ＨＬＪ株系亲缘关系最近ꎬ聚为一簇ꎬ而与 ＰＳＶ株
系亲缘关系最远ꎮ 这表明 ＣＭＶ￣Ａｍ 属于 ＣＭＶ 亚
组ⅠＢꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ
Ａ: Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＣＭＶ￣Ａｍ ＣＰꎻ Ｍ:ＤＬ ２０００ＴＭ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔꎻ
Ｌａｎｅ ２: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ. Ｂ: Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＣＭＶ￣Ａｍ
ＭＰꎻ Ｍ:ＤＬ ２０００ＴＭ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ.
３ 结论与讨论
随着白术种植面积的不断扩大ꎬ白术的病害也
呈逐年加重的趋势ꎬ尤其是立枯病、根腐病、白绢病
及斑枯病ꎬ发病率高ꎬ危害重ꎬ给药农带来了重大的
经济损失ꎮ 近年来ꎬ笔者在山西绛县、河北安国等
白术种植基地ꎬ发现表现严重矮化症状的白术发病
率有时可高达 ９５％ꎮ 本试验通过生物学接种、ＳＩＡ
和 ＲＴ￣ＰＣＲ等方法ꎬ对染病白术进行病毒病病原的
分子鉴定ꎬ序列分析发现白术矮化病是由 ＣＭＶ 侵
染所致ꎮ 由于 ＣＭＶ 基因组序列较大ꎬ且株系繁
多ꎬ来自不同地区、不同寄主的 ＣＭＶ 在生物学和
分子生物学特征上均具有很大差别ꎬ因此ꎬ深入开
展 ＣＭＶ亚组鉴定具有十分重要的意义[ １０ ]ꎮ
９５３
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣＭＶ￣Ａｍ
ＣＰ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ＣＭＶ ｓｔｒａｉｎｓ
Ｉｓｏｌａｔｅ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ
ＧｅｎＢａｎｋ
ｎｕｍｂｅｒ
Ｓｏｕｒｃｅ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｉｄｅｎｔｉｔｙ / ％
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｉｄｅｎｔｉｔｙ / ％
ＰＳＶ－ＥＲ Ｕ１５７３０ Ａｍｅｒｉｃａ ５２.４ ４５.４
Ｍ ⅠＡ ＡＦ２６８５９９ Ｃｈｉｎａ ９３.９ ９５.０
Ｆｎｙ ⅠＡ Ｄ１０５３８ Ａｍｅｒｉｃａ ９４.２ ９７.２
Ｙ ⅠＡ Ｄ１２４９９ Ｊａｐａｎ ９４.１ ９６.３
Ｌｅｇｕｍｅ ⅠＡ Ｄ１６４０５ Ｊａｐａｎ ９３.６ ９６.３
Ａｓ ⅠＢ Ｘ７７８５５ Ｋｏｒｅａ ９７.０ ９８.２
ＸＪ２ ⅠＢ ＤＱ０７０７４６ Ｃｈｉｎａ ９８.９ ９９.１
ＤａｎＳｈｅｎ ⅠＢ ＡＹ６００９８９ Ｃｈｉｎａ ９７.７ ９８.６
ＸＪ１ ⅠＢ ＤＱ０２８８２５ Ｃｈｉｎａ ９６.７ ９７.２
ＨＬＪ ⅠＢ ＤＱ４５９４８１ Ｃｈｉｎａ ９８.９ ９８.６
Ｉｎｄｉａｎ Ⅱ ＡＭ３９６９８３ Ｉｎｄｉａ ７８.９ ８４.３
ＹＮ－Ｂ Ⅱ ＡＪ２４２５８５ Ｃｈｉｎａ ７７.７ ８２.５
ＴＳＨ Ⅱ ＤＱ２４９２９８ Ｃｈｉｎａ ７７.５ ８２.５
ＷＳＪ Ⅱ ＥＦ５１４９２４ Ｃｈｉｎａ ７７.７ ８２.５
ｌｉｌｙ Ⅱ ＤＱ８８５２９１ Ｃｈｉｎａ ７７.７ ８２.５
Ｘｂ Ⅱ ＡＦ２６８５９８ Ｃｈｉｎａ ７７.７ ８２.０
Ｑ Ⅱ Ｍ２１４６４ Ａｕｓｔｒａｌｉａ ７７.８ ８２.９
ＰａＦＭ Ⅱ ＡＢ１０９９０８ Ｋｏｒｅａ ７７.７ ８２.９
ｔｒｋ７ Ⅱ Ｌ１５３３６ Ｈｕｎｇａｒｙ ７６.８ ８０.６
ＬＳ Ⅱ ＡＦ１２７９７６ Ａｍｅｒｉｃａ ７７.５ ８２.０
病毒病的生物学检测法具有直观、步骤简单和
易操作的优点ꎬ是植物病毒病原鉴定方法的一个重
要基础 [ １１ ]ꎮ 本试验在对引起白术矮化病病原进
行分子生物学鉴定之前ꎬ进行了生物学检测ꎬ初步
判定白术的病害为病毒病害ꎮ 随后本试验再利用
ＳＩＡ对白术矮化病病毒病原进行分子鉴定ꎬ序列分
析发现引起白术矮化病的病毒病原为 ＣＭＶꎬ并将
其命名为 ＣＭＶ￣Ａｍꎮ ＳＩＡ 技术是将随机引物加入
ｄｓＲＮＡ中ꎬ该引物 ５端含有 ２０ 个固定序列的核苷
酸ꎬ３端含有核苷酸随机简并序列[ １２ ]ꎬ在逆转录酶
的作用下延伸ꎮ 在 ＰＣＲ延伸过程中加入固定序列
部分作引物ꎬ将扩增产物进行电泳分析、克隆和测
序[１ ３ ]ꎮ ＳＩＡ的特点是试验时间短ꎬ步骤简单ꎬ得到
病毒拷贝数高ꎬ不需特定试剂ꎮ 通过 ＳＩＡ 扩增病
毒的 ｄｓＲＮＡꎬ再结合测序可用于 ＲＮＡ 病毒和同一
病毒不同株系的复合侵染[ １ ４ ~ １ ５ ]ꎬ同时将 ＳＩＡ技术
稍作修改还可以用于测定 ＤＮＡ病毒[１ ５ ]ꎮ
为了进一步确定 ＣＭＶ￣Ａｍ 的分类地位和进
化关系ꎬ在 ＳＩＡ检测的基础上ꎬ依据待测病毒的保
守序列设计引物ꎬ采用 ＲＴ￣ＰＣＲ技术扩增该病毒的
ＣＰ和 ＭＰ 的全序列ꎬ并将其测定结果进行同源关
系和系统进化分析ꎮ ＣＭＶ￣Ａｍ与来自东亚和东南
亚国家的 ２０个典型分离物进行序列比对分析ꎬ发
现 ＣＭＶ￣Ａｍ分离物与 ＣＭＶ亚组ⅠＢ 代表株系的
核苷酸及其编码的氨基酸序列同源性最高ꎬ与
ＣＭＶ亚组ⅠＡ次之ꎬ而与 ＣＭＶ 亚组Ⅱ较低ꎻ与来
自中国的 ＣＭＶ亚组ⅠＢ 的 ＸＪ２ 株系和 ＨＬＪ 株系
亲缘关系最近ꎬ聚为一簇ꎬ因此将 ＣＭＶ￣Ａｍ 分离
物归属于亚组ⅠＢꎬ至于其确切来源有待全基因组
序列确定后才能作进一步分析ꎮ 本研究结果进一
步证明 ＣＭＶ亚组Ⅰ在我国发生普遍ꎬ而亚组Ⅱ在
我国发生较少[ １ ６ ]ꎬ且我国大部分 ＣＭＶ 分离物属
于亚组ⅠＢꎮ 本实验的研究方法可为后期病毒病
原的分子鉴定提供借鉴ꎻ研究结果可为合理有效地
进行白术病毒病的综合防治及其白术脱毒苗的培
育提供参考ꎮ
０６３
４期 牛颜冰ꎬ等:白术矮化病毒病病原的分子鉴定和部分序列分析
Ｆｉｇ. ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ＣＰ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ ＣＭＶ￣Ａｍ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ
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[４] Ｋｉｍ Ｓ Ｈꎬ Ｊｕｎｇ Ｈ Ｎꎬ Ｌｅｅ Ｋ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｔｈ２－ｔｙｐｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ
ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｋｏｒｅａｎ
ｍｅｄｉｃｉｎｅ: Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ [ Ｊ ] .
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ
２７(２): ３３１－３４３.
[５] Ｙａｎｇ Ｃ Ｐꎬ Ｌａｏ Ｙ Ｘꎬ Ｗｕ Ｆ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ
ｏｎ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[ Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ (中药材) ꎬ
１６３
植物病理学报 ４４卷
２００２ꎬ ２５(３): ２０６－２０８.
[６] Ｎｉｕ Ｙ Ｂꎬ Ｗａｎｇ Ｄ Ｆꎬ Ｙａｏ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ａｂｕｔｉｌｏｎ ｔｈｅｏｐｈｒａｓｔｉｉ ｉｎ Ｃｈｉｎａ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ(植物
病理学报)ꎬ ２００８ꎬ ３８(２): １８７－１８８.
[７] Ｎｉｕ Ｙ Ｂꎬ Ｗａｎｇ Ｄ Ｆꎬ Ｙａｏ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｖｉｒｕｓ ｏｎ Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ [ Ｊ] . Ａｃｔａ
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ(植物病理学报)ꎬ ２０１１ꎬ ４１
(４): ４３７－４４０.
[８] Ｔｚａｎｅｔａｋｉｓ Ｉ Ｅꎬ Ｍａｒｔｉｎ Ｒ Ｒ. Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ[ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ２００８ꎬ １４９(１): １６７– １７０.
[９] Ｚｈｏｕ Ｙꎬ Ｚｈａｎｇ Ｒꎬ Ｇｕｏ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｌｕｔｉｎｏｓａ
ｍｏｓａｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙ￣
ｔｏｐｈｙｌａｃｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ(植物保护学报)ꎬ ２０１０ꎬ ３７ (５):
４４７－４５２.
[１０] Ｎｉｕ Ｌ Ｘꎬ Ｎｉｕ Ｓ Ｎꎬ Ｗａｎｇ Ｊ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙ￣
ｓｉｓ ｏｆ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ
ｉｓｏｌａｔｅ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｂａｓｅｌｌａ ｒｕｂｒａ Ｌ. ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] .
Ｃｈｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(中国生物工程杂志)ꎬ ２００８ꎬ ２８
(２): ９６－１００.
[１１] Ｌａｎ Ｙ Ｆꎬ Ｘｉ Ｌ Ｊꎬ Ｚｈａｎｇ Ｄ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓｅ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｓｈａｎｄｏｎｇ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ (山东农业科学)ꎬ ２００６ꎬ (５):
５８－６２.
[１２] Ｒｏｏｓｓｉｎｃｋ Ｍ Ｊꎬ Ｓａｈａ Ｐꎬ Ｗｉｌｅｙ Ｇ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｃｏｇｅｎｏｍ￣
ｉｃｓ: ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｕｎｄｅｒ￣
ｓｔａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｅｃｏｌｏｇｙ[Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ ２０１０ꎬ １９
(Ｓｕｐｐｌ １): ８１－８８.
[１３] ＳｔａｎｇＡꎬ Ｋｏｒｎ Ｋꎬ Ｗｉｌｄｎｅｒ Ｏꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ＰＣＲ
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ ４３: ７１６－
７２０.
[１４] Ｓｕｓａｉｍｕｔｈｕ Ｊꎬ Ａｇｉｎｄｏｔａｎ Ｂ Ｏꎬ Ｍｉｌｌｅｒ Ｌ Ａꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｐｏｔａｔｏ ａｕｃｕｂａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｉｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
ｓｔａｔｅ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ ２００７ꎬ ９１(９): １２０２－１２０２.
[１５] Ｂｒｉｇｈｔ Ｏ Ａꎬ Ｍｏｎｄａｙ Ｏ Ａꎬ Ｌｅｓｌｉｅ Ｌ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｐｐｌｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ (ＳＩＡ) ｆｏｒ
ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ｃｒｏｐｓ [Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ２０１０ꎬ １６９: １１９－１２８.
[１６] Ｌｉ Ｊ Ｊꎬ Ｄｅｎｇ Ｚ Ｈꎬ Ｚｅｎｇ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ(生物技术通报)ꎬ ２００７ꎬ
６: ９３－９６.
责任编辑:张宗英 曾晓葳
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