全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(5): 467-474(2013)
收稿日期: 2013-01-04; 修回日期: 2013-06-03
基金项目: 国家自然科学基金面上项目(3117062)
通讯作者: 林彩丽,助理研究员,主要从事植物病原分子互作研究; Tel: 010-62889284, E-mail: lincl@caf. ac. cn
第一作者: 耿显胜,男,河南信阳人,博士研究生,主要从事分子植物病理学研究。
泡桐丛枝植原体 pPaWBNy-1-ORF5 编码蛋白
的原核表达和抗体制备
耿显胜, 田国忠, 宋传生, 胡佳续, 林彩丽*
(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所, 国家林业局森林保护学重点实验室, 北京 100091)
摘要:利用含泡桐丛枝植原体质粒 pPaWBNy-1 的 3. 0 kb片段的克隆为模板,PCR扩增 pPaWBNy-1-ORF5 的亲水性肽段编
码区。 目的片段连接到原核表达载体 pET28a(+),重组质粒 pET28a-ORF5-5 转化大肠杆菌 (Escherichia coli) Rosseta
(DE3)感受态细胞,菌液处在对数生长期时(OD600 =0. 52),添加 IPTG 诱导 5 h 后收集菌体,提取蛋白并进行聚丙烯酰胺
凝胶电泳。 用六聚组氨酸标签抗体进行Western blot检测,发现分子量约为 15 kDa 的含多聚组氨酸标签的目的蛋白得到
表达。 切胶回收融合蛋白,免疫德国大白兔以制备抗血清,间接 ELISA法测定抗血清的效价约为 1∶ 8 100。 用制备的 ORF5
编码蛋白的抗血清进行Western blot分析,结果在带菌的介体昆虫茶翅蝽(Halyomorpha halys)中检测到大小约为 17 kDa的
特异蛋白条带,但在健康和感病泡桐(Paulownia sp. )及无菌茶翅蝽中均未检测到,由此推测 pPaWBNy-1-ORF5 蛋白与介体
昆虫传播植原体有关。
关键词:泡桐丛枝病; 植原体; 茶翅蝽; 原核表达; 免疫印迹
Prokaryotic expression of pPaWBNy-1-ORF5 encoding protein of paulownia
witches’ -broom phytoplasma and preparation of the polyclonal antiserum 　 GENG
Xian-sheng, TIAN Guo-zhong, SONG Chuan-sheng, HU Jia-xu, LIN Cai-li　 (Research Institute of Forest Ecolo-
gy, Environment and Protection, The Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration, Chinese Academy of
Forestry, Beijing 100091, China)
Abstract: The hydrophilic polypeptide-coding region of ORF5 was amplified by PCR using the clone contai-
ning a 3. 0 kb fragment of pPaWBNy-1 as DNA template. The amplified DNA fragment was inserted into the
prokaryotic expression vector pET28a(+) . The recombinant plasmid pET28a-ORF5-5 was transformed into the
E. coli Rosseta(DE3) strain. During the mid-exponential growth (OD600 =0. 52), cultures was added IPTG to
induce the expression of His-ORF5 protein for 5 hours. The fusion protein was then performed with SDS-PAGE.
Western blot analysis was carried out with anti-His tag polyclonal antibody. The results indicated that the 15 kDa
His-ORF5 fusion protein was expressed in E. coli Rosseta(DE3) strain. The fusion protein was purified and in-
jected into a German white rabbit to raise antiserum. The titer of the antiserum was 1∶ 8 100 tested by indirect
ELISA. One 17 kDa specific protein band was detected by Western blot analysis in PaWB-infected vector stink
bug Halyomorpha haly, while no ORF5 protein was detected in PaWB-infected Paulownia spp. and non-infected
H. haly. Therefore, it is presumed that ORF5 protein is involved in the transmission of insect vector.
Key words: Paulownia witches’-broom; phytoplasma; Halyomorpha haly; prokaryotic expression; Western
blot
中图分类号: S436. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)05-0467-08
　
植物病理学报 43 卷
　 　 质粒是能够自主复制的遗传元件,广泛存在于
各类生物体的细胞中。 质粒的遗传学证据最先是
由 Lederberg 和 Tatum 在 20 世纪 50 年代发现,
1952 年 Lederberg 首先提出质粒术语[1]。 质粒能
够赋予寄主细胞重金属离子的耐受、抗生素的抗
性、毒力、细菌素、激素的合成等特性。 而植物病原
细菌的质粒基因通常涉及致病性或寄主专化
性[2]。 质粒在细菌的复制中能够稳定遗传,也能
通过结合、转化、转导、转座而水平的转移[3],使其
寄主在较短时间内能够适应周围环境的变化。
植原体是能够引起植物病害的一类原核生物,
隶属柔膜菌纲(Mollicutes)。 植原体主要寄生于植
物韧皮部筛管,由韧皮部取食的昆虫传播。 植原体
质粒的研究始于上世纪 80 年代,利用 DNA 印迹
杂交和 DNA 凝胶电泳等方法从不同的植原体中
证实质粒的存在。 自 1997 年首次测定甘蔗白叶病
植原体的质粒 pPSE 之后[4],目前已经测定了 30
多个完整的植原体质粒序列。 泡桐丛枝病是我国
林木上主要的植原体病害之一,目前报道的主要有
刺吸式口器昆虫小绿叶蝉、茶翅蝽[5 ~ 7]和烟草盲蝽
传播。 Lin等[8]从泡桐丛枝植原体南阳株系(pau-
lownia witches ’ -broom phytoplasma-Nanyang
strain,PaWBNy)中克隆到 2 个质粒:pPaWBNy-1
(4 485 bp)和 pPaWBNy-2(3 837 bp),并预测前者
编码 6 个蛋白,后者编码 5 个蛋白,其中 pPaWB-
Ny-l-ORF4 可能为植原体致病性相关的病原效应
分子[9]。 pPaWBNy-l-ORF5 由 435 个核苷酸组成,
编码 144 个氨基酸,ProtParam 预测其编码蛋白的
分子量为 16. 3 kDa,NCBI的 BlastP 分析发现该蛋
白氨基酸序列与洋葱黄化植原体弱毒株系(onion
yellows mild, OY-M)中质粒 EcOYM-ORF3 编码
的氨基酸序列相似性为 76% 。 研究表明,OY-M
质粒的 ORF3 编码蛋白与介体昆虫的传播有
关[10 ~ 11],泡桐丛枝植原体能够被茶翅蝽等介体昆
虫传播,因而推测 pPaWBNy-l-ORF5 可能与茶翅
蝽的传毒有关。
血清学技术在植原体的检测和鉴定上具有重
要的地位,但由于植原体未能离体培养,传统的方
法提纯的植原体会存在寄主植物细胞成分的残留,
造成抗原不纯,容易产生假阳性结果。 利用基因工
程的方法,可以在较短的时间内得到高纯度和浓度
的植原体抗原,解决了寄主成分污染的问题。 近年
来,利用植原体表面的抗原膜蛋白(Amp、 Imp 和
IdpA) [12 ~ 14]、延伸因子 Tu[15]、TMK [16]、SecA 蛋
白[17]等制备了植原体的抗体。 本研究以植原体质
粒 pPaWBNy-l-ORF5 编码的膜蛋白为出发点,试
图找到新的检测植原体的抗原蛋白,用于泡桐丛枝
植原体的传播介体的带毒率检测。 同时,本研究制
备的抗血清将为下一步开展 ORF5 编码蛋白亚细
胞和组织定位及蛋白互作的研究提供基础。
1　 材料与方法
1. 1　 材料和主要试剂
健康和感病泡桐组培苗、 pET28a (+ )载体、
pPaWBNy-1 序列的 3. 0 kb 的克隆[9]和 Anti-Amp
抗血清[18]由本实验室保存。 雄性德国大白兔由中
国农业大学养殖场提供。 茶翅蝽样本是 2012 年
10 月份采集于河南省南阳市潦河镇。 E. coli
DH5α 和 E. coli Rosetta (DE3)菌株购于博迈德生
物公司。
质粒提取试剂盒、普通 DNA 产物纯化试剂
盒、Bradford蛋白质定量试剂盒、血液 /组织 /细胞
基因组提取试剂盒、DNA聚合酶、蛋白质分子量标
准、DNA分子量标准购于天根生化科技有限公司。
限制性内切酶购于大连宝生物有限公司。 蓝色预
染蛋白质分子量标准和 BICP / NBT 显色试剂盒购
自博迈德公司。 兔抗 His-Tag 多克隆抗体购于
SAB公司。 碱性磷酸酶标记的 A蛋白和弗氏不完
全佐剂购于 Sigma公司。 Ni-NTA Fast Start Kit购
于 Qingen公司。 引物由赛百盛基因技术有限公司
合成。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 目的片段的扩增　 根据 pPaWBNy-1-ORF5
的序列(GenBank 登录号:EF426472),利用 Primer
Premier 5. 0 软件设计引物。 用于扩增 ORF5 基因
的引物序列为(下划线部分为添加的酶切位点):
P1ORF5Fn-EcoRⅠ5′-GCCGAATTCTTTAAATCAA-
TTCAAGATAAAAATG-3′,P1ORF5Rn-SalⅠ5′-CTG
GTCGACTTTATTATTGTCATTGGATTCA-3′;以含
pPaWBNy-1的 3. 0 kb片段的克隆为模板进行 PCR
扩增。 茶翅蝽带毒检测采用半巢式 PCR 的方法,
扩增质粒复制相关蛋白基因 ( repA);使用的引
物是: Rep837-6-F 5′-CCGAAATCGAAGTTGC-3′,
864
　
　 5 期 耿显胜,等:泡桐丛枝植原体 pPaWBNy-1-ORF5 编码蛋白的原核表达和抗体制备
Rep837-R 5′-CAGGGACATAGATAAAGAT-ACA-
3′, Rep666-R 5′-ATCCTCCTTGGCCTCC-3′。 用引
物对 Rep837-6-F / Rep837-R 进行第一轮 PCR 扩增,
扩增的产物稀释 30倍用作第二轮扩增的模板,第二
轮扩增的引物对为 Rep837-6-F / Rep666-R。
1. 2. 2 　 pPaWBNy-1-ORF5 的原核表达载体构建
　 纯化的 PCR 产物和原核表达载体 pET-28a(+)
分别双酶切,酶切产物连接并转化 E. coli DH5α,
挑取转化平板上的克隆接种到含卡那霉素 (50
mg / L)的 LB 液体培养基中培养,菌液 PCR 筛选
阳性克隆,测序验证重组子,序列正确的重组子命
名为 pET28a-ORF5-5。
1. 2. 3 　 pPaWBNy-1-ORF5 编码蛋白的诱导表达
及 Western blot 检测 　 重组质粒 pET28a-ORF5-5
和空载体 pET-28a ( +)分别转化 E. coli Rosseta
(DE3)。 PCR鉴定的重组子按 1∶ 100 接种到含卡
那霉素(50 mg / L)和氯霉素(34 mg / L)的 LB液体
培养基中,37℃下 180 rpm 摇菌 2. 0、2. 5、3. 0 和
3． 5 h。 添加 IPTG 到终浓度为 1 mmol / L,继续振
荡培养 5 h。 离心收集菌体,用 100 μL的蛋白质提
取液(50 mmol / L Tris-HCl,2 mmol / L EDTA, pH
8. 0)重悬菌体,添加等体积的 2 × SDS-PAGE 上样
缓冲液,沸水中煮 5 min,4℃下 12 000 rmp 离心 1
min,上清即为菌体总蛋白。
制备的细菌总蛋白经 SDS-PAGE 分离,采用
电转移法将蛋白转移到 PVDF 膜上,于 4℃下封闭
过夜和 37℃下封闭 1 h。 TBST 洗膜 10 min,重复
3 次。 加入用 TBST 稀释(1∶ 2 500)的 His-Tag 多
克隆抗体,37℃下孵育 2 h,TBST 洗膜 3 次,每次
10 min。 加入碱性磷酸酶标记的蛋白 A(1 ∶ 2 500
稀释),37℃下孵育 2 h,用 TBST 洗膜 3 次,每次
10 min,最后用 BICP / NBT显色试剂盒显色 5 ~ 15
min,扫描成像。
1. 2. 4　 表达产物的纯化和抗体的制备　 诱导表达
的细菌总蛋白经 SDS-PAGE 电泳后,KCl 染色液
进行染色,切胶回收目的蛋白条带[9]。 回收的蛋
白溶液使用等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化,免
疫兔子,免疫时采用皮下多点注射结合肌肉注射的
方法。 首次免疫之前耳静脉采血 1 mL,用于阴性
对照。 第 4 次注射之后 10 d,颈动脉一次性采血。
血液在室温下温育 2 h 后,4℃过夜,次日在 3 000
rpm 下离心 30 min,上清即为抗血清。 采用正辛
酸-饱和硫酸铵法纯化抗血清,纯化的抗血清保存
于 - 20℃。 取 20 μL 纯化的抗体,按 101 ~ 103 倍
比稀释,采用 Bradford蛋白质定量试剂盒的方法测
定样品的 OD595。 利用牛血清白蛋白标准品制备
标准曲线,计算抗体的浓度。
1. 2. 5　 抗血清的鉴定及效价测定　 用 TBST 稀释
纯化的抗体(1∶ 500),对诱导表达后提取的细菌总
蛋白进行Western blot分析,方法参见 1. 2. 3。
原核表达的融合蛋白使用 Ni-NTA Fast Start
Kit 纯化,接着用碳酸盐包被液 ( 15 mmol / L
Na2CO3,35 mmol / L NaHCO3,3 mmol / L NaN3;pH
9. 6)稀释成 10 μg / mL,采用间接 ELISA 测定效
价。 实验中使用的抗血清第 1 个孔 1∶ 100 稀释,往
下以 1∶ 3 的梯度倍比稀释,每个浓度血清重复 3
次,以免疫前兔子血清作为阴性对照。 酶标仪测定
405 nm处的 OD 值,以与阴性对照孔 OD 值的比
值 P / N ≥2. 1 作为判断阳性或确定效价的临界点。
1. 2. 6　 感病泡桐和带菌茶翅蝽体内 ORF5 基因的
表达检测　 取南阳采集的茶翅蝽,经室内饲毒之
后,将单头茶翅蝽放在洁净的研钵中,加液氮研磨
成粉末。 称取约 0. 02 g 的粉末,用血液 /组织 /细
胞基因组提取试剂盒提取 DNA,提取的 DNA用于
半巢式 PCR分析。 剩余的粉末使用总蛋白提取液
(40 mmol / L Tris-HCl (pH 6. 8),5% SDS,8 mol /
L 尿素,0. 1 mmol / L EDTA,10 mmol / L β-巯基乙
醇,5 mmol / L PMSF)提取蛋白质。 以提取的蛋白
为抗原,利用制备的抗血清(1∶ 200 稀释)进行免疫
印迹试验,试验方法同 1. 2. 3。
分别取健康和感病泡桐组培苗使用液氮研磨,
称取约 0. 2 g 的粉末,加入总蛋白提取液充分混
匀。 在沸水中煮 5 min,18 000 g离心 15 min,取上
清。 提取的蛋白使用 Anti-Amp 抗血清检测植原
体的存在。 之后,使用本研究制备的抗血清
(1∶ 200倍稀释)进行免疫印迹试验,试验方法同
1． 2. 3。
2　 结果与分析
2. 1 　 pPaWBNy-1-ORF5 片段的 PCR 扩增和原
核表达载体的构建
使用引物对 P1ORF5Fn-EcoRI / P1ORF5Rn-Sal
Ⅰ,以含 pPaWBNy-1 的 3. 0 kb 片段的质粒为模
板,进行 PCR 扩增和电泳检测,得到约 200 bp 的
964
　
植物病理学报 43 卷
条带(图 1),与预期 DNA 片段大小一致。 将纯化
的 PCR 产物和 pET28a(+)质粒分别用 EcoRⅠ和
SalⅠ双酶切,酶切产物使用 T4 DNA连接酶连接,
连接产物转化 E. coli DH5α 感受态细胞。 菌液
PCR检测为阳性的克隆送华大基因测序,其中一
个克隆 (编号为 pET28a-ORF5-5 ) 测序结果与
pPaWBNy-l-ORF5(GenBank登录号:EF426472)的
序列一致,证明原核表达载体 pET28a-ORF5-5 构
建成功。
Fig. 1 　 PCR amplification of the partial frag-
ment of pPaWBNy-l-ORF5
Lane M: Marker III; Lane 1 and 2: PCR production of par-
tial ORF5 using a clone containing a 3. 0 kb segment of
pPaWBNy-1 as DNA template.
2. 2　 融合蛋白的诱导表达和检测
重组质粒转化 E. coli Rosseta (DE3)感受态
细胞,37℃摇床振荡培养 2. 0、2. 5、3. 0 和 3. 5 h 后
添加终浓度为 1 mmol / L IPTG诱导剂,继续培养 5
h。 取 3 mL诱导的菌液收集菌体,提取总蛋白并
进行 SDS-PAGE分析,发现在摇菌 2. 5、3. 0 和 3. 5
h后添加 IPTG诱导均有分子量约为 15 kDa 的蛋
白条带,但在摇菌 2. 5 h后诱导的目的蛋白表达量
最大(图 2)。 据此确定合适的诱导表达条件为:
37℃下摇菌 2. 5 h(OD600 =0. 52),添加终浓度为 1
mmol / L 的 IPTG诱导表达 5 h。
　 　 使用兔抗 His-Tag 多克隆抗体对诱导的蛋白
进行Western blot分析,在含有 pET28a-ORF5-5 的
菌体中检测到一条约 15 kDa 的特异条带(图 3),
该条带大小与 SDS-PAGE 观察到的蛋白条带一
致,表明 His-ORF5 融合蛋白得到表达。 而未诱导
菌体的也呈现一条较弱的条带,表明在未诱导的条
件下融合蛋白有少量表达(图 3)。 在含有 pET28a
(+ )空载体的 E. coli Rosetta (DE3)菌体中,无论
是诱导还是未诱导均未检测到融合蛋白(图 3)。
Fig. 2 　 SDS-PAGE of His-tagged ORF5 pro-
tein expressed in E. coli Rossetta
(DE3) strain
Lane M: Protein molecular weight marker; Lane 1: Expression
product of induced pET28a-ORF5-5 in E. coli; Lane 2:Ex-
pression product of non-induced pET28a-ORF5-5 in E. coli;
Lane 3: Expression product of induced empty vector pET28a in
E. coli; Lane 4: Expression product of non-induced pET28a in
E. coli; the arrow indicated the fusion protein.
Fig. 3　 Western blot analysis of His-ORF5 ex-
pressed in E. coli Rossetta ( DE3 )
with anti-His polyclonal antibody
Lane M: Molecular weight marker; Lane 1: Purified fusion
protein; Lane 2: Expression product of induced pET28a-
ORF5-5 in E. coli; Lane 3:Expression product of non-in-
duced pET28a-ORF5-5 in E. coli; Lane 4: Expression prod-
uct of induced pET28a(+ ) in E. coli; Lane 5: expression
product of non-induced pET28a(+ ) in E. coli.
074
　
　 5 期 耿显胜,等:泡桐丛枝植原体 pPaWBNy-1-ORF5 编码蛋白的原核表达和抗体制备
2. 3　 多克隆抗体的制备与纯化
用纯化的融合蛋白免疫德国大白兔,制备抗血
清,共得到约 60 mL 的抗血清。 取 15 mL 抗血清
采用正辛酸-硫酸铵法纯化,得到 7 mL 纯化、浓缩
的抗血清。 采用 Bradford 蛋白质定量试剂盒进行
纯化抗血清的定量。 使用 1 mg / mL的牛血清白蛋
白标准品制备标准曲线,得到标准曲线的方程为:y
= 0. 013 3x +1. 029 4(R2 =0. 991 2)。 将测定抗血
清的 OD595有效值 1. 843 代入方程,得出纯化抗血
清的浓度为 4. 078 mg / mL。
2. 4　 抗血清的鉴定及效价测定
使用纯化的抗血清对诱导表达的蛋白进行
Western blot 分析,发现诱导后重组子制备的蛋白
样本在 15 kDa 处出现条带(图 4),大小与 SDS-
PAGE分析及 His标签抗体的 Western blot检测到
的融合蛋白一致,表明制备的多克隆抗体与目的蛋
白具有特异的免疫反应。
Fig. 4 　 Western blot analysis of the fusion
protein in E. coli using the anti-
ORF5 antiserum
Lane M: Protein marker;Lane 1: Expression product of in-
duced pET28a in E. coli; Lane 2:Expression product of in-
duced pET28a-ORF5-5 in E. coli.
　 　 抗血清效价测定结果(表 1):当 P / N ≥2. 1 判
定为阳性。 制备的抗血清在稀释达到 1∶ 8 100 倍
时,P / N值为 2. 877;而制备的抗血清稀释到 1∶ 24
300 倍时,P / N 值为 1. 701。 因此其效价至少是
1∶ 8 100。
2. 5　 感病泡桐和带菌茶翅蝽体内 ORF5 编码蛋
白表达分析
为了初步确定茶翅蝽是否携带植原体,对采
集的茶翅蝽采用半巢式 PCR 扩增质粒编码的 re-
pA进行检测。 取检测分别为阳性结果的带菌茶
翅蝽和阴性结果的无菌茶翅蝽(图 5),及感病和
健康泡桐提取总蛋白。 SDS-PAGE 分离后,用本
研究制备的多克隆抗体进行 Western blot 检测。
在带菌茶翅蝽中检测到分子量约 17 kDa 的特异
条带(图 6),与 ORF5 编码蛋白的分子量预测值
16. 3 kDa 基本一致,表明携带植原体的茶翅蝽中
pPaWBNy-1-ORF5 基因得到表达,而在无菌茶翅
蝽及健康和感病泡桐中均未检测到该蛋白条带
(图 6)。 感病泡桐组培苗提取的蛋使用 Anti-
Amp抗血清进行 Western blot 分析时,能够检测
到大小约 24 kDa的 Amp 条带(结果未列出),表
明感病泡桐组培苗中存在植原体。 但使用本研
究制备的 pPaWBNy-1-ORF5 编码蛋白的抗血清
行杂交时,没有明显的血清学反应(图 6),推测
pPaWBNy-1-ORF5 在植原体侵染的泡桐中未表
达或者表达量低于检测水平。
Fig. 5 　 Nested-PCR amplification of the par-
tial fragment (666 bp) of RepA
Lane M: D2000; Lane 1: H. halys fed on PaWB-sources of
inoculum;Lane 2: H. halys collected from Nanyang; Lane
3: Paulownia infected with PaWB phytoplasma; Lane 4:
Healthy paulownia.
174
　
植物病理学报 43 卷
Table 1　 Titer of anti-pPaWBNy-1-ORF5 antiserum determined by indirect-ELISA
Dilution of antiserum 100 300 900 2 700 8 100 24 300 72 900 218 700
Average OD405 of Positive serum 1. 736 1. 504 1. 034 0. 584 0. 280 0. 161 0. 117 0. 098
OD405 of Negetive control 0. 131 0. 111 0. 100 0. 095 0. 097 0. 095 0. 095 0. 101
P / N 13. 244 13. 526 10. 341 6. 149 2. 877 1. 701 1. 225 0. 973
Fig. 6 　 Western blot analysis of paulownia
witches′-broom ( PaWB) ORF5 en-
coding protein expression in phyto-
plasma-infected and healthy sample
Lane 1: Healthy paulownia; Lane 2: Paulownia infected with
PaWB phytoplasma; Lane 3:H. halys infected with PaWB
phytoplasma; Lane 4: Healthy H. halys; Lane M: Protein
marker.
3　 讨论
柔膜菌纲细菌的质粒编码蛋白参与介体昆虫
细胞的互作已有大量报道,来自不同螺原体的 8 个
质粒编码的粘附相关蛋白参与螺原体和介体昆虫
的互作[19 ~ 21]。 研究发现,柑橘螺原体的螺旋素介
导螺原体粘附介体昆虫 Circulifer haematoceps 的
肠道或者唾液腺的上皮细胞,从而在传播过程中发
挥重要的功能[22 ~ 23]。 Labroussaa 等[24]发现螺原
体的磷酸甘油酸激酶与介体叶蝉的肌动蛋白结合,
外源的磷酸甘油酸激酶与肌动蛋白的互作和螺原
体被昆虫细胞的内化的抑制之间呈正相关,柑橘螺
原体可能利用这种互作方式穿过唾液腺屏障。 Le-
fol等[25]发现葡萄金黄植原体(Flavescence dorée,
FD)粘附到介体叶蝉 Scaphoideus littoralis中肠、唾
液腺细胞和血淋巴上,超薄切片观察到多数的 FD
粘附到唾液腺的腺泡 V 和腺泡 IV 上。 Suzuki
等[26]在免疫荧光显微镜下,观察到 OY 植原体的
膜蛋白 Amp 与介体叶蝉的微丝形成的 AM 复合
体,该复合体在决定植原体的介体传播性中发挥重
要的功能。
研究表明,与介体昆虫传播有关的翠菊黄化丛
枝植原体蛋白 SAP36 在介体昆虫体内的表达量显
著高于寄主植物[27]。 Nishigawa 等[10]发现洋葱黄
化植原体非虫传株系 (Onion yellows non-insect-
transmissible,OY-NIM)的质粒 pOYNIM 与 OY-M
的质粒 pOYM相比缺少虫传相关的阅读框 ORF3。
对洋葱黄化植原体野生株系(Onion yellows wild,
OY-W)和 OY-M侵染过的介体昆虫和寄主植物中
进行免疫组织化学分析,发现 ORF3 的表达水平在
介体昆虫细胞中高于植物中的表达水平[28]。 OY-
NIM的另一个质粒 EcOYNIM 虽含有与 pOYM-
ORF3 高度同源的基因 EcOYNIM-ORF3,但由于启
动子的缺失和突变,EcOYNIM-ORF3 不能够转录
并翻译成蛋白[28]。 由此可见,参与介体昆虫传播
的植原体蛋白在寄主植物和介体昆虫中的表达量
存在很大差异。
本研究制备了 pPaWBNy-1-ORF5 编码蛋白的
抗血清,Western blot 分析 ORF5 在泡桐丛枝植原
体的寄主植物泡桐和介体昆虫茶翅蝽中的表达。
结果在带菌的茶翅蝽中能够检测到 pPaWBNy-1-
ORF5 的表达,而在感病的泡桐组培苗中未检测
到。 为了证实感病泡桐中存在植原体,利用 Amp
抗血清进行Western blot 能够检测到 Amp 蛋白的
表达。 植原体细胞中的质粒拷贝数有多个,理论上
质粒编码蛋白应该比染色体基因编码蛋白 Amp 的
表达量高,但实验结果表明在寄主泡桐中无法检测
到 ORF5 的表达,而在介体昆虫中有大量的表达。
生物信息学分析 pPaWBNy-1-ORF5 蛋白的分子特
征,该蛋白和螺原体及植原体中参与昆虫互作的蛋
白均具有 N端信号肽序列和 C端疏水结构。 依据
274
　
　 5 期 耿显胜,等:泡桐丛枝植原体 pPaWBNy-1-ORF5 编码蛋白的原核表达和抗体制备
ORF5 蛋白的分子特征及其在寄主植物和介体昆
虫中的表达差异分析,推测 pPaWBNy-1-ORF5 可
能与 OY-M植原体的 ORF3 一样参与介体昆虫的
互作。 在本研究的基础上,下一步将对 pPaWBNy-
1-ORF5 编码蛋白进行亚细胞和组织表达定位及通
过 Far-Western blot等实验方法筛选与其互作的介
体昆虫蛋白。 另外,由于该基因在泡桐丛枝植原体
的介体昆虫体内特异性表达,故制备的抗血清可用
于茶翅蝽中植原体的检测。
参考文献
[1] 　 Barbara E F, Gregory J P. Plasmid Biology [M] .
Beijing: Chemical Industry Press (北京:化学工业出
版社), 2008.
[2] 　 Vivian A, Murillo J and Jackson R W. The roles of
plasmids in phytopathogenic bacteria: mobile arsenals?
[J]． Microbiology, 2001, 147: 763 -780.
[3] 　 Moreno E. Genome evolution within the alpha Pro-
teobacteria: why do some bacteria not possess plas-
mids and others exhibit more than one different chro-
mosome? [J] . FEMS Microbiology Reviews, 1998,
22: 255 -275.
[4] 　 Nakashima K and Hayashi T A. Sequence analysis of
extrachromosomal DNA of sugarcane white leaf phyto-
plasma [ J] . Annals of the Phytopathological Society
of Japan, 1997, 63: 21 -25.
[5] 　 Shiozawa H. Transmission of Paulownia Witches′
Broom by Sting Bugs Halyomorpha mista UHLER
[J] . Japan Plant Protection Association, 1986, 4: 45 -
50.
[6] 　 Shao P X, Hong R F, Tong D Q, et al. Transmitting
insect of paulownia witches′ broom ( I): transmission
assay of Halyomorpha haly and observation of MLO by
transmission electron microscope ( in Chinese) [ J] .
Journal of Shandong Forestry Science and Technology
(山东林业科技), 1981, 2: 42 -43.
[7] 　 Sun Z Q, Fu J M, Qiao J, et al. Capacity of Halyo-
morpha picus transmitting phytoplasma associated with
Paulownia witches′ broom ( in Chinese) [ J] . Forest
Research (林业科学研究), 1999, 12 (6): 606 -
611.
[8] 　 Lin C L, Zhou T, Li H F, et al. Molecular characteri-
sation of two plasmids from paulownia witches′-broom
phytoplasma and detection of a plasmid encoded pro-
tein in infected plants [ J] . European Journal of Plant
Pathology, 2009, 123: 321 -330.
[9] 　 Lin C L. Molecular characterization and protein func-
tions of plasmids from Paulownia witches′-broom phy-
toplasma ( in Chinese) [D] . Beijing: China Agricul-
tural University (北京:中国农业大学), 2008.
[10] Nishigawa H, Oshima K, Kakizawa S, et al. A plas-
mid from a non-insect-transmissible line of a phytoplas-
ma lacks two open reading frames that exist in the plas-
mid from the wild-type line [ J] . Gene, 2002, 298:
195 -201.
[11] Ishii Y, Oshima K, Kakizawa S, et al. Process of re-
ductive evolution during 10 years in plasmids of a non-
insect-transmissible phytoplasma [ J ] . Gene, 2009,
446: 51 -57.
[12] Kakizawa S, Oshima K, Nishigawa H, et al. Secre-
tion of immunodominant membrane protein from onion
yellows phytoplasma through the Sec protein-transloca-
tion system in Escherichia coli [ J] . Microbiology,
2004, 150: 135 -142.
[13] Berg M, Davies D L, Clark M F, et al. Isolation of
the gene encoding an immunodominant membrane pro-
tein of the apple proliferation phytoplasma, and expres-
sion and characterization of the gene product [J] . Mi-
crobiology, 1999, 145(8): 1937 -1943.
[14] Blomquist C L, Barbara D J, Davies D L, et al. An
immunodominant membrane protein gene from the
Western X-disease phytoplasma is distinct from those
of other phytoplasmas [J] . Microbiology, 2001, 147:
571 -580.
[15] Wang J, Zhu X P, Gao R, et al. Genetic and serolog-
ical analyses of elongation factor EF-Tu of paulownia
witches′-broom phytoplasma ( 16SrI-D) [ J] . Plant
Pathology, 2010, 59: 972 -981.
[16] Miyata S, Oshima K, Kakizawa S, et al. Two differ-
ent thymidylate kinase gene homologues, including one
that has catalytic activity, are encoded in the onion
yellows phytoplasma genome [ J ] . Microbiology,
374
　
植物病理学报 43 卷
2003, 149: 2243 -2250.
[17] Wei W, Kakizawa S, Jung H Y, et al. An antibody
against the SecA membrane protein of one phytoplasma
reacts with those of phylogenetically different phyto-
plasmas [J] . Phytopathology, 2004, 94 (7): 683 -
686.
[18] Mou H Q, Zhou T, Zhao W J, et al. Preparation and
application of antiserum against antigenic membrane
protein of Paulownia witches′-broom phytoplasma ( in
Chinese) [J] . Acta Phytopathology Sinica (植物病理
学报), 2011, 41(2): 161 -170.
[19] Davis R E, Dally E L, Jomantiene R, et al. Cryptic
plasmid pSKU146 from the wall-less plant pathogen
Spiroplasma kunkelii encodes an adhesin and compo-
nents of a type IV translocation-related conjugation sys-
tem [J] . Plasmid, 2005, 53: 179 -190.
[20] Saillard C, Carle P, Duret N S, et al. The abundant
extrachromosomal DNA content of the Spiroplasma
citri GII3-3X genome [J] . BMC Genomics, 2008, 9:
195 -207.
[21] Joshi B D, Berg M, Rogers J, et al. Sequence com-
parisons of plasmids pBJS-O of Spiroplasma citri and
pSKU146 of S. kunkelii: implications for plasmid evo-
lution [J] . BMC Genomics, 2005, 6: 175 -185.
[22] Duret S, Berho N, Danet J L, et al. Spiralin is not
essential for helicity, motility, or pathogenicity but is
required for efficient transmission of Spiroplasma citri
by Its leafhopper vector Circulifer haematoceps [ J] .
Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69
(10): 6225 -6234.
[23] Killiny N, Castroviejo M, Colette S. Spiroplasma citri
spiralin acts in vitro as a lectin binding to glycoproteins
from its insect vector Circulifer haematoceps [ J ] .
Phytopathology, 2005, 95(5): 541 -548.
[24] Labroussaa F, Dubrana M P, Arricau-Bouvery N,
et al. Involvement of a minimal actin-binding region of
Spiroplasma citri phosphoglycerate kinase in spiroplas-
ma transmission by its leafhopper vector [ J] . PLoS
ONE, 2011, 6(2): e17357.
[25] Lefol C, Caudwell A, Lherminier J, et al. Attachment
of the flavescence dorée pathogen (MLO) to leafhop-
per vectors and other insects [ J] . Applied and Envi-
ronmental Microbiology, 1993, 123: 611 -622.
[26] Suzuki S, Oshima K, Kakizawa S, et al. Interaction
between the membrane protein of a pathogen and insect
microfilament complex determines insect-vector speci-
ficity [ J] . Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 2006, 103
(11): 4252 -4257.
[27] MacLean A M, Sugio A, Makarova O V, et al. Phy-
toplasma effector SAP54 induces indeterminate leaf-
like flower development in Arabidopsis plants [ J] .
Plant Physiology, 2011, 157: 831 -841.
[28] Ishii Y, Kakizawa S, Hoshi A, et al. In the non-in-
sect-transmissible line of onion yellows phytoplasma
(OY-NIM), the plasmid-encoded transmembrane pro-
tein ORF3 lacks the major promoter region [ J] . Mi-
crobiology, 2009, 155: 2058 -2067.
责任编辑:张宗英
474