全 文 ：书收稿日期:2013 － 03 － 21
基金项目:国家科技支撑计划(2011BAD48B00) ;石河子大学自然科
学创新团队项目(2011ZＲKXTD-0205)
作者简介:都业娟(1973 －) ，女，山东烟台人，在读博士，主要从事植
物病毒及类似病害研究。
通信作者:向本春，教授，E-mail:XBC@ shzu． edu． cn
三刺皂荚黄化病植原体的分子鉴定
都业娟，李成亮，石宝萍，向本春
(石河子大学 新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆 石河子 832003)
摘要:采用巢式 PCＲ，分别用植原体 16S rＲNA，16S-23S rＲNA间区序列及 tuf 基因的通用引物对表
现黄化症状的三刺皂荚 DNA进行扩增，得到大小为 1. 2，0. 3，0. 8 kb特异性片段。对该片段分别
克隆、测序及序列分析表明，三刺皂荚黄化病植原体(HoY)上述 3 序列与榆树黄化组 B 亚组
(16SrV-B)的枣疯病植原体(JWB) )相应序列的同源性最高，分别为 99. 8%，100% 和 100%。iPhy-
Classifier在线分析显示，HoY 与 JWB(AB052876)有相同的 16S rDNA 酶切图谱，表明三刺皂荚黄
化病植原体属于榆树黄化组 B亚组(16SrV-B)。
关键词:三刺皂荚;植原体;16S rＲNA;16S-23S rＲNA 间区;tuf 基因;分子鉴定
中图分类号:S763. 14 文献标志码:A 文章编号:1671 － 0886(2013)06 － 0001 － 05
Molecular identification of the phytoplasma associated with yellow disease of Gleditsia triacanthos /
DU Yejuan，et al． (Key Laboratory at Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Ｒegion for Oasis
Agricultural Pest Management and Plant Protection Ｒesource Utilization，Shihezi University，Shihezi
832003，China)
Abstract:Using nested PCＲ with universal primers for phytoplasmal 16S rＲNA，16S-23S rＲNA space
region and tuf genes，DNA fragments about 1. 2 kb，0. 3 kb and 0. 8 kb in length were amplified from
the total DNA of honeylocust showing yellows symptom． Amplicons were cloned，sequenced and phylo-
genetically analyzed． The results showed that the 16S rＲNA，16S-23S rＲNA space region and tuf gene
of phytoplasma isolated from honeylocust yellow phytoplasma (HoY)shared 99. 8%，100% and 100%
identities with that of jujube witches ＇-broom phytoplasma(JWB)belonging to subgroup B of ‘elm
yellow group’(16SrV-B)． The result of online analysis of iPhyClassifier for 16S rDNA showed the
16S rＲNA gene of HoY had identical patterns with JWB (AB052876)． All these results indicated that
the phytoplsama associated with honeylocust yellows disease belonged to the subgroup B of ‘elm
yellows group’(16SrV-B)．
Key words:honeylocust;phytoplasma;16S rＲNA;16S-23S rＲNA space region;tuf gene;molecular i-
dentification
植原体(Phytoplasma)原称类菌原体(MLO) ，
属柔膜菌纲，是重要的病原微生物。主要由取食植
物韧皮部的叶蝉、飞虱等昆虫传播，可危害粮食、蔬
菜、花卉、林木、杂草等各类植物，感病植株表现出黄
化、顶枯、丛枝、簇生、花变叶、矮化、小叶等症
状［1 － 2］。目前世界上已报道的植原体病害有 1 000
多种，我国迄今已报道的植原体病害有 100 余种［3］。
由于植原体不能离体培养，所以不能用传统的真菌
和细菌的方法进行系统的分类鉴定。目前植原体分
类主要依赖分子生物学方法，尤以植原体的一些保
守序列，如 16S rＲNA 基因序列、核糖体蛋白基因
(rp)、延伸因子(tuf)基因、16-23S rＲNA 间区序列
(16S-23S rＲNA space region)、转运蛋白(SecY)基
因等，在检测和鉴定中的应用越来越多［4］。
三刺皂荚 Gleditsia triacanthos Lam．，豆科皂荚
属，又名三刺皂角、美国皂角，原产北美地区，后引进
·1·中国森林病虫 2013 年 11 月 第 32 卷 第 6 期
我国新疆、北京、山东、江苏等地，是国外利用最
广，研究最深的一种皂荚。其具有耐干旱、耐盐
碱、生长速度适中、木材密度高、坚硬、耐用的优
点，是广泛作为防风固沙林、经济林、用材林、绿
化林的优良树种。本研究对采自新疆石河子地
区表现黄化症状的三刺皂荚的病原，即植原体
16S rＲNA，16S-23S 间区序列及 tuf 基因采用巢
氏 PCＲ 进行分子生物学研究，明确三刺皂荚黄
化病病原及株系的分类地位。
1 材料与方法
1. 1 材料 2012 年 8 月在新疆石河子采集健康的
和表现黄化症状的三刺皂荚样品。
1. 2 总 DNA 提取 参照 Qi 等［5］的方法提取总
DNA，分别提取感病及健康植株总 DNA，保存在
－ 20℃冰箱中备用。
1. 3 巢式 PCＲ 扩增 利用 Nested-PCＲ 对植原体
的 16S rＲNA，16S-23S rＲNA 间区序列和 tuf 基因进
行扩增。其中引物对 P1 /P7［6］分别与 Ｒ16F2n /
Ｒ16Ｒ2［7］，SＲ1 /SＲ2［8］组合用于植原体 16S rＲNA
和 16S-23S rＲNA 间区序列基因的扩增;tuf 基因利
用引物对 fTuf1 / rTuf1 和 fTufu / rTufu［9］组合扩增
(表 1)。
表 1 用于植原体 16S rＲNA，16S-23S rＲNA间区
及 tuf基因扩增的引物序列
靶序列 引物名称 引物序列 5→3
16S rDNA and
16S-23S rＲNA
Pl AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT
P7 CGTCCTCATCGGCTCTT
Ｒ16F2n GAAACGACTGCTAAGACTGG
Ｒ16Ｒ2 TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG
SＲ1 AGGCGGATCCTTGGGGTTAAGTCGTAA
SＲ2 AGGCGAATTCCGTCCTCCATCGGCTCT
tuf gene fTuf1 CACATTGACCACGGTAAAAC
rTuf1 CCACCTTCACGAATAGAGAAC
fTufu CCT GAAGAAAGAGAACGTGG
rTufu CGGAAATAGAATTGAGGACG
1. 4 核苷酸序列的测定与分析 PCＲ 产物回收后
连接载体并转化大肠杆菌 DH5α，取白色菌落培养
并提取质粒。通过 PCＲ筛选鉴定阳性克隆，送北京
华大基因公司测序。
所得序列通过 Blast在 NCBI中搜索同源序列。
利用 DNAMAN 和 DNASTAＲ 进行核苷酸分析;利
用 MEGA 5. 0 通过最小进化法(Minimum-Evolu-
tion，ME)构建基于 16S rＲNA 和 tuf 基因序列的系
统进化树;并利用植原体在线分析软件 iPhyClassi-
fier对 16S rＲNA 基因序列进行在线分析(http:/ /
plantpathology. ba. ars. usda. gov /cgi-bin / resource /
iphyclassifier. cgi)。
2 结果与分析
2. 1 16S rＲNA，16S-23S rＲNA 间区序列及 tuf 基
因 PCＲ扩增结果 以表现黄化症状三刺皂荚总
DNA 为模板，经 Nested-PCＲ 扩增其 16S rＲNA，
16S-23S rＲNA 间区序列及 tuf 基因，分别得到约
1. 2，0. 3，0. 8 kb 的植原体特异条带，而健康三刺
皂荚植株和双纯水对照未扩增出相应条带。说明表
现黄化落叶症状的三刺皂荚中存在植原体，此植原
体 暂 命 名 为 Honeylocust yellows phytoplasma
(HoY)。
2. 2 16S rＲNA 基因序列分析及系统进化树构建
通过测定 3 个克隆确定 HoY 16S rＲNA 基因扩增片
段含 1 248 个核苷酸(GenBank No. KC242233) ，
G + C含量为 45. 8%。HoY 与 GeneBank 中同源序
列 Blast 结果显示，该株系与榆树黄化植原体组
(Elm yellows group，16SrV)的枣疯病植原体(Ju-
jube witches-broom phytoplasma，GenBank NO:
JQ675716)、山菊苣扁茎植原体(Puna chicory flat
stem phytoplasma GenBank NO:JN582266)、杏卷叶
植原体(Apricot leaf roll phytoplasma，GenBank NO:
FJ572660)、金钟花黄化植原体(Golden bellflower
yellows phytoplasma，GenBank NO:HQ844237)、皂
荚丛枝植原体(Honeylocust witches-broom phyto-
plasma，GenBank NO:FJ457095)同源性均达 99%以
上，与河南许昌的枣疯病植原体(JQ675716)同源率
高达 100%。将该序列用 iPhyClassifier 在线工具基
于相似系数进行 16S 组及亚组的分类，结果显示其
虚拟 ＲFLP 图 谱 与 16SrV-B 亚 组 参 照 株 系
(AB052876)的相似系数达 1. 00，因此认为 HoY 属
于 16SrV-B 亚组。
利用 MEGA 5. 0 构建系统进化树显示，HoY 与
16SrV-A，16SrV-B，16SrV-C，16SrV-D，16SrV-E 亚
组聚集为同一进化分枝，并与 16SrV-B 亚组的
AB052876，FJ457095，JQ675716 聚为一簇(图 1)。
2. 3 16S rＲNA 基因序列虚拟 ＲFLP分析 对 HoY
的 16S rＲNA 基因序列进行虚拟 ＲFLP分析，结果显
示:HoY 与 16SrV-B 亚组的参照株系枣疯病植原体
(AB052876)有相同的酶切图谱;与 16SrV-A 亚组
的榆黄化植原体(AY197655)在 HpaⅡ，ＲsaI酶切位
·2· Forest Pest and Disease Nov． 2013 No． 6
点存在差异;与 16SrV-C 亚组的金黄色植原体
(AY197645)在 BfaI，HpaⅡ和 ＲsaI 等 3 个酶切位点
存在差异，与 16SrV-D 亚组的金黄色植原体
(AY197644)在 BfaI，BstUI，HpaⅡ和 ＲsaI 等 4 个酶
切位点有差异;与 16SrV-E 亚组的悬钩子矮化植原
体(AY197648)在 BfaI，HpaⅡ，KpnI 和 ＲsaI 等 4 个
酶切位点有差异(图 2)。
图 1 HoY及其它植原体基于 16S rＲNA基因序列的系统进化树
2. 4 16S-23S rＲNA 间区序列分析 通过测定 3 个
克隆确定 HoY 16S-23S rＲNA 间区序列扩增片段含
265 个核苷酸(GenBank No． KC331053) ，G + C 含
量为 32. 5%。将其与 GeneBank中的同源序列进行
比较分析显示:HoY 与 16SrV 组核苷酸序列同源性
达 97. 8% ～ 100%，并与我国报道的多个枣疯病植
原体(EF661582，GU184181，FJ445389)核苷酸同源
性达 100%，与其他组植原体核苷酸同源性均低于
92. 0%。
2. 5 tuf 基因序列分析及系统进化树构建 通过测
定 3 个克隆确定 HoY tuf 基因扩增片段由 824 个核
苷酸组成(GenBank No. KC331043) ，G + C 含量为
33. 0%。与 GeneBank 中的同源序列比较，结果表
明:HoY 与 16SrV 组 tuf 基因核苷酸同源性均在
91% 以上，与我国报道的该组枣疯病植原体
GU723424， GU723423， GU968760， GU968759，
GU137287 同源性达 99. 5% ～ 100%，与该组其他亚
组植原体的同源性为 91. 0% ～ 92. 6%，而与其他组
植原体同源性低于 85. 0%。利用 MEGA 5. 0 构建
系统进化树显示:HoY 与 16SrV 组植原体聚为同一
进化 分 枝，并 与 枣 疯 病 植 原 体 GU723424，
GU723423，GU968760，GU968759，GU137287 聚为
一簇(图 3)。
·3·中国森林病虫 2013 年 11 月 第 32 卷 第 6 期
a:HoY;b:枣疯病植原体(AB052876，16SrV-B) ;c:榆黄化植原体(AY197655，16SrV-A) ;d:金黄色植原体(AY197645，16S rV-C) ;e:金黄
色植原体(AY197644，16SrV-D) ;f:悬钩子矮化植原体(AY197648，16SrV-E) ;MW:PhiX174 DNA-HaeⅢ DⅠgest
图 2 HoY及相关亚组植原体 16S rDNA的虚拟 ＲFLP图谱
图 3 HoY及其它植原体基于 tuf基因序列的系统进化树
·4· Forest Pest and Disease Nov． 2013 No． 6
3 讨论
本研究利用 Nested-PCＲ 扩增三刺皂荚黄化病
植原体(HoY)16S rＲNA，16S-23S rＲNA间区序列及
tuf 基因，通过对其进行序列分析、构建基于 16S
rＲNA和 tuf 基因的系统进化树并利用 iPhyClassifier
对 16S rＲNA 基因进行 ＲFLP 在线分析，明确 HoY
属于榆树黄化组 B亚组(16SrV-B)。通过序列比较
分析可知，相对于植原体 16S rＲNA 基因组间的高
度保守，植原体的 16S-23S rＲNA 间区序列及 tuf 基
因存在更多的变异，但组内尤其是亚组内序列的同源
性很高，可作为植原体组及亚组的划分补充依据。
我国 2008 年在陕西杨陵地区发现皂荚丛枝植
原 体 (Honeylocust witches-broom phytoplasma，
FJ457095)可 感 染 中 国 皂 荚 Gleditsia sinensis
Lam．［10］，引起丛枝、矮缩、小叶等症状。本文所报
道的病害发生于三刺皂荚上，且症状表现为叶片黄
化、后期植株茎干枯死，二者寄主及症状均不同;针
对 16S rＲNA 基因序列进行比对，二者在 1030 和
1223 位存在 2 个碱基的差异。
新疆得天独厚的自然条件，非常适合葡萄、香
梨、枣、杏等果树生长，随着新疆特色林果业的快速
发展，新疆已成为我国重要水果产区之一，但近年相
继发现杏树、枣树感染植原体病害。新疆也是我国
较早将三刺皂荚引入作为绿化树种的地区，在南北
疆均有分布。通过对 HoY 的 16S rＲNA，16S-23S
rＲNA间区序列及 tuf 基因研究发现，其与我国多个
枣疯病植原体在不同位点存在高度同源性。2000
年后新疆大力发展枣树等特色林果种植，面积已突
破 73 万 hm2，新疆不同树种之间植原体病害存在何
种关系，三刺皂荚黄化病植原体能否侵染其它果树
并对新疆林果业造成危害，有待进一步深入研究。
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(责任编辑 杨静莉)
·5·中国森林病虫 2013 年 11 月 第 32 卷 第 6 期