全 文 ：2016 年 第 2 期
CHINA PLANT PROTECTION 2016 ,Vol ．36 ．No ．2
20世纪 70年代， 水稻橙叶病 （rice orange leaf
disease， ROLD） 陆续报道发生于泰国、 菲律宾、印
度、马来西亚、印尼等国［1］。 在我国，该病于 1978 年
首次发现于云南西双版纳，随后在东南、西南、华南
水稻橙叶病分子检测及其在华南地区的
发生与分布研究
何园歌
1
， 李 舒
1
， 郝维佳
1
， 郑静君
2
， 钟宝玉
2
， 周国辉
1*
（1. 华南农业大学农学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东 广州 510642；
2. 广东省农业有害生物预警防控中心，广东 广州 510050）
摘要： 对华南地区水稻橙叶病（rice orange leaf disease）进行病原菌分子检测和病情发生与分布调查。结果表明，该病
是一种由电光叶蝉（Inazuma dorsalis）和黑尾叶蝉（Nephotettix cinticeps）传播的植原体（Phytoplasma）引起的病害，早
期感病植株在分蘖期全株叶片表现为橙黄色，不久干枯死亡，对水稻生产造成严重为害。 电镜下观察，病株幼叶叶脉
筛管细胞中存在大量植原体。巢式 PCR 可从来源于水稻病株及介体电光叶蝉和黑尾叶蝉 DNA 抽提物中获得单一扩
增产物，PCR 产物核苷酸序列与文献报道的水稻橙叶植原体 16S rDNA 序列（GenBank 登录号：KR061356）同一率均
为 99.8%以上。 2015 年广东各主要稻区及海南中部和广西东南部均有该病发生与分布。
关键词：水稻橙叶病； 植原体； 分子检测； 病情调查
中图分类号：S435.111 文献标识码：A 文章编号：1672-6820（2016）02-0009-04
收稿日期：2015-11-13； 修回日期：2015-12-23
基金项目：农业部农作物病虫鼠害疫情监测与防治项目（2130108）；广东省农业生产与农产品安全质量体系建设项目（2130109）
作者简介：何园歌，硕士研究生。 研究方向为植物病理学。 E-mail：812462989@qq.com
*通讯作者：周国辉，博导，教授，主要从事植物病毒病研究。 E-mail：ghzhou@scau.edu.cn。
Molecular detection of rice orange leaf disease and research on its
occurrence and distribution in Southern China
He Yuange1, Li Shu1, Hao Weijia1, Zheng Jingjun2, Zhong Baoyu2, Zhou Guohui1
（1. College of Agriculture, South China Agricultural University/Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals
and Disease Control, Guangzhou Guangdong 510642, China; 2. Guangdong Forecast and Control Center for Crop Pest and
Disease, Guangzhou Guangdong 510050, China）
Abstract: Investigation and pathogen molecular detection of rice orange leaf （ROL） disease were conducted in rice
growing area of southern China. The results showed that the disease was caused by Phytoplasma transmitted via
leafhoppers Inazuma dorsalis and Nephotettix cinticeps. Leaves of early infected rice plants presented orange -yellow at
tillering stage and soon became withered and died, which caused serious damage to rice production. A large number of
Phytoplasmas were observed in sieve tube cells of infected young leaf under electron microscope. Nest-PCR products were
obtained from DNA extractions of infected rice plants and vector leafhoppers I. dorsalis and N. cinticeps with Phytoplasma
specific primers, and shared over 99.8% nucleotide identities with reported rice orange leaf phytoplasma16S rDNA
sequence （GenBank accession number KR061356）. Field surveys showed that the disease was distributed over southern
China, including most of Guangdong province, central Hainan and southeastern Guangxi in 2015.
Key words: rice orange leaf disease; phytoplasma; molecular detection; disease investigation
9· ·
2016 年 第 2 期
CHINA PLANT PROTECTION 2016 ,Vol ．36 ．No ．2
农
医
生
地区均有发生，80 年代末至 90 年代初在华南局部
稻区造成严重为害［2-3］，此后的十多年间未见严重发
生的报道。 近年来，华南多地又见该病发生，部分地
区发病较重， 据不完全统计， 广东省老病区罗定市
2013 年 和 2015 年 严 重 受 害 面 积 均 超 过 50
hm2，2015 新病区雷州市年见病面积超过 700 hm2，
加强该病的监测防控十分必要。
水稻橙叶病病原最初鉴定为类菌原体 ［4］，1994
年在第 10 届国际菌原体组织大会上把类菌原体改
称为植原体，将其归于原核生物界（细菌）无壁菌门
植原体属。 植原体菌体圆球形或椭圆形， 大小 80～
600 nm，需用电子显微镜观察；菌体外围具双层细
胞膜，无细胞壁，分布于感病植物的韧皮部筛管中，
尚不能体外人工培养。1995年和 1996年张曙光等［5］
和谢双大等［6］报道电光叶蝉是水稻橙叶病的唯一传
播介体；2015 年，Li 等 ［7］报道黑尾叶蝉也是该病的
有效传播介体， 并认为近年华南地区水稻橙叶病的
发生与扩散与黑尾叶蝉种群数量增加有关。 笔者对
水稻橙叶病病原菌进行了分子检测和多年的监测，
发现其呈扩散蔓延之势， 预测未来几年该病害可能
在我国南部稻区流行成灾。
1 材料与方法
1.1 病原菌鉴定及检测
1.1.1 电镜检测
采集广东省罗定市太平镇发病田的水稻橙叶病
稻株幼嫩叶片，切取其为 1 mm 大小的长条，用 0.1
mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）冲洗干净，经戊二醛、四
氧化饿双重固定， 丙酮系列脱水，EPon812 渗透、包
埋、聚合，再用超薄切片机切片，以 2%的醋酸铀染
色，在透射电镜下观察、拍照。
1.1.2 基于病菌 16S rRNA基因的巢式 PCR检测
本研究采用 CTAB 法抽提水稻叶组织或单头
介体叶蝉总 DNA，以植原体通用引物 P1/P7 ［8］（P1
5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT -3’；P7 5’-
CGTCCTTCATCGGCTCTT-3’）和 R16mF2/R16mR2 ［9］
（R16mF2 5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’； R16m -
R2 5’-CTTAACCCCAATCATCGA-3’）进行巢式 PCR
扩增，预期获得水稻橙叶病植原体 16S rDNA 序列。
以抽提的总 DNA 为模板，用引物对 P1/P7 进行第 1
轮 PCR 扩增，扩增产物稀释 50 倍后作为模板，用引
物对 R16mF2/R16mR2 进行第 2 轮 PCR 扩增，扩增
产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色，可在紫
外灯下看到约 1 370 bp的条带。
1.1.3 介体叶蝉带菌率检测
2015 年，采集广东省云浮市、广西壮族自治区
岑溪市和海南省保亭县等地共 62 个点的可疑病株
各 10 株及田间介体叶蝉若干， 运用上述巢式 PCR
技术进行病原菌 16SrRNA 的 PCR 检测， 以检测结
果计算田间介体叶蝉带菌率。
1.2 病情调查
分别于 2015年 4—6月和 8—9月，对华南多地
早稻及晚稻进行了橙叶病病情及介体叶蝉种类和虫
量调查。选择有代表性的水稻种植区，首先通过田边
巡查统计发病田块数； 再以 5点取样调查代表性田
块的病株率。同时，采用口径 40 cm的捕虫网沿稻株
上端 1/3 处扫捕稻田叶蝉， 记录捕获的叶蝉种类和
数量。 采集田间病株及介体叶蝉带回实验室进行水
稻橙叶病植原体检测确认。
2 结果与分析
2.1 病原菌检测
2.1.1 电镜观察
在电镜下观察， 水稻橙叶病病株幼叶叶脉筛管
细胞中存在大量的植原体， 菌体多数为近球形和椭
圆形，有一些为哑铃形，还有一部分为不规则形，在
一些菌体中观察到类似酵母菌出芽状态的结构，也
观察到部分菌体处于二分裂的状态。 菌体大小差异
较大，最小的菌体直径约 80 nm，最大的菌体约 600
nm，平均大小为 320 nm（图 1）。
2.1.2 基于病菌 16S rRNA基因的 PCR检测
植原体的鉴定及检测通常采用分子手段，即
PCR 扩增和测定病菌 16S rRNA 基因或 23S rRNA
基因或两基因间隔区核苷酸序列 ［10］。 本研究巢式
PCR 扩增目的片段大小约 1 370 bp（图 2），随机挑
取 10 个以上不同地区水稻病株及介体电光叶蝉和
黑尾叶蝉阳性样品的特异 PCR 产物进行测序（上海
生工生物工程股份有限公司）， 所得序列在 Gen-
Bank 数据库中经 Blast （NCBI， http：//www.ncbi.
nlm.nih. gov/）比对。 比对结果与文献报道的水稻橙
10· ·
2016 年 第 2 期
CHINA PLANT PROTECTION 2016 ,Vol ．36 ．No ．2
图 1 水稻橙叶植原体电镜观察照片
1 370 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M. DS2000 DNA Marker 扩增产物约 1 370 bp
1～5. 为水稻病株样品 6～8. 电光叶蝉阳性样品
9～10. 黑尾叶蝉阳性样品 11. 水稻健株样品
图 2 水稻橙叶病菌巢式 PCR 产物
经琼脂糖凝胶电泳结果
叶植原体 16S rDNA 的序列 （GenBank 登陆号
KR061356） 同一率均为 99.8%以上。 表明该巢式
PCR 方法能够特异检测水稻植株及介体叶蝉体内
的橙叶植原体。
2.2 病情调查
2.2.1 水稻橙叶病病害症状
水稻橙叶病田间症状：秧苗期发病不明显，移栽
至大田后返青较健株迟， 根系黑褐色不发达； 分蘖
期， 病株基部叶片从叶尖外缘沿叶脉向下呈淡黄到
橙黄色条纹，继而向下或从叶缘向中脉扩展，终致全
叶变橙黄色。 随着病势发展，病株中、上部叶片亦逐
渐变橙黄。 早期感病的水稻植株矮小，生长缓慢，根
系发育不良，分蘖少，叶片短、窄，竖直，病株随后干
枯致死（见 85页彩图水稻橙叶病田间症状 a 植株受
害状），后期感病稻株无明显矮化症状，个别分蘖由
叶尖向下呈橙黄色。 分蘖期至拔节期是病害田间调
查的最佳时期，田边巡查即可见病株，轻病田病株零
星分布，重病田呈大片橙黄色（见 85 页彩图水稻橙
叶病田间症状 b重病田为害状）。 病株易枯黄致死，
少数未枯死的则表现抽穗迟，穗少且扭曲，空粒多，
千粒重下降，或是包颈穗。
2.2.2 介体昆虫发生量及带菌检测
发病田块均发现介体昆虫电光叶蝉和（或）黑尾
叶蝉， 介体昆虫的田间种群密度与病害发生程度呈
正相关。 发病严重的田块介体虫量大，反之，发病较
轻或零星发生的田块介体昆虫少见。 以广东省罗定
市太平镇为例，在水稻橙叶病重病田，来回扫网 10
次，捕捉黑尾叶蝉约 100头，电光叶蝉 7～8头。 无论
是无病田或轻病田及重病田， 黑尾叶蝉虫量均大于
电光叶蝉。 巢式 PCR 检测表明，病田捕获的黑尾叶
蝉均有一定比例个体呈水稻橙叶病植原体阳性。 将
在发病田所捕获的黑尾叶蝉饲喂于健康的 3叶期水
稻幼苗上，14 d 后对水稻植株进行巢式 PCR 检测。
结果显示，部分供试植株呈植原体阳性（图 2），证实
了 Li［7］等的研究结果，即黑尾叶蝉是水稻橙叶病有
效传播介体。
2015 年 4—6 月从广东、广西、海南三省水稻橙
叶病病田采集叶蝉成虫进行巢式 PCR 检测结果表
明，不同地区病田内介体叶蝉的带菌率差异较大，广
东西南部罗定市太平镇黑尾叶蝉和电光叶蝉带菌率
分别达到 83%和 30%，广东东北部兴宁市习坊镇和
新陂镇黑尾叶蝉带菌率均为 46.2%， 海南中南部保
亭县三道镇黑尾叶蝉和电光叶蝉带菌率分别为到
30%和 12%。
2.2.3 水稻橙叶病发生与分布
调查发现，广东、广西、海南 3 省（自治区）均
有水稻橙叶病发生 （图 3）。 不同地区病情差异较
大。 整体上，广东省发病情况较广西壮族自治区及
海南省更为严重。 在广东省内，以茂名市为中心的
云浮市和肇庆市发病较普遍， 西部雷州市和阳江
市、 中部惠州市和河源市以及东北部梅州市均有
不同程度发病田块。 其中，云浮市、雷州市、惠州市
发病较重，尤其是罗定市（云浮）太平镇、罗镜镇田
块发病率达到 25%，多数病田病株率为 1%～10%，
约 10%病田病株率为 10%～30%，少数田块病株率
75%左右。 广西壮族自治区和海南省发病较轻，大
11· ·
2016 年 第 2 期
CHINA PLANT PROTECTION 2016 ,Vol ．36 ．No ．2
农
医
生
图 3 2015 年华南地区水稻橙叶病见病点分布
部分田块为零星发生，病田病株率低于 1%，但见
病区域广泛。
3 讨论
3.1 水稻橙叶病发生趋势预测
20 世纪 90 年代， 水稻橙叶病主要发生于广东
省茂名市及周边地区［3］。 近年该病害分布区域显著
扩大， 不但在毗邻茂名市的罗定市及周边县市连续
3年偏重发生，2015年广东各主要稻区均可见病，而
且在海南西南部乐东市及中南部保亭县以及广西东
南部梧州市见病，部分田块发病较重。这一病害发生
态势值得相关农业部门高度重视。
水稻橙叶病的再发生及扩散蔓延，可能与其新的
传播介体黑尾叶蝉有关。 20 世纪 90 年代的多项研
究 ［5-6］认为，电光叶蝉是水稻橙叶病的唯一传播介体，
黑尾叶蝉不能传病；2015年 Li等［7］报道，黑尾叶蝉也
是该病的有效传播介体。本研究检测结果及传病试验
也证实黑尾叶蝉能传病。 Li等［7］推测认为，可能是病
菌的变异导致其获得了经黑尾叶蝉传播的能力。黑尾
叶蝉是一种广泛分布于我国华南、西南、东南及长江
流域的常见水稻害虫［11］。近年，经对多地稻田调查，发
现水稻橙叶病新介体黑尾叶蝉种群数量迅速上升，极
有可能导致该病害在我国广大稻区扩散蔓延。
黑尾叶蝉及电光叶蝉通常以高龄若虫及成虫在
稻田内及田边杂草上越冬［11］，气候变暖可能导致其越
冬效率提高，从而增加其种群数量。 水稻橙叶病植原
体可在介体叶蝉体内寄生和增殖，在水稻或其他寄主
植物与叶蝉之间辗转侵染扩大菌源量，一旦病害传入
某一稻区，病菌可能在当地逐年积累，导致病害发生
逐年加重。 一般地，介体叶蝉虫量在山区及丘陵地区
大于平原地区，中晚稻田大于早稻田，因此橙叶病有
可能主要发生于山区及丘陵地区的中晚稻上。
3.2 病害防治建议
目前， 生产上尚无针对水稻橙叶病的防治药剂，
对该病的防控需采取针对传病介体的预防性措施，首
先要做好病害测报工作，老病区要进行介体虫量及其
带菌率监测，做好各年度内病害发生趋势预测，新病
区要注意病害逐年积累情况调查， 防止病害突然暴
发成灾；病区内应采用冬季翻耕晒田等农业措施，减
少越冬介体基数，选用抗病虫品种，中、晚稻育秧田
远离早稻发病田块，采用物理隔离或化学防治，减少
带菌叶蝉对秧苗田入侵； 对于分蘖期现症发病田块
可及时清除病株，从健株上掰蘖补苗以减少损失。
参考文献
［1］ Satio Y， Ling K G. MLO associated with rice orange leaf
disease ［J］. Plant Disease Report，1976，60：649-651.
［2］ 吴自强，何云坤，徐守蓉，等 . 水稻橙叶病在云南的发生
［J］. 植物病理学报，1980，10（1）：55-57.
（下转第 21 页）
12· ·
2016 年 第 2 期
CHINA PLANT PROTECTION 2016 ,Vol ．36 ．No ．2
（上接第 12 页）
［3］ 张曙光，谢双大，蔡汉雄，等 . 广东水稻新病害“橙叶病”
在茂名市发生流行 ［J］. 华南农业大学学报，1994，15
（2）：156-157.
［4］ 沈菊英，吴自强，何云昆，等 . 水稻橙叶病在云南的发生
续报［J］. 植物病理学报，1983，13（3）：55-56.
［5］ 张曙光，范怀忠，肖火根，等 . 广东新发生流行的水稻橙
叶病的鉴定［J］. 植物病理学报，1995（3）： 233-237.
［6］ 谢双大， 周小毛， 张曙光， 等 . 广东水稻橙叶病病原
（MLO）的越冬［J］. 植物保护学报，1996，23（1）：29-32.
［7］ Li S， Hao W J， Lu G H， et al. Occurrence and identifica-
tion of a new vector of rice orange leaf phytoplasma in
South China［J］. Plant Disease，2015，99（11）：1483-1487.
［8］ Smart C D， Schneider B， Blomquist C L， et al. Phyto-
plasma-specific PCR primers based on sequences of the
16S-23S rRNA spacer region［J］. Applied and Environ-
mental Microbiology，1996，62（8）：2988-2993.
［9］ Lee I M， Hammond R W， Davis R E， et al. Universal
amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for
classification and identification of mycoplasmalike organ-
isms［J］. Phytopathology，1993，83：834-842.
［10］ 张松柏，张德咏，罗文香，等 . 水稻橙叶病植原体 16S
rDNA 的基因序列分析 ［J］. 华南农业大学学报 ，
2009，30（2）：37-39.
［11］ 王茂华 . 水稻害虫黑尾叶蝉的识别与防治［J］. 农业灾
害研究，2014，4（4）：45-48.
显示， 液氮处理后冷冻保存比直接冷冻保存得到的
基因组 DNA 的质量高；在低温胁迫下，蝗虫标本的
细胞在死亡过程中发生 DNA降解。 研究者证明，植
物在逆境胁迫下会有 DNA 降解［17-20］发生，但在动物
界还没有相似的报道。
参考文献
［1］ 陈永林 . 蝗虫和蝗灾［J］. 生物学通报，1991（11）：9-12.
［2］ 王正军，秦启联，郝树广 . 我国蝗虫暴发成灾的现状及
其持续控制对策［J］. 昆虫知识，2002，39（3）：172-175.
［3］ 郝树广，秦启联，王正军 . 国际蝗虫灾害的防治策略和
技术：现状与展望［J］. 昆虫学报，2002，45（4）：531-537.
［4］ 哈斯巴特尔，高娃，斯琴，等 . 内蒙古草原蝗虫成灾原因
与防治对策［J］. 内蒙古草业，2007，19（4）：52-55.
［5］ 郑哲民 . 蝗虫分类学［M］. 西安：陕西师范大学出版社，
1993.
［6］ 马恩波，郭亚平，郑哲民 . 中国稻蝗属细胞分类学研究
［J］. 中国昆虫科学 （英），1994，1（2）：101-109.
［7］ 康乐 . 草原蝗虫生态学研究［J］. 中国科学院院刊，1998
（3）：204-206.
［8］ Hassanali A，Njag P G ，Bashir M O . Chemical ecology
of locusts and related acridids［J］. Annual Review of En-
tomology，2005，50：223-245.
［9］ 李春选，马恩波，郑先云 . 中国 4 种蝗虫不同种群的遗
传分化［J］. 遗传学报，2003，30（3）：234-244.
［10］ Ustinova J，Achmann R，Cremer S，et al. Long repeats in
a huge genome：Microsatellite loci in the grasshopper
Chorthippus biguttulus ［J］. Journal of Molecular Evolu-
tion，2006，62（2）：158-167.
［11］ 韩海斌，周晓蓉，庞保平，等 . 内蒙古亚洲小车蝗种群
遗传多样性的微卫星分析 ［J］. 昆虫学报 ，2013a，56
（1）：79-87.
［12］ 韩海斌，周晓蓉，庞保平 . 内蒙古 10 种草原蝗虫和亚
洲小车蝗不同地理种群的 ITS2 序列分析 ［J］. 草地学
报，2013b，21（4）：805-811.
［13］ 蒋国芳，郑哲民 . 蝗虫分子系统学研究进展［J］. 昆虫
知识，2001，38（2）：81-86.
［14］ 张建珍， 郭亚平， 马恩波 . 不同保存方式下蝗虫组织
DNA 的提取及 RAPD 分析 ［J］. 动物学杂志，2004，39
（2）：53-57.
［15］ 王义权，周开亚，徐路珊 . 不同固定剂保存动物组织标
本对 RAPD 反应的影响 ［J］. 动物学杂志 ，1999，34
（1）：33-37.
［16］ Paabo S. Ancient DNA：extraction，characterization，
molecular cloning and enzyme amplification ［J］. Pro-
ceedings of National Academy of Sciences of USA，
1989，86：1939-1943.
［17］ 林久生， 王根轩 . 渗透胁迫诱导的小麦叶片细胞程序
性死亡［J］. 植物生理学报，2001，27（3）：221-225.
［18］ 夏慧莉， 陈浩明， 吴逸 . 羟自由基诱导烟草细胞凋亡
［J］. 植物生理学报，1999，25：339-342.
［19］ 曹慧，李春霞，王孝威 . 水分胁迫诱导八棱海棠和平邑
甜茶细胞程序性死亡的研究 ［J］. 园艺学报，2009，36
（4）：469-474.
［20］ Liljeroth E，Bryngelsson T. DNA fragmentation in cereal
roots indicative of programmed root cortical cell death
［J］. Physiologia Plantarum，2001，111（3）：365-372.
...........................................
21· ·