全 文 ：第 30卷 第 2期
2009年 4月 　　　　　　　　　　
华南农业大学学报
JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity　　 　　　　　　　　
Vol.30, No.2
Apr.2009
　收稿日期:2008-07-02
　作者简介:张松柏(1980—), 男 ,助理研究员 , 硕士;通讯作者:李华平(1961—)男 ,教授 ,博士 , E-mail:huaping@scau.edu.cn
　基金项目:国家自然科学基金(30370929, 30771407)
水稻橙叶病植原体 16SrDNA基因的序列分析
张松柏 1, 2 , 张德咏2 , 罗香文 2 , 张曙光 1 , 李华平1
(1华南农业大学 植物病毒研究室 , 广东 广州 510642;2湖南省农业科学院 植物保护研究所 , 湖南 长沙 410125)
摘要:利用植原体 16SrDNA通用引物对水稻橙叶病发病植株的 DNA进行了 PCR扩增和基因克隆.序列测定表
明 , PCR扩增的片段全长为 1 853bp, 包括 1 527bp的水稻橙叶病植原体(RYL)的 16SrDNA基因全序列 、234bp的
邻近间隔区的序列及部分(92 bp)23SrDNA基因序列.序列比较结果表明 , RYL的 16SrDNA全序列与其他植原体
的相似性在 88% ～ 95%, 其中与 Americaasteryelows(AAY, GenBank登录号 X68373)最高相似性为 95%.利用最
大简约法构建的 16SrDNA系统演化树结果表明:RYL与 AAY亲缘关系最近 ,同被聚类为翠菊黄化组 (16SrI).
关键词:水稻橙叶病;植原体;16SrDNA;序列分析
中图分类号:S432.1　　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-411X(2009)02-0037-03
SequenceAnalysisof16SRibosomalDNAofPhytoplasma
AssociatedwithRiceOrangeLeaf
ZHANGSong-bai1, 2 , ZHANGDe-yong2 , LUOXiang-wen2 , ZHANGShu-guang1 , LIHua-ping1
(1 LaboratoryofPlantVirology, SouthChinaAgriculturalUniversity, Guangzhou510642, China;
2 InstituteofPlantProtection, HunanAcademyofAgriculturalScience, Changsha410125, China)
Abstract:Onesetoftheconservedprimerswasdesignedtoamplifya1 853 bpfragmentwhichincluded
16SrDNA(1 527 bp), adjacentspacersequence(234bp)andpartialsequenceof23SrDNA(92bp)
byPCRfromtotalDNAsampleextractedfromdiseasedriceastheamplifiedtemplate.Nucleotidese-
quencingoftheamplifiedfragmentindicatedthatriceorangeleafphytoplasmasharednucleotidesimilarity
about88% to95% withotherphytoplasmasfromdataofGenBank, andamaximumsimilarityat95%
withAmericaasteryelowphytoplasma.Aphylogenetictreebasedon16SribosomalDNAsequenceswas
constructedandshowedthatriceorangeleafphytoplasmawasclusteredintotheCandidatusphytoplasma
asteris, group16SrI.
Keywords:riceorangeleafdisease;phytoplama;16SrDNA;sequence
　　植原体(Phytoplasma),原称类菌原体(Mycoplas-
ma-likeorganism, MLO),能引起许多重要的粮食 、蔬
菜和果树以及观赏作物 、林木的严重病害 ,并造成巨
大损失.目前世界各地先后报道的植原体病害达
300多种 ,我国也报道了 70余种 ,且有不断增加的趋
势.20世纪 70至 80年代 ,我国河北玉田和北京密
云等县金丝小枣发生枣疯病 ,绝产绝收 ,造成巨大的
经济损失[ 1] ;20世纪 90年代 ,广东 、云南等省部分地
区发生水稻橙叶病 ,造成部分地区水稻绝产绝收 ,给
当地水稻生产带来严重损失[ 2-3] .核苷酸序列分析 ,
特别是 16SrDNA的序列分析在植原体系统发育研
究中广泛应用[ 4] ,植原体 16SrRNA基因序列同源性
分析是目前国际上植原体分类和鉴定的最重要的方
法.本研究采用 PCR技术扩增到水稻橙叶病病原的
16SrDNA片段 ,并进行序列测定 ,并将与已知的植
原体序列共同构建系统发育树 ,试图明确其与已知
植原体种类的关系.
1　材料与方法
1.1　材料
水稻疑似病株 ,分别采集于广东省信宜的水稻
品种博优 3550和从化 、高州的水稻品种博优 3550、
博优 903.采集的标样种植于防虫网室或直接保存
于 -70 ℃冰箱待用.
TaqDNA聚合酶 、dNTPs、DNAmarker和提取试
剂(Tris-苯酚 、EDTA、SDS等)等购自北京鼎国生物
技术有限责任公司;pGEM-T载体 、UNIQ-10柱式
PCR产物纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服
务有限公司.
1.2　方法
1.2.1　16SrDNA序列的 PCR扩增和克隆　DNA的
提取方法主要参考宋敏等 [ 5]的水稻 DNA提取法 ,并
进行修改.取水稻病株和健株叶片中脉组织各 1 g
进行 DNA提取;用含 100 g/LSDS的提取缓冲液
(150mmol/LNaC1、100 g/LSDS、250 mmol/LTris-
HC1、50mmol/LEDTA、φ=0.1%巯基乙醇 , pH8.0)
替换 20 g/LCTAB的提取缓冲液.提取的 DNA用
φ=70%的乙醇洗涤 2 ～ 3次 ,干燥后 ,溶解于 50μL
的 TE中.
根据 Smart等 [ 6]报道的植原体保守序列设计特
异引物 ,扩增片段包括 16SrDNA序列和 16SrDNA
与 23SrDNA序列之间的间隔序列.引物由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成 ,其引物序列为:
P1(5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3′),
P7(5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′).
PCR反应体积为 25 μL,其中 10×PCR缓冲液
2.5 μL、DNA模板 10 ng、200 μmol/L的 dNTP0.5
μL、25 pmol/L引物各 1 μL、2 U的 TaqDNA聚合酶
0.5μL.反应条件为:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s, 50 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 35个循环;最后 72℃ 10 min.取
5 μLPCR产物进行 10g/L的琼脂糖凝胶电泳 ,检测
PCR产物的大小和特异性.通过 PCR产物回收试剂
盒纯化扩增的 DNA片段 ,通过常规法克隆入 pGEM-
T载体 ,转化大肠杆菌 EscherichiacoliJM109 ,构建重
组质粒.
1.2.2　序列同源性比较　序列测定由大连宝生物
(华运)工程公司完成.将测定的核苷酸序列登录到
GenBank,登录号为 EU093079.DNA序列同源性比
较通过国际互联网在美国国家生物技术信息中心
(NationalCenterforBiotechnologyInformation, NCBI)
网站进行 ,利用此网站中的分析软件 Blastn比较水
稻橙叶病原 16SrDNA序列与其他植原体 16SrDNA
序列同源性.
通过 Mega3.1软件将测定的水稻橙叶病植原体
16SrDNA基因片段序列与已知植原体各组代表的
相关序列进行同源性比较 ,并构建系统发育树 , 以
Acholeplasmalaidlawi(M23932)作为外群.
2　结果与分析
2.1　16SrDNA序列扩增
水稻橙叶病病株总 DNA经 PCR扩增后产物经
10g/L的琼脂糖凝胶电泳 , EB染色 ,结果见图 1.电
泳结果显示 ,扩增片段大小约为 2 kb,与预计相符 ,
而健康水稻与清水对照均未扩增出特异片段.
1:DNAMarkerDL2000;2、 4:发病水稻标样;3:健康水稻标样;5:
清水对照
图 1　水稻橙叶病植原体 16SrDNA片段 PCR扩增产物凝胶
电泳分析
Fig.1　ElectrophoresisanalysisofPCRproductsfromriceor-
gangeleafphytoplasma16SrDNA
2.2　16SrDNA序列同源性比较
测定的序列全长为 1 853bp,包括 1 527bp的 16S
rDNA基因全序列 、234 bp的邻近间隔区的序列及部
分(92 bp)23SrDNA基因序列.16SrDNA基因 G+C
质量分数为 56.73%,在其基因 3′末端含有植原体 3′
末端保守序列 GATCACCTCCTTTCT.用 blastn在 Gen-
Bank中搜索同源序列 ,结果发现 ,水稻橙叶病植原体
(RYL)的 16SrDNA全序列与其他植原体的相似性在
88% ～ 95%,其中与 Americaasteryelow(AAY, Gen-
Bank登录号 X68373)最高相似性为 95%.
2.3　16SrDNA序列系统发育树构建与分析
通过 16SrDNA片段序列的比较 ,利用 Mega3.1
软件得出 RYL和其他 12个不同组的植原体的系统
进化树状图(图 2).由图 2可见 ,水稻橙叶病植原体
与 AAY亲缘关系很近 ,二者聚为一个分枝 ,同属于
16SrI组植原体.
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图 2　基于水稻橙叶病植原体 16SrDNA序列和其他相关植
原体序列构建的进化树
Fig.2　Phylogenetictreebasedon16SrDNAsequencefromrice
organgeleafandotherrelatedphytoplasmagroups, Acho-
leplasmalailawi(M23932)astheoutgrouptobootthe
tree
3　讨论与结论
水稻橙叶病 1960年在泰国报道零星发生 ,当时
认为病原物可能是病毒 ,在未提取到病毒的情况下
认为可能是生理病害 [ 7] .其后 ,在菲律宾 、印度 、马
来西亚 、印尼和斯里兰卡都有报道零星发生 [ 8-9] .当
时仅仅是利用电镜和组织化学技术对病原菌进行了
形态上的观察.我国对在华南地区发现水稻橙叶病
的电镜和组织化学技术研究都认为该病害病原物是
植原体 [ 2-3] .近年来 ,随着分子生物学的发展 ,采用
PCR技术和测序手段比较不同植原体株系或分离物
16SrDNA片段的遗传差异和同源性的研究方法已
得到众多研究工作者的一致认可.本试验根据 Smart
等 [ 6]的报道设计的引物 ,利用 PCR技术对水稻橙叶
病植原体 16SrDNA进行基因克隆和序列分析 ,从而
进行系统分类研究 ,这在国内外鲜见报道.
本研究通过对 16SrDNA基因片段的序列测定
和同源性比较分析 ,发现水稻橙叶病植原体(RYL)
与其他植原体的相似性在 88% ～ 95%,其中与 A-
mericaasteryelows(GenBank登录号 X68373)最高相
似性为 95%;聚类分析显示 RYL与 Americaaster
yelows的亲缘关系很近而聚为同一分枝.根据 1996
年国际菌原学组织 (InternationizationforMycoplas-
mology, IOM)会议确认的分类系统 ,可以认为 ,水稻
橙叶病植原体和翠菊黄化组(16SrI)的 Americaaster
yelows植原体应同属于植原体 16SrI组.
到目前为止 ,翠菊黄化组 (16SrI)共有 9个亚
组 [ 4] ,水稻橙叶病病原的亚组分类地位 ,还需要进行
该病原核糖体蛋白基因(rp)序列进行分析后才能最
终确定.
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【责任编辑　周志红】
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