全 文 ：植物病理学报
ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA　39(4):377-384(2009)
收稿日期: 2008-03-25;修回日期: 2009-04-19
基金项目:国家科技基础条件平台建设项目(2005DKA21207);国家自然科学基金项目(30471393)
通讯作者:朴春根 ,副研究员 ,主要从事林业菌种保藏;Tel:010-62889516, E-mail:cfcc@forestry.ac.cn
第一作者:李 永(1978-),男 ,山东泰安人 ,助理研究员 ,中国林科院森林生态环境与保护所 ,主要从事植原体与菌种保藏工作。
臭矢菜丛枝病植原体的分子鉴定研究
李 永 , 田国忠 , 徐启聪 , 朴春根＊ , 汪来发 , 郭民伟
(中国林业科学院森林生态环境与保护研究所 国家林业局森林保护学重点实验室 , 北京 100091)
摘要:本实验采用 DAPI荧光显微镜 、PCR、克隆和测序等技术 , 对海南臭矢菜丛枝病样进行了检测和鉴定。以染病臭矢菜
总 DNA为模板应用 3对植原体特异性引物进行 PCR扩增 , 获得 PCR产物为 16SrDNA(1 430 bp)、 16S-23SrDNA(358
bp)、rpDNA(1 294 bp)。应用 DNA回收试剂盒获得了 3个 PCR扩增片断的纯化产物 , 并克隆到 DH5α大肠杆菌中测序。
应用 DNAMAN和 MEGA软件对获得的序列与 NCBI数据库中植原体序列进行同源性分析和构建系统发育树。结果显示
臭矢菜丛枝病植原体与花生丛枝病植原体序列同源性最高 , 16SrDNA的序列同源性为 99.9%, 16S-23SrDNA高达 100%,
rp为 99.7%, 因而将臭矢菜丛枝病植原体归为花生丛枝组(16SrⅡ), 根据 16SrDNA的 RFLP分析 , 将其归为 16SrⅡ -
A亚组。
关键词:臭矢菜丛枝病;植原体;分子鉴定;序列测定
Molecularidentificationofcleomewitches′-broomphytoplasma　LIYong, TIANGuo-
zhong, XUQi-cong, PIAOChun-gen, WANGLai-fa, GuoMin-wei　(ResearchInstituteofForestEcology, En-
vironmentandProtection, TheKeyLaboratoryofStateForestryAdministrationonForestProtection, ChineseAcademyof
Forestry, Beijing100091, China)
Abstract:Cleomewitches′-broomphytoplasma(CWB)colectedfromHainanProvince, wasdetectedandi-
dentifiedusingDAPIfluorescencemicroscopy, PCR, cloneandsequencingtechniques.Threedifferenttypeu-
niversalprimerpairsofphytoplasmawereusedtoamplify1.43kbfragmentof16SrDNA, 0.36 kbfragment
of16S-23SrDNAand1.3 kbfragmentofrpDNA.ThenPCR-amplifiedproductswereclonedandse-
quenced.Theresultsofsequencingandhomologuouscomparisonwithotherphytoplasmasshowedthatcleome
witches′-broomphytoplasmashared99.9 % similaritywithpeanutwitches′-broomphytoplasmain16SrRNA
gene, 100% in16S-23SrRNAgeneand99.7% inrpgene.Cleomewitches′-broomphytoplasmamightbe
sortedintopeanutwitches′-broomgroup(16SrⅡ), 16SrⅡ– AaccordingtotheresultsofRFLPandsequen-
cingof16SrDNA.
Keywords:cleomewitches′-broomdisease;phytoplasma;molecularidentification;sequencing
中图分类号:S432.4　　　文献标识码:A　　　文章编号:0412-0914(2009)04-0377-08
　　植原 体 (phytoplasma), 原 称类 菌 原体
(MLO),为无细胞壁原核微生物 ,尚不能在人工培
养基上离体培养 ,在植物和昆虫中广泛分布。迄
今 ,世界各地已统计有 1 000多种植物自然感染植
原体病害 [ 1] , 我国也报道了 70多种植物植原
体病害 。
20世纪 90年代以来 ,特别是 PCR及分子克隆
等分子技术应用于植原体的研究以后 ,植原体检
测 、鉴定和鉴别技术的很大发展 ,逐步确立了以核
酸信息为主要依据的植原体分类鉴定方法。在
2000年的分类系统中 ,植原体被分成 14个组和 1
个未确定组 , 38个亚组 , 5个候选种 ,即 16SrⅡ的
　
植物病理学报 39卷
CandidatusPhytoplasmaaurantifolia和 Ca.P.aus-
tralasiae, 16SrVⅡ的 Ca.P.fraxini,以及 16SrXⅡ
的 Ca.P.ausraliense和 Ca.P.japonicum[ 2] 。在
2004年 ,国际菌原体研究计划植原体 、螺原体工作
队植原体分类组发表了植原体分类和候选种鉴定
的标准和原则 ,此标准的发表为今后植原体候选种
的鉴定研究工作提供了理论依据 ,在此论文中 ,植
原体被分成了 15个组 , 26个候选种 [ 3] 。
臭矢菜(CleomeviscosaL.)一年生草本 ,花期
7个月 ,可药用 ,生于荒坡 、路旁及田野 ,在我国主要
分布于海南 、广东 、广西 、湖南 、江西 、福建 、浙江 、安
徽 、台湾等地 。我们曾于 2004年首次在海南省三
亚发现了臭矢菜丛枝病的发生与危害 。通过 DAPI
荧光显微镜 、PCR检测 ,初步确定臭矢菜丛枝病是
由植原体侵染引起的病害 。 16SrDNA、 16S-23S
rDNA、rpDNA的克隆 、序列分析和 RFLP分析结
果显示 ,臭矢菜丛枝病植原体分类地位为植原体
属 ,花生丛枝组 16SrⅡ、16SrⅡ-A亚组。
1　材料和方法
1.1　植原体样品
感染植原体的臭矢菜样品采自海南省三亚市
区 ,采集表现典型的丛枝症状枝叶(图 1),同时采
集健康臭矢菜枝叶作阴性对照(图 2)。本试验使
用的阳性对照来自本实验室多年保存的感染泡桐
丛枝病植原体泡桐组织培养苗 。
1.2　DAPI荧光显微镜观察
取新鲜的病株幼茎 、叶柄和叶脉 ,进行徒手切
片 ,然后用 5%戊二醛固定 ,用 1 μg/mL的 4′, 6-
二眯基 -2-苯基吲哚(DAPI)染色 ,最后置于落射荧
光显微镜下检查韧皮部特异性植原体 DNA荧光 ,
激发滤光片波长为 365nm,阻断滤光片波长为 420
nm[ 4] 。
1.3　DNA提取与 PCR扩增
1.3.1　DNA提取　泡桐组培苗截取表现典型丛
枝症状的染病茎叶组织 ,灰叶丛枝样品截取表现典
型丛枝的嫩枝 、叶片组织 ,臭矢菜健康对照截取嫩
枝 、叶片组织 , 用 CTAB法分别提取各植物
总 DNA[ 5] 。
1.3.2　PCR反应　分别应用 3对特异性的植原
体引物对以提取的植物总 DNA进行 PCR扩增 ,引
物对分别为 16SrDNA的引物对 R16 mF2 /R16
mR1[ 5, 6] ;16S-23SrDNA间区引物对 S1/S2[ 7] ;rp
引物对 rpF1C/rp(I)R1[ 8] 。 PCR扩增分设阴性对
照(健康臭矢菜 DNA)和阳性对照(染病泡桐组织
培养苗 DNA)。
1.3.3　电泳检测　PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测(SYBRGreenⅠ染色),用 Sygene凝胶成
像观察 ,并拍照记录电泳检测结果 。
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　4期 李 永 ,等:臭矢菜丛枝病植原体的分子鉴定研究
1.4　植原体 16SrDNA、 16S-23SrDNA间区
DNA片段的克隆与测序
将植原体 16SrDNA、16S-23SrDNA和 rp基因
的 PCR产物经 DNA纯化试剂盒(北京鼎国生物技
术发展中心)纯化后 ,连接到 PMD18-T载体上 ,用
化学转化法转化到大肠杆菌中(DH5α),涂板培养
37℃倒置培养 16 ～ 20 h(选用抗生素为氨苄青霉
素),选取阳性克隆送至上海英骏生物技术有限
公司进行序列测定。应用 DNAMAN5.2.2和 ME-
GA3.1软件对所测臭矢菜丛枝植原体序列与 NC-
BI数据库调出的植原体序列进行同源性比较 ,构
建系统发育树。
1.5　序列同源性比较 、RFLP(PutativeRestric-
tionFragmentLengthPolymorphism)分
析及系统发育树构建
分别从 NCBI核酸数据库(htp://www.ncbi.
nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi)中调出 15个植
原体组中的 30个 16SrDNA序列 、17个 16S-23Sr
DNA序列和 16个 rp基因序列 ,应用 DNAMAN
5.2.2软件分析植原体序列的同源性 。再应用
MEGA3.1软件基于 16SrDNA序列 、 16S-23Sr
DNA序列和 rp基因序列分别构建植原体系统发
育树。
将臭矢菜丛枝病植原体 16SrDNA序列和从
NCBI核酸数据库中调出的 16SrⅡ组中各亚组具
有代表性的植原体 16rDNA序列输入 DNAMAN
5.2.2软件 ,应用 DNAMAN软件酶切位点分析功
能进行 16SrDNA的限制性酶切位点分析 ,进而确
定臭矢菜丛枝病植原体亚组的分类地位 。
2　结果与分析
2.1　DAPI荧光显微镜观察结果
从表现典型丛枝症状的病株的幼茎 、叶柄和叶
脉组织的韧皮部组织的筛管中观察到大量的黄绿
色植原体 DNA荧光存在 ,而在健康对照组织中无
此特异性荧光。从而 ,初步断定臭矢菜丛枝病是由
植原体侵染所致 。
2.2　DNA提取与 PCR扩增
电泳结果显示 , R16 mF2 /R16 mR1引物对成
功的从染病臭矢菜总 DNA中扩增出 1 430 bp的
DNA片段 ,而 S1/S2和 rpF1C/rp(I)R1引物分别
扩增出了 358 bp和 1 294bp的特异性 DNA片段 ,
泡桐 DNA阳性对照都获得了相应大小的 DNA片
段 ,而健康臭矢菜总 DNA均未扩增出特异性 DNA
片段(图 3)。
Fig.3　PCRamplifiedproductofcleomewitches′-broomphytoplasma
1-3:PCRproductof16SrDNA, primers:R16mF2/R16mR1;5-7:PCRproductofSR,
primers:S1/S2;9-11:PCRproductofrpgene, primers:rpF1C/rp(I)R1;4, 8, 12:
DNAmarker;1, 5, 9:Diseasecontrol;2, 6, 10:CWB;3, 7, 11:Healthcontrol.
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　　此 3对引物均为植原体特异性引物 ,而且扩增
DNA片段大小与阳性对照一致 ,因此可以确定臭
矢菜丛枝病是植原体侵染引起的 ,进一步证明了荧
光显微镜检测的结果 。
2.3　基因片段的克隆与同源性分析
16SrDNA克隆 、测序结果显示 ,扩增 DNA片
段长为 1 430个核 苷酸 (GenBank登录 号为
EU513212)。应用 DNAMAN将获得的 16SrDNA
序列与从 NCBI数据库中调出的 30种已知植原体
的 16SrDNA序列进行同源性比较(图 4),结果显
示 ,臭矢菜丛枝病植原体与花生丛枝病植原体和候
选种 Ca.P.australasiae同源性最高 ,分别为 99.8%
和 99.8%,与 16SrⅡ组植原体候选种 Ca.P.auran-
tifolia(GenBank登录号为 U15442)同源性为
98.5%;与 16SrXV组候选种 CandidatusPhytoplas-
mabrasiliense(AF147708)同源性为 96.7%;与其
它候选种的同源性为 82% ～ 92%之间 ,因此臭矢
菜丛枝病植原体与 Ca.P.australasiae候选种相关 。
Fig.4　Phylogenetictreeconstructedbyanalysisof16SrDNAsequences
380
　
　4期 李 永 ,等:臭矢菜丛枝病植原体的分子鉴定研究
　　 16S-23SrDNA间区 DNA克隆 、测序结果显
示 ,臭矢菜丛枝病植原体 16S-23SrDNA间区 DNA
片段核苷酸序列长度为 358 bp(GenBank登录号
为 EU409598 ),包括 16SrDNA下游和 23SrDNA
上游的部分序列。应用 DNAMAN软件将获得的
序列与从 NCBI数据库中调出的 17个序列进行比
较分析(图 5),结果显示 ,臭矢菜丛枝病与花生丛
枝病植原体间区的序列同源性高达 100%,与候选
种 Ca.P. aurantifolia(GenBank登 录 号 为
U15442)同源性为 97.4%;与候选种 Ca.P.bra-
siliense(AF147708)同源性为 89.8%;与其它 11个
候选种的序列同源性低于 81%,此结果与 16SrD-
NA序列分析的结果基本一致。
rp基因 DNA片段的测序结果显示 , 获得 rp
基因的 DNA片段核苷酸序列长度为 1 294 bp
(GenBank登录号为 EU409599),包括核糖体蛋白
基因 L22 (rpl22)和 S3 (rps3)全部序列。应用
DNAMAN软件将获得的序列与从 NCBI数据库中
调出的 16个序列进行比较分析 ,结果显示(图 6),
臭矢菜丛枝病与花生丛枝组植原体间序列同源性
达 99%以上 ,与其他组候选种序列同源性较低 ,此
结果进一步证实了 16SrDNA和 16S-23SrDNA序
列分析的结果。
2.4　RFLP分析及系统发育树构建
RFLP分析结果可以看出(表 1、图 7), 9个限
制性内切酶的酶切片段中 ,臭矢菜丛枝病与花生丛
枝病植原体(16SrⅡ , 16SrⅡ -A)间有 7个内切酶的
酶切片段数相同 ,与番茄巨芽病植原体(16SrⅡ ,
16SrⅡ -E)间有 6个内切酶的酶切片段数相同 ,而
与其它 3个亚组 (16SrⅡ , 16SrⅡ -B, 16SrⅡ-C,
16SrⅡ -D)的植原体间仅有 2 ～ 3个的酶切片段数
相同 ,与猪屎豆丛枝病植原体间有 4个内切酶的酶
切片段数相同 。因此臭矢菜丛枝病植原体应属
16SrⅡ 、 16SrⅡ-A亚组的株系 。
　　根据 3个基因序列构建的系统发育树见图 4
～图 6,从图 4中我们得知 , 30个植原体分成了 4
个稳定的分支 ,臭矢菜丛枝病植原体与花生丛枝病
植原体 、猪屎豆植原体 、Ca.P.australasiae、Ca.P.
aurantifolia、Ca.P.brasiliense等 9个为 1个分支 。
臭矢菜丛枝病植原体与猪屎豆丛枝病植原体亲缘〗
关系最近;其次是花生丛枝病植原体;再次是候选
Fig.5　Phylogenetictreeconstructedbyanalysisof16S-23SrDNAspacesequences
381
　
植物病理学报 39卷
Fig.6　Phylogenetictreeconstructedbyanalysisofrpgenesequences
Table1　Theresultsof16SrDNARFLPanalysisofpeanut
witches′-broomgroup(16SrⅡ )phytoplasma
Phytoplasmas/enzyme Alw26Ⅰ Cfr10Ⅰ DdeⅠ HaeⅢ HphⅠ MaeⅢ MnⅡ MseⅠ TaqⅠ
Peanutwitches′-broomL33765 16SrⅡ -A 2 2 7 3 3 4 14 12 6
CandidatusPhtoplasmaaurantifoliaU15442 16SrⅡ -B 3 3 8 3 4 3 14 10 5
CotonphylodyEF186827 16SrⅡ -C 3 2 8 4 4 3 13 10 4
SweetpotatolittleleafAM180883 16SrⅡ -D 3 2 8 3 3 3 13 11 5
TomatobigbudEF193359 16SrⅡ -E 2 2 7 3 3 4 13 11 5
Cleomewitches′-broomEU513212 2 2 7 3 3 4 14 13 7
Crotalariawitches′-broomDQ653411 2 2 8 3 4 4 15 12 6
种 Ca.P.brasiliense和番茄巨牙病植原体 。图 5
中臭矢菜丛枝病植原体与花生丛枝病植原体亲缘
关系最近 ,与图 4分析结果相近。图 6中 ,花生丛
枝病植原体与番茄巨芽病 、苜蓿丛枝病亲缘关系较
近 ,而臭矢菜丛枝病次之。
3　结论与讨论
本研究首先应用荧光显微镜法和 PCR扩增 、
序列分析 、同源性比较等方法从分子水平上对臭矢
菜丛枝病植原体进行了系统鉴定。确定臭矢菜丛
枝病植原体属 16SrⅡ、16SrⅡ -A亚组的株系 ,与候
选种 Ca.P.australasiae相关。
在细菌中 ,核糖体蛋白基因(rp)是细菌进化
演变的一个重要基因 ,是系统发育研究中非常重要
的信号 。 rp基因比 rRNA基因变异大 , 在细菌
属以下株系区分和分类研究中非常有用 。在植原
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　4期 李 永 ,等:臭矢菜丛枝病植原体的分子鉴定研究
Fig.7　Comparativeanalysisofputativesitesin16SrDNAsequencesofphytoplasma
体株系关系和系统发育研究中 , rp基因揭示出更
多有价值的信息和系统发育的标记 ,能用于 rRNA
基因不易区分的近缘株系的研究 [ 8] 。从本研究中
不同候选种的序列比较数据中可以看出 , 16S
rRNA基因的保守性最高 , 16S-23SrDNA间区序
列其次 , rp基因序列同源性变异最大。但从 16Sr
Ⅱ组 5个亚组的 6个株系同源性比较结果来看 ,以
上 3个基因的变异情况有所不同 , 16SrRNA基因
同源性在 98.4% ～ 99.8%之间 , 16S-23SrDNA间
区序列同源性几乎都是 100%,而 rp基因序列同源
性变异同源性在 90.3% ～ 99.7%之间。本研究中
应用 16S-23SrDNA间区序列未能区分 16SrⅡ组
的 3个植原体株系 。但 rp基因序列变异较 16S
rRNA基因大 ,可以用于植原体株系的区分鉴定 。
基于 3基因构建的系统发育树和序列同源矩
阵显示 ,花生丛枝病植原体与臭矢菜和猪屎豆丛枝
病植原体间的亲缘关系都较近 ,比如臭矢菜丛枝病
植原体 16SrDNA序列与台湾报道的花生丛枝病
植原体相似性为 99.8%,与发生在相同地块的猪
屎豆丛枝病植原体的相似性达 99.9%,仅有 1个
碱基的差异 ,而 16S-23SrDNA区间序列与台湾花
生植原体间同源性高达 100%。臭矢菜丛枝病植
原体与花生丛枝病植原体的 rp基因序列相似性为
99.8%。进一步的系统发育分析也发现三者都处
于最近的进化枝上 ,暗示着它们之间在生物学方面
存在着近缘关系 ,如可能为同时可侵染 3种植物的
同一种植原体 ,或不同的植原体株系 。对海南岛植
原体病害调查结果显示 ,在发生臭矢菜丛枝病的地
块 ,也发现猪屎豆丛枝及其他豆科植物丛枝病的发
生[ 9] ,而据报道在所采集的三亚等地曾发生过花
生丛枝病的为害和流行 [ 10] ,也有其他豆科植物植
原体病害发生的记载 [ 11] 。很可能这些病害之间是
由同一植原体侵染不同寄主 ,或者存在密切的遗传
变异或系统进化关系 。因此下一步有必要开展病
原菌传播媒介 ,嫁接传毒等生物学方面的研究 。通
过进一步的分子证据和生物学实验证明栽培花生
丛枝病与臭矢菜丛枝植原体之间的关系 ,将有助于
海南豆科植物植原体病害流行规律的揭示和病害
的防治。
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责任编辑:曾晓葳
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