全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(5): 549-555(2013)
收稿日期: 2012-08-25; 修回日期: 2013-06-12
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项经费资助(201303025); 国家自然科学基金青年基金项目资助(31000866)
通讯作者: 刘鹏飞,讲师,主要从事杀菌剂药理学研究; Tel:010-62732994, E-mail: pengfeiliu@cau. edu. cn
第一作者: 黄娅蓝,女,重庆人,硕士研究生,从事种子病理与药理研究; E-mail: lisayalan23@yahoo. com. cn。
啶菌口恶唑 Z、E异构体的拆分及其抑菌活性比较
黄娅蓝1, 宁明宇2, 刘鹏飞1*, 黄中乔1, 刘君丽3, 刘西莉1
( 1中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193; 2 全国农业技术推广服务中心种业信息与技术处, 北京 100125;
3 沈阳化工研究院有限公司新农药创制与开发国家重点实验室, 沈阳 110021)
摘要:啶菌口恶唑是一个新型异口恶唑类广谱杀菌剂,为探索其异构体的抑菌活性差异,采用薄层层析、柱层析
和高效液相色谱法对啶菌口恶唑顺反异构体进行了分离和纯度检测,并测定了其对担子菌门、子囊菌门和
无性型真菌类 14 个属 16 株植物病原真菌的离体活性。 试验分离获得了纯度分别为 94. 9%和 95. 0%的
啶菌口恶唑 Z、E异构体。 离体条件下,Z异构体对供试病原真菌 EC50值范围为 0. 000 2 ~ 0. 730 3 μg / mL,E
异构体 EC50值范围为 0. 003 1 ~ 49. 182 7 μg / mL,Z异构体对 14 株病原菌抑菌活性显著(P <0. 01)高于 E
异构体。
关键字:啶菌口恶唑; 异构体; 抑菌活性; 高效液相色谱
Separation of SYP-Z048 Z-, E- isomers and evaluation on their inhibitory activities
to fungi　 HUANG Ya-lan1, NING Ming-yu2, LIU Peng-fei1, HUANG Zhong-qiao1, LIU Jun-li3, LIU Xi-
li1 　 ( 1 College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2 Seed Indudtrial In-
formation and Technology, National Agri-Tech Extension & Service Center, Ministry of Agriculture, Beijing 100125, China; 3
State Key Laboratory of the Discovery and Development of Novel Pesticide, Shenyang Research Institute of Chemical Industry
Co. , Ltd. , Shenyang 110021, China)
Abstract: SYP-Z048 is a new isoxazolidine fungicide targeting a wide range of plant diseases. To separate its i-
somers and evaluate their fungicidal activity, thin layer chromatography (TLC), column chromatography, high
performance liquid chromatography (HPLC) and bioassay analysis were conducted. Z-, E- isomers were separa-
ted and the purities were determined as 94. 9% and 95. 0% . In vitro, both of the isomers inhibited the mycelial
growth of 16 experimented fungi from 14 genera. The results showed that the EC50 values of Z-isomer ranged
from 0. 000 2 to 0. 730 3 μg / mL and the EC50 values of E-isomer ranged from 0. 003 1 to 49. 182 7 μg / mL. For
14 pathogens, the Z-isomer was significantly (P <0. 01) more effective than E-isomer.
Key words: SYP-Z048; isomer; fungicidal activity; HPLC
中图分类号: S482. 2　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)05-0549-07
　 　 农药分子中大量存在着立体异构现象,相同的
分子组成不同的空间排列,可能引起农药异构体在
大气、水体、土壤和生物体内的选择性降解,以及生
物活性的显著差异[1 ~ 3],相关研究引发了人们在农
药开发中对高生物活性、低环境污染的农药异构体
的定向合成及拆分[4 ~ 6]等的高度关注。
国内外很多研究均报道了农药立体异构分子
在杀菌活性方面的差异。 Huang 等[7]对 Macrolac-
tams 和 macrolactones进行了衍生合成,并测定了
合成的 24 对 Z、E 异构体对草坪草褐斑病菌(Rhi-
　
植物病理学报 43 卷
zoctonia solani Kühn)的抑菌活性,结果表明其中 8
个 Z异构体对草坪草褐斑病菌的活性高于对应的
E异构体或与其相当,16 对异构体的 E 异构体活
性高于 Z异构体。 甲氧基丙烯酸酯化合物开发过
程中,研究者发现 E 异构体比 Z 异构体表现出更
高的生物活性,如 9E-嗜球果伞素 A 对点青霉
(Penicillium notatum)的抑菌活性高于 9Z-嗜球果
伞素 A 活性,进一步分析认为,造成 9Z-嗜球果伞
素 A 活性较低的原因主要是与 E 异构体相比,Z
异构体见光易分解[8]。 Woodcock[9]在分析化学结
构与活性关系时指出,立体异构体的活性之间存在
差异,如放线菌酮的异构体那他霉素对清酒酵母
(Saccharomyces sake)的活性为放线菌酮的 32% ,
异放线酮对巴斯德酵母( Saccharomyces pastoria-
nus)抑菌活性为放线菌酮的 30% 。 在国内,Liu 等
[10]报道了杀菌剂精甲霜灵与外混旋体甲霜灵对掘
氏疫霉菌(Phytophthora drechsleri Tucker)活性的
差异,发现前者对病原菌菌丝生长、孢子囊产生和
细胞膜通透性均优于后者。
啶菌口恶唑(试验代号 SYP-Z048)是沈阳化工
研究院有限公司创制的一种结构新颖的新型杀菌
剂,具有保护、治疗及内吸传导活性[11]。 目前有关
啶菌口恶唑的抑菌活性研究发现,啶菌口恶唑在离体
下对子囊菌、担子菌和无性型真菌均具有良好的活
性,田间对黄瓜灰霉等病害具有较好的防效[12 ~ 14],
并初步探明其通过抑制真菌麦角甾醇的生物合成
抑制病原菌生长[15]。 抗药性风险研究表明啶菌口恶
唑是一种低抗药性风险的药剂[16]。 此外,本实验
室前期工作建立了利用反相高效液相色谱对啶菌
口恶唑进行定量分析的方法[17],并且检测到了啶菌
口恶唑原药 Z、E异构体的色谱峰。 但关于啶菌口恶唑
异构体分离及其活性差异的研究尚未见报导,因此
本文拟在分离获得纯度较高的异构体的基础上,利
用菌丝生长速率法测定离体条件下两个异构体对
16 株植物病原真菌的抑菌活性,研究结果将为该
药的田间科学使用提供参考。
1　 试验材料
1. 1　 供试药剂与试剂
92. 4%啶菌口恶唑原药(沈阳化工研究院有限
公司),94. 98%啶菌口恶唑标准品(国家农药质量监
督检验中心,沈阳),4 ℃冰箱保存备用。 分析纯二
氯甲烷、乙腈、甲醇(北京化学试剂公司);色谱级
甲醇(美国 Fisher公司)和MiliQ超纯水经 0. 2 μm
滤膜过滤;200 ~ 300 目硅胶 120℃活化 4 h 备用。
2． 5 cm ×10 cm HSGF254 薄层层析硅胶板(青岛
海洋化工厂分);3 cm × 30 cm 层析柱,内径 0. 3
m玻璃点样毛细管(华西医科大学仪器厂)。
1. 2　 供试仪器
HP1100 高效液相色谱仪 (安捷伦公司),包
括:UV200 紫外可变波长检测器,P200 高压泵,
HP1100 色谱数据处理工作站;KQ-250E 型医用超
声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BÜCH
RE111 型旋转蒸发仪(瑞士);紫外检测仪(DESA-
GA HEIDELBERG);分析天平(北京赛多利斯仪
器系统有限公司)。
1. 3　 供试菌株与培养基
担子菌门:水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)
FBS-3。
子囊菌门:小麦全蚀病菌 (Gaeumannomyces
graminis var. tritici),小麦赤霉病菌(Fusarium gra-
minearum),水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae),水
稻恶苗病菌(F. moniliforme) JLX4,苹果轮纹病菌
(Botryosphaeria berengriana f. sp. piricola),苹果
腐烂病菌 ( Valsa mali),桃褐腐病菌 (Monilinia
fructicola),油菜菌核病菌 ( Sclerotinia scleotio-
rum),黄瓜灰霉病菌 (Botrytis cinerea) S1、H14、
P15,玉米弯孢病菌(Curvularia lunata)。
无性型真菌类:辣椒早疫病菌(Alternaria sola-
ni),黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum),黄瓜
枯萎病菌(F. oxysporium f. sp. cucumerinum)。
供试菌株由中国农业大学种子病理与药理实
验室提供。
培养基:PDA培养基[18]。
2　 试验方法
2. 1　 啶菌口恶唑异构体分离纯化及含量测定
2. 1. 1　 柱层析淋洗液筛选 　 根据文献[19]报道
方法优化溶剂淋洗条件,建立啶菌口恶唑的 TLC-
HPLC分离纯化方法。 具体为啶菌口恶唑原药以二氯
甲烷配制成 3 000 μg / mL 母液,用玻璃点样毛细管
吸取药液点样于硅胶层析薄板上,配制二氯甲烷
055
　
　 5 期 　 　 黄娅蓝,等:啶菌口恶唑 Z、E异构体的分离及其抑菌活性比较
(A)和乙腈(E)混合溶剂 B(v ∶ v = 2∶ 1)、C(v∶ v =
1∶ 1)、D(v∶ v =1∶ 2),溶剂平衡后用 A ~ E分别对薄
板进行展开,采用紫外检测仪在 254 nm波长下进行
检测,根据迁移率 Rf值筛选合适比例的展开剂用于
柱层析淋洗。
2. 1. 2　 啶菌口恶唑异构体分离纯化　 称取已活化硅
胶 30 g至烧杯中,加入溶剂 B 15 mL,搅拌均匀并超
声脱气 20 min备用。 采用湿法装柱,依次向层析柱
中装入 2 cm高无水硫酸钠、硅胶、2 cm高无水硫酸
钠。 取啶菌口恶唑母液上样,用 50 mL 溶剂 B 预淋
洗,300 mL混合溶剂淋洗,每 10 mL一个馏分,共得
到 30个馏分,上样和淋洗过程中保持硅胶柱湿润。
采用薄层层析法分别对 30个馏分进行纯度初测,分
别合并 Z、E异构体馏分,40℃水浴中减压旋转蒸发
浓缩近干,氮气吹干,4℃冰箱保存备用。
2. 1. 3 　 啶菌口恶唑异构体含量检测　 参考 Han 等
[17]报道的方法,采用 HPLC 分别对柱层析分离获
得的啶菌口恶唑 Z、E 两个异构体中有效成分含量进
行检测。 检测条件是色谱柱:250 mm × 4. 6 mm
( i. d. )不锈钢色谱柱,填料 Eclipse XDB-C18,5
μm;UV检测波长:220 nm;流速:1. 0 mL / min;柱
温 25℃;进样量:5 μL;过滤器:滤膜孔径约 0. 45
μm;流动相为甲醇∶水(v∶ v =65∶ 35)。
2. 2　 啶菌口恶唑异构体抑菌活性测定
采用生长速率法[18]测定啶菌口恶唑 Z、E 异构
体对 16 株病原真菌的离体抑菌活性。 具体为将啶
菌口恶唑 Z、E异构体分别用甲醇配制成浓度为 480
μg / mL母液,梯度稀释后按照 1‰培养基体积添加
到 PDA培养基中,制成系列浓度含药平板,以甲醇
处理作空白对照,每个处理 3 次重复。 接种直径为
5 mm的病原菌菌饼于平板中央,25℃培养箱中黑
暗培养,对照菌落直径达到 7 cm时,采用十字交叉
法测量菌落直径,计算药剂对病原菌菌丝生长的抑
制率,并分别计算出 Z、E 异构体对病原菌的 EC50
值,然后在 DPS 软件中采用 LSD 法对两异构体对
同一种供试菌的抑菌活性进行差异显著性分析。
3　 结果与分析
3. 1　 啶菌口恶唑 Z、E异构体分离及纯度检测
3. 1. 1　 啶菌口恶唑 Z、E 异构体分离 　 薄层层析板
上二氯甲烷与乙腈系列溶剂对啶菌口恶唑 Z、E 异构
展开效果如图 1 所示,两种纯溶剂展开均未使异构
体获得有效的分离,二氯甲烷由于极性过低,使药
剂的迁移率(Rf)几乎为 0,而乙腈则使样品点推至
展开前端,异构体分离效果亦较差。 二氯甲烷与乙
腈混合溶剂均可使异构体在一定程度上获得分离,
展开剂 B、C、D 对啶菌口恶唑 Z、E 异构相对迁移率
差值分别为 0. 07、0. 06、0. 05,以溶剂 B 展开效果
最好(表 1)。
Fig. 1 　 TLC chromatograms of Z-, E-SYP-
Z048 developed by dichloromethane
and acetonitrile
A, 1∶ 0; B, 2∶ 1; C, 1∶ 1; D, 1∶ 2; E, 0∶ 1; ▲,Z-isomer;
△,E-isomer.
　 　 综合考虑淋洗时间与分离效果,选择二氯甲
烷∶乙腈 1. 7∶ 1. 0(v∶ v)作为柱层析的淋洗剂进行
异构体的分离纯化。 通过薄层检测合并纯度较高
的 Z、E异构体馏分,采用旋转蒸发和氮气吹扫进
行浓缩,获得浅黄色液态 Z异构体和浅黄色固态 E
异构体,4℃冰箱保存备用。
3. 1. 2 　 啶菌口恶唑 Z、E 异构体纯度检测 　 利用
2． 1. 3 液相色谱检测条件,对分离得到的啶菌口恶唑
Z、E异构体分别进行含量分析,得到异构体与标准
样品的色谱峰(图 2)。 检测条件下,Z、E 异构体保
留时间分别为 13. 41 min 和 16. 04 min,有效成分
含量分别为 94. 9%和 95. 0% 。 表明采用试验获得
的层析柱展开条件可以得到纯度较高的啶菌口恶唑
Z、E异构体。
155
　
植物病理学报 43 卷
Table 1　 Migrating rate of Z-, E-SYP-Z048 developed by dichloromethane and acetonitrile
Developed agent
dichloromethane∶ acetonitrile(v∶ v)
Rf
Z-SYP-Z048 E-SYP-Z048
A (1∶ 0) 0. 00 0. 00
B (2∶ 1) 0. 56 0. 49
C (1∶ 1) 0. 64 0. 58
D (1∶ 2) 0. 74 0. 69
E (0∶ 1) 0. 80 0. 78
Fig. 2　 HPLC chromatograms of SYP-Z048 standard and Z-, E- isomers
A: standard; B: Z-isomer; C: E-isomer; areas were determined at 220 nm.
3. 2　 啶菌口恶唑异构体活性测定
啶菌口恶唑 Z、E 异构体在离体条件下,对供试
14 个属 16 株病原菌毒力回归方程、相关系数( r)
及 EC50值进行测定(表 2)。 结果表明,啶菌口恶唑 Z
异构体对供试病原菌 EC50值范围是 0. 000 2 ~0. 723
9 μg / mL,表现为高效广谱的抑菌活性。 E 异构体
EC50值范围是 0. 002 9 ~ 42. 766 μg / mL,对半数以
上供试菌 EC50值小于 1 μg / mL,活性亦较高。 两
异构体对供试的 16 株担子菌门、子囊菌门以及无
性型真菌类植物病原菌均表现为良好的抑菌活性。
这与啶菌口恶唑在离体条件下对黄瓜灰霉病菌、黄瓜
枯萎病菌、番茄叶霉病菌等 7 种植物病原真菌均具
有较好抑菌活性[13],以及在田间病害防治中,对黄
瓜灰霉病和叶霉病[11, 15, 20]、黄瓜灰霉病[14]、小麦
和黄瓜白粉病、苹果斑点落叶病防效优异[21]的报
道相吻合。
　 　 比较啶菌口恶唑 Z、E 异构体对担子菌门、子囊
菌门以及无性型真菌类植物病原菌离体活性差异。
结果发现,P <0. 01 水平上,在子囊菌门真菌中,两
异构体除黄瓜灰霉病菌 S1 抑菌活性无显著差异
外,对其余供试病原菌,Z 异构体的抑菌活性均显
著高于 E 异构体。 其中,啶菌口恶唑 Z 异构与 E 异
构体对小麦全蚀病菌活性差异尤为显著,前者活性
是后者的 127 倍。 无性形真菌中,Z 异构体对辣椒
早疫病菌、黄瓜黑星病菌、黄瓜枯萎病菌的抑菌活
性亦显著高于 E异构体,而异构体对担子菌门真菌
水稻纹枯病菌抑菌活性无显著差异。
对于灰霉病菌 H14、P15,Z 异构体活性则显著
高于 E异构体活性,表明同一种病原菌不同菌株之
间对啶菌口恶唑 Z、E 异构体敏感性存在较大差异,
与马建英报道的不同黄瓜灰霉病菌菌株对啶菌口恶
唑原药敏感性存在较大差异结果相吻合[22]。
255
　
　 5 期 　 　 黄娅蓝,等:啶菌口恶唑 Z、E异构体的分离及其抑菌活性比较 355
　
植物病理学报 43 卷
4　 结论与讨论
通过建立的薄层层析、柱层析和高效液相色谱
方法分离得到啶菌口恶唑 Z、E 异构体,含量分别为
94. 9%和 95. 0% 。 通过菌丝生长速率法测定了啶
菌口恶唑 Z、E 异构体对担子菌门、子囊菌门和无性
型真菌类 14 个属植物病原真菌均具有良好的离体
抑菌活性,Z、E 异构体除对水稻纹枯病菌、黄瓜灰
霉病菌 S1 抑菌活性无显著差异外,对其它供试病
原菌的抑菌活性在 P < 0. 01 水平上都有显著差
异。
啶菌口恶唑与三唑类杀菌剂同属于麦角甾醇生
物合成抑制剂,而三唑类药剂分子结构中通常含有
1 个或 2 个手性中心。 已有报道对三唑类杀菌剂
异构体的拆分检测主要是通过色谱分离实现的,主
要包括高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、
毛细管电泳(CE),超临界色谱(SFC)和气相色谱
(GC)等[23 ~ 25]。 如王鹏等利用纤维素-三( 3, 5-二
甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相,采用高效液相
色谱对烯唑醇、戊唑醇、已唑醇、三唑酮和粉唑醇对
映异构体进行了拆分,获得了良好的分离度[26 ~ 28]。
本文对啶菌口恶唑进行了顺反异构体拆分,在检测
的基础上制备了一定量纯度较高的化合物,并对异
构体抑菌活性差异进行了研究,结果显示啶菌口恶
唑 Z 异构体在多数病原菌上活性均高于 E 异构
体。 这有别于多数文献报道只关注异构体拆分检
测方法,而对异构体拆分制备及其活性关注较少的
情况。 但是对于啶菌口恶唑分子是否分别存在活性
差异显著的旋光异构体,以及异构体活性差异的产
生机制等,仍需在进一步分离的基础上进行深入研
究。
总体评价认为啶菌口恶唑 Z、E 异构体杀菌谱均
较广,虽然对部分真菌活性存在差异,但两者均具
有较好的抑菌活性。 因此在施用该药剂时,可将两
异构体混合使用,但是 Z、E 异构体抗药性风险是
否存在差异,以及以何种比例混合才能达到最好的
田间防病效果,合理控制抗药性的发生,并减少药
剂的田间使用量,仍需进一步研究探明。
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责任编辑:张宗英
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