全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 236-241(2012)
收稿日期: 2011-09-22; 修回日期: 2012-01-07
基金项目: 国家支撑计划项目(2012BAD15B04-1); 湖南省高校创新平台开放基金项目(11K033)
通讯作者: 高必达,教授,主要从事分子植物病理学研究; Tel: 18907315217, Fax: 0731-84635136, E-mail: bdgao@yahoo. com. cn
第一作者: 王晓丽(1987 - ),女,湖南湘乡人,硕士研究生,主要从事分子植物病理学研究; E-mail: vfankiki@yahoo. com. cn。
朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病病原的分离与鉴定
王晓丽1, 夏 花1, 张平喜2, 朱宏建1, 高必达1*
( 1湖南农业大学生物安全科技学院, 长沙 410128; 2常德市农业科学研究所, 常德 415000)
摘要:在湖南省常德市西洞庭管区种植的朝鲜蓟(Cynara scolumus L. )上发现了一种新的病害,其症状表现为地上部分从
外层叶片开始逐步枯萎,随后根部和主茎杆的髓部腐烂变褐,最后整株枯萎。 从田间感病朝鲜蓟茎杆的病健交界处用 NA
培养基分离,获得 10 个菌株,分别指定为 HNXDT001 ~ 010,并进行了致病性测定、形态观察和细菌学特征分析,同时对
HNXDT002 菌株进行分子生物学鉴定。 结果表明,该系列菌株在 NA培养基上均形成灰白色圆形菌落,稍突起,有光泽,半
透明。 在显微镜下菌体呈短杆状,两端钝圆,具有 2 ~ 8 根周生鞭毛,革兰氏阴性。 10 个菌株通过针刺法接种均可导致朝鲜
蓟茎杆、胡萝卜、辣椒、白菜、土豆、番茄和莴苣茎杆软腐,经科赫法则验证为致病病原菌。 该菌株的 16S rDNA序列和果胶
酶基因片段测序(分别用 16S rDNA通用引物 16SF / 16SR和果胶酶基因引物 Y1 / Y2 扩增)与系统发育学分析表明,其 16S
rDNA序列(GenBank Accession No. JF721958)与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp. ca-
rotovorum)菌株 ATCC15713 (GenBank Accession No. U80197)序列同源性高达 99% ;果胶酶基因序列(GenBank Accession
No. JF721960)与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) PC1 菌株(GenBank
Accession No. CP001657)序列同源性为 93% 。 结果表明:朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病病原为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚
种。
关键词:朝鲜蓟; 根茎腐烂病; 果胶杆菌属; 鉴定; 16S rDNA
Isolation and identification of bacterial pathogen causing stem and root rot on
artichoke　 WANG Xiao-li1, XIA Hua1, ZHANG Ping-xi2, ZHU Hong-jian1, GAO Bi-da1 　 ( 1College of
Bio-safety Science Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2Changde Agriculture & Science
Research Institute, Changde 415000, China)
Abstract: A new disease on globe artichoke (Cynara scolymus L. ) was observed in commercial fields in
Changde, Hunan Province, China. Typical symptoms were wilting and necrosis from the outermost leaves,
dark brown discoloration of the vascular tissue and pith of main stem. Eventually, the plants wilted and died.
Manual weeding and cuttings often led to the development of typical soft rot during propagation. To investigate
the causal agent of the disease, isolations were made from rotted stems of field artichoke plants on nutrient agar
(NA) . Bacteria consistently isolated from the diseased tissues formed grey-white, glossy, convex, translu-
cent, and round colonies on NA. The bacterial cells were gram-negative rods with 2 to 8 peritrichous flagella
and rounded ends under the microscope. In artificial inoculation test, these isolates could also cause stem rot of
Chinese cabbage, pepper, lettuce and artichoke, and slice rot of carrot, tomato and potato within 48 h at
28℃. The results demonstrated that these isolates are causative agent of soft-rot disease. PCR amplification
was carried out by utilizing universal 16S rDNA primer pair 16SF / 16SR and pel gene primers Y1 / Y2. The
16S rDNA and pel gene sequences of isolate HNXDT002 (GenBank accessions JF721958 and JF721960,
respectively) had 99% and 93% nucleotide identity with strains of Pectobacterium carotovorum subsp.
　
　 3 期 　 　 王晓丽,等:朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病病原的分离与鉴定
carotovorum (GenBank accessions U80197 and CP001657, respectively) . It came to the conclusion that the
causal agent of soft-rot disease on artichoke belonged to Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.
Key words: Cynara scolymus L. ; stem and root rot; Pectobacterium;identification; 16S rDNA
中图分类号: S432. 1　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)03-0236-06
　 　 朝鲜蓟(Cynara scolymus L. )又名洋蓟、菊蓟,
为菊科多年生草本植物, 因其花蕾形似百合而得
名“法国百合”。 原产地中海沿岸,欧洲南部及北
非。 其食用部分为肉质花托及花托的肥嫩苞片。
朝鲜蓟富含钾、磷、铁等矿质元素,蛋白质和氨基酸
含量也较高,含有较多的果糖和葡萄糖,其它营养
成分也较为均衡[1]。 朝鲜蓟作为一种冬季特色作
物,具有很高的经济价值。 在湖南常德西洞庭管
区,种植朝鲜蓟的农业纯收入可达 12 000
元·hm -2,推广朝鲜蓟与其他作物套种,可大大提
高农业效益。 但抽薹现蕾时的烂蔸死株现象却给
朝鲜蓟生产造成了严重危害[2],症状为感病植株
的地上部分从外层叶片开始逐步枯萎,随后根部和
主茎杆的髓部变褐腐烂,最后整株枯萎。 除草造成
的机械伤害或虫害等会加重此病害的发生。 2008
~ 2010 连续三年该病都有不同程度的发生,造成
的损失分别为 5% ,35%和 4% 。 目前,尚无对该病
的病原菌进行鉴定和系统研究的报道。 为此,本文
对引起朝鲜蓟根茎腐烂病的病原菌进行了分离
鉴定。
1　 材料与方法
1. 1　 病原菌的分离与纯化
从田间采集发病朝鲜蓟植株,主茎杆基部表面
用自来水冲洗,再用无菌水冲洗,70%的乙醇表面
消毒,待风干后用无菌刀将主茎杆基部纵剖开,取
病健交界处组织在 1 mL 无菌水中捣碎,用无菌接
种环蘸取 3 环放入另 1 mL 无菌水中混匀,再从中
取三环放入第三个 1 mL 无菌水中混匀。 取后两
个较低浓度的稀释液各 500 μL 放入无菌平皿中,
各倒入冷却至约 50℃的 NA培养基 15 ~ 20 mL 后
混匀,待冷却凝固后倒置放入 28℃温箱中培养 20
~ 30 h。 挑取优势单菌落转接纯化 3 次。
1. 2　 致病性测定
1. 2. 1　 针刺菌液法　 在田间选取健康的朝鲜蓟植
株,主茎杆基部表面用 70%的乙醇表面消毒,用无
菌针在表面扎 5 个孔,将无菌棉花放入浓度为
108 cfu·mL -1的病菌悬浮液中浸湿后用胶带绑在
扎孔处,另设无菌水和空白培养液对照组,28℃放
置,每天观察发病情况。
1. 2. 2　 单菌落针刺法　 将朝鲜蓟茎杆、胡萝卜、辣
椒、土豆、白菜梆、番茄和莴苣表面用 70%乙醇消
毒后,用无菌刀切片,用无菌针沾取单菌落在白菜
梆、辣椒和番茄的表面、朝鲜蓟茎杆、胡萝卜、土豆
和莴苣横切面的中心刺三个孔后,置垫有湿润滤纸
的无菌平皿中。 对照组用无菌针扎孔。 28℃保湿
培养,每天观察发病情况。
1. 2. 3　 病原菌重新分离　 取田间经人工接种后明
显发病的植株,按照 1. 1 的方法重新分离病原菌。
1. 3　 病原菌的形态鉴定
对回接试验中已确定的具有致病性的细菌进
行菌落形态观察,革兰氏染色,鞭毛染色。
1. 4　 病原菌的生理生化反应鉴定
使用法国梅里埃公司的 API 20E 鉴定条进行
鉴定。
1. 5　 16S rDNA序列和果胶酶基因的扩增和序列
分析
1. 5. 1　 病原菌基因组 DNA 的提取　 用无菌牙签
挑取在 NA 培养基上 28℃培养 20 ~ 30 h 的单菌
落,洗入 10 μL无菌去离子水中,99℃处理 10 min,
离心后收集上清液,置于冰上备用。
1. 5. 2　 16S rDNA序列和果胶酶基因的扩增　 分
别用 16S rDNA 序列通用引物和果胶杆菌果胶酶
扩增引物[3]对细菌总 DNA 进行扩增。 16S rDNA
序列扩增正向引物 16SF 为:5′-AGAGTTTGATC-
CTGGCTCAG-3′, 反向引物 16SR 为: 5′-AAG-
GAGGTGATCCAGCCGCA-3′,预计扩增片段约为
1 500 bp;果胶酶基因扩增正向引物 Y1 为:5′-
732
　
植物病理学报 42 卷
TTACCGGAGCCCGAGCTGTGGCGT-3′, 反向引
物 Y2 为:5′-CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-
3′,预计扩增片段约为 450 bp。 PCR 扩增体系
(25 μL):DNA 扩增模板 1 μL,10 × PCR Buffer
2.5 μL,dNTPs(10 mM)0. 5 μL,Taq酶(2. 5 u·μL -1)
0. 5 μL,Forward Primer (10 μM) 1 μL,Reverse
Primer( 10 μM) 1 μL, ddH2O 18. 5 μL。 16S
rDNA序列扩增条件:预变性 94℃ 5 min; 94℃
30 s,56℃ 30 s,72℃ 90 s,30 个循环;72℃ 10 min
延伸。 果胶酶基因扩增条件:预变性 94℃ 5 min;
94℃ 30 s,65℃ 30 s,72℃ 60 s,30 个循环;72℃
10 min 延伸。 反应终止后,取 5 μL PCR产物,1%
琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1. 5. 3　 PCR产物的克隆测序　 采用 TIANGEN公
司的琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收目的片段;
连接到 PUM-Teasy Vector(Bioteke 公司产品);转
化 E. coli Top10 菌体;挑取阳性单菌落培养,提取
质粒和电泳检测确认后进行测序。 所测序列与
GeneBank中对应数据进行相似性比对,将 HNX-
DT002 序列与其相似序列用 mega4 软件构件系统
发育树。
2　 结果与分析
2. 1　 病原菌的分离与回接试验
从湖南常德西洞庭采到的感病植株(图 1)表现
为叶片由外至内枯萎, 根部和主茎杆的髓部变褐腐
烂(图 2)。 从腐烂髓部的病健交界处分离纯化 10
株优势明显菌落,分别命名为 HNXDT001-010。
Fig.1　 Symptom of infected artichoke plant in field Fig. 2　 Symptom of infected artichoke stem
Fig. 3　 Symptom produced on carrot,artichoke stem,pepper,lettuce stem,tomato,
potato and Chinese cabbage by inoculation of HNXDT002
1,3,6,8,10,12,14: Symptom produced by HNXDT002; 2,4,5,7,9,11,13: Negative control.
832
　
　 3 期 　 　 王晓丽,等:朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病病原的分离与鉴定
　 　 对这 10 个菌株和无菌水以及空白培养液分别
在朝鲜蓟植株上进行了回接试验。 结果显示,针刺
菌液法接种后 72 h 后朝鲜蓟植株出现枯萎症状,
同时髓部变褐腐烂。 而对照组没有引发软腐症状。
　 　 对接种发病后的植株按照方法 1. 1 重新分离
病原菌,结果分离到形态同原来完全一致的病原
菌。 可见,它们是引起朝鲜蓟根茎腐烂病病原菌的
的致病菌。 其它形态的非优势细菌接种,没有表现
腐烂症状。
进一步研究了所分离的优势菌株对其它植物
的致病性,用单菌落针刺接种 18 ~ 24 h 即可导致
鲜蓟茎杆、胡萝卜、辣椒、土豆、白菜梆、番茄和莴苣
切片出现软腐病变,并伴随有恶臭。 HNXDT002
菌株的致病性试验结果见图 3。 表明其具有广谱
致病性。 而对照组没有出现软腐症状。
2. 2　 菌株的形态观察和生理生化分析
HNXDT001-010菌株在 NA培养基上均形成灰
白色圆形菌落,稍突起,有光泽,半透明。 鞭毛染色
结果见图 4。 其基本特征为:G-,菌体短杆状,两端
钝圆,周生鞭毛 2 ~8根。 其生理生化特征见表 1。
　 　 10 株细菌的 API生化谱均为 1245373,鉴定结
果为欧文氏菌,鉴定百分率为 92. 9% , T 值为
0． 85。
以上所描述的 HNXDT001 ~ 010 菌株的形态
特征和细菌学特征,都与对照菌株胡萝卜果胶杆菌
胡 萝 卜 亚 种 PCC1000 ( GenBank accession
JF721959,由湖南农业大学分子与植物病理实验室
Fig. 4　 Bacterial cell shape and flagella of strain HNXDT002 after flagellum staining(1 000 × )
Table 1　 Main bacteriological characteristics of HNXDT001-HNXDT010
Item Result Item Result
Catalase + Acid produced from glucose +
Oxydase _ Acid produced from inositol +
Arginine dihydrolase _ Acid produced from rhamnose +
Lysine decarboxylase _ Acid produced from melibiose +
Ornithine decarboxylase _ Acid produced from arabinose +
Tryptophan ammonialyase _ Acid produced from mannitol +
Urease _ Acid produced from sorbierite _
Gelatin liquefaction _ Acid produced from sucrose +
Galactosidase + Acid produced from amarogentin +
H2S _ VP +
+ :Positive reaction;-:Negative reaction.
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提供)的相似程度很大。
2. 3　 HNXDT002 的 16S rDNA 序列和果胶酶基
因测定分析结果
由于 10 株菌株在形态和生理生化特征上表现
高度相似性,本研究选用其中一个菌株即 HNX-
DT002 进行分子生物学鉴定。
电泳结果见图 5 和图 6,扩增目标片段大小符
合预期。 将片段割胶回收,连接入载体后转化进
E. coli Top10 菌株,挑取白色阳性菌落提取质粒,
送上海生工测序,结果显示扩增片段大小分别为
408 bp,1 479 bp。
Fig. 5　 Pel gene eletrophoresis of PCR ampli-
fication products of HNXDT-002 by
primer Y1 / Y2
M:100 bp DNA Ladder ( TIANGEN); 1:HNXDT002;2:
Negative control.
　 　 与 NCBI(http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov)上
相似序列经 BLAST 比对结果表明:其 16S rDNA
序列与多株胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种,
如 ATCC15713 菌 株 ( GenBank Accession No.
U80197)序列同源性达 99% ;其果胶酶基因序列与
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种菌株 PC1
(GenBank Accession No. CP001657)序列同源性
达 93% 。 采用 MEGA4 软件以 16S rDNA 相似序
列构建的系统发育树见图 7。
Fig. 6 　 16S rDNA eletrophoresis of PCR am-
plification products of HNXDT-002 by
primer 16SF / 16SRK)
M: DL2000 Marker ( TaKaRa); 1: Negative control; 2:
HNXDT002.
3　 讨论
据了解,湖南常德西洞庭湖区朝鲜蓟种植面积
已达 1 000 hm2。 细菌性根茎腐烂病的发生造成了
严重的经济损失,极大地打击了农民种植朝鲜蓟的
积极性。 因此,有必要对该病进行流行病学和田间
综合防治的研究。
朝鲜蓟是一种价值可观的冬季农作物[2],有
关于其高产栽培技术的研究引起人们的广泛关注。
在众多有关朝鲜蓟栽培技术的文献中都提及过朝
鲜蓟根腐病[4 ~ 6],症状为茎髓及根部腐烂变黑,整
株萎蔫倒伏,根腐病的发生规律、病症特点等都与
本文中报道的朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病极为相似。
但在朝鲜蓟病害相关报道中,未见对根腐病病原的
系统性报道。 若要明确朝鲜蓟的这两种疾病是否
为同一种病原引起,还需对这两种病的病原进行研
究对比。
翻阅近十年国内外朝鲜蓟的相关病害的报道,
国内除了 Liu等[7]报道了有关朝鲜蓟根结线虫的
发生规律与防治外,未见其他有关朝鲜蓟病害的系
统性研究报道。 国外已报道的朝鲜蓟病害有斑状
褪绿矮化病(APCS) [8],斑萎病[9],霜霉病[10],黄
萎病[11],黑腐病 [12],细菌性苞片斑点病 [13]和
线虫病害[14]等。近年来,曾报道过胡萝卜软腐果
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　 3 期 　 　 王晓丽,等:朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病病原的分离与鉴定
Fig. 7　 Phylogenesis of 16S rDNA of HNXDT002 with related bacteria nucleotide substitutions
胶杆菌引起半夏[15]和大白菜[16]等的软腐病。 本
文中所报道的胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种
(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)
引起朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病,在国内外都属首次
报道。
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责任编辑:李晖
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