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Identification of Tobacco mild green mosaic virus infecting pepper

辣椒上烟草轻型绿花叶病毒的鉴定



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  43(6): 651 ̄654(2013)
收稿日期: 2012 ̄10 ̄20ꎻ 修回日期: 2013 ̄10 ̄08
基金项目: 国家质检总局项目(2013IK286)
通讯作者: 陈红运ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病毒检测技术研究ꎻ E ̄mail: tobamovirus@163.comꎮ
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研究简报
辣椒上烟草轻型绿花叶病毒的鉴定
陈 青1ꎬ 廖富荣1ꎬ 陈红运1∗ꎬ 谢毅璇2ꎬ 陈加福2ꎬ 蔡金镭2ꎬ 林石明1
( 1厦门出入境检验检疫局ꎬ 厦门 361026ꎻ 2 厦门市植保植检站ꎬ 厦门 361003)
Identification of Tobacco mild green mosaic virus infecting pepper   CHEN Qing1ꎬ
LIAO Fu ̄rong1ꎬ CHEN Hong ̄yun1ꎬ XIE Yi ̄xuan2ꎬ CHEN Jia ̄fu2ꎬ CAI Jin ̄lei2ꎬ LIN Shi ̄ming1   ( 1 Xiamen
Entry ̄Exit Inspection and Quarantine Bureauꎬ Xiamen 361026ꎬ Chinaꎻ 2 Xiamen Plant Protection Stationꎬ Xiamen 361003ꎬ
China)
Abstract: In December 2011ꎬ bubblingꎬ mosaic leaves and noticeable chlorosis of fruits were observed on
field ̄grown pepper plants in Xiang′an district of Xiamen city. To identify the pathogenꎬ six symptomatic plants
were tested by ELISA using specific antibodies of Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV)ꎬ Pepper mild
mottle virus (PMMoV) and other viruses infecting pepper. Extracts from all these plants tested positive for
TMGMV and PMMoV. To confirm positive resultsꎬ total RNAs from six symptomatic plants were analyzed by
reverse transcription (RT) ̄PCR with primers designed to specifically amplify the coat protein (CP) gene of
TMGMV and PMMoV. The 524 bp TMGMV ̄CP specific DNA fragment was amplified from all samples and ex ̄
pected PMMoV ̄CP fragment was amplified from three samples. RT ̄PCR products of TMGMV ̄CP were purified
and directly sequenced. The obtained CP gene consisted of 480 nucleotides and encodes a putative protein of 159
amino acid residuesꎬ sharing identities of 97.9% to 99.8% and 97.5% to 100% at the nucleotide and amino acid
level with other TMGMV isolatesꎬ respectively. Phylogenetic analysis based on CP nucleotide sequence showed
no apparent host or region relationship existed in TMGMV isolates. To our knowledgeꎬ this is the first report of
TMGMV identified in China.
Key words: Pepperꎻ virusꎻ Tobacco mild green mosaic virusꎻ coat protein (CP)
文章编号: 0412 ̄0914(2013)06 ̄0651 ̄04
    辣椒源自南美洲ꎬ属于茄科辣椒属(Capsicum
L.)ꎬ为重要经济作物ꎮ 病毒病是影响辣椒生产的
主要病害ꎬ侵染辣椒的病毒有 40余种[1]ꎬ烟草轻型
绿花叶病毒 ( Tobacco mild green mosaic virusꎬ
TMGMV)是近年来在辣椒上发生和危害报道较多
的病毒之一ꎮ TMGMV 是 McKinney[2]于 1935 年
在烟草属植物(Nicotiana gluanca)上首次发现的ꎬ
为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员ꎮ 除辣椒
外ꎬ番茄[3]、凤仙花、蓝眼菊和矮牵牛也是 TMG ̄
MV的自然寄主ꎮ
2011年 12 月ꎬ厦门市农业局植保站会同厦门
检验检疫局技术中心进行病害调查ꎬ在厦门市翔安
区的 2个地块发现辣椒病毒病十分严重ꎬ病株率高
于 80%ꎮ 病株呈花叶症状ꎬ病果上有明显的褪绿
条纹ꎬ未见矮化、卷叶和曲叶等症状ꎮ 应用 ELISA
和 RT ̄PCR从辣椒病株上检测到 TMGMV 和 PM ̄
MoVꎬ并测定 TMGMV 外壳蛋白 ( coat proteinꎬ
CP)基因序列ꎬ这是 TMGMV 在我国发生的首次
 
植物病理学报 43卷
报道ꎮ
1  材料与方法
1.1  材料
6株辣椒病样(编号 XMS1 ̄XMS6)采自厦门
市翔安区ꎬ于-80℃冰箱中保存ꎮ 黄瓜花叶病毒
(Cucumber mosaic virusꎬ CMV)、马铃薯 X 病毒
(Potato virus Xꎬ PVX)、马铃薯 Y 病毒(Potato vi ̄
rus Yꎬ PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virusꎬ
TEV)、 烟草花叶病毒 ( Tobacco mosaic virusꎬ
TMV)、 番茄花叶病毒 ( Tomato mosaic virusꎬ
ToMV)、烟草环斑病毒 ( Tobacco ringspot virusꎬ
TRSV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virusꎬ
TSWV)、苜蓿花叶病毒 ( Alfalfa mosaic virusꎬ
AMV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virusꎬ
PMMoV)和 Potyvirus group 抗体及阳性对照购自
Agdia公司ꎬ蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virusꎬ
BBWV)和番茄黑环病毒(Tomato blackring virusꎬ
TBRV)抗体及阳性对照购自安德珍公司ꎬTMGMV
抗体及阳性对照购自 DSMZ 公司ꎻ Transcriptor
First Strand cDNA合成试剂盒购自 Roche公司ꎻEx
Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公
司ꎻTrizol( Invitrogen)购自英韦创津公司ꎮ
1.2  ELISA检测
详细检测步骤依据说明书进行ꎮ 阴性对照为
温室内健康辣椒植株的叶片研磨液ꎮ
1.3  RT ̄PCR扩增
应用 TrizoL提取感病叶片的总 RNAꎮ TMGMV
CP基因扩增引物[4]为 524 ̄F(5′ ̄CGTCATCGAG ̄
TACGTTTTAA ̄3′)和 524 ̄R(5′ ̄AGGAAATCTCA ̄
CAACAATAG ̄3′)ꎮ PMMoV 的 检 测 采 用 Xia
等[5]的方法ꎮ
取 6 μL 总 RNA 和 1 μL 下游引物(20 μmol /
L)进行反转录ꎮ 取 1 μL cDNA 进行 PCR 扩增ꎮ
TMGMV CP基因扩增条件为:94℃ 3 minꎻ94℃ 30
sꎬ50℃ 45 sꎬ72℃ 45 sꎬ35 个循环ꎻ72℃ 7 minꎮ
PCR产物寄送宝生物工程(大连)有限公司测序ꎮ
序列分析软件为 DNAMAN 5.2.2和 MEGA 5.1ꎮ
2  结果与分析
2.1  ELISA结果
ELISA检测结果显示:6 份辣椒病样与 TMG ̄
MV 和 PMMoV 抗体均呈阳性反应ꎬ与 CMV、
PVX、 PVY、 TEV、 TMV、 ToMV、 TRSV、 TSWV、
AMV、Potyvirus group、BBWV 和 TBRV 抗体反应
为阴性ꎮ 根据 ELISA检测结果分析ꎬ6份病样可能
为 TMGMV 和 PMMoV 复合侵染ꎬ也可能是血清
学交叉反应所致ꎬ需要经过 RT ̄PCR确认ꎮ
2.2  RT ̄PCR结果
使用 TMGMV CP 基因引物 524 ̄F 和 524 ̄R 从
6份病样中均扩增到约 500 bp 的片段ꎬ与预期大小
相符(图 1)ꎮ 使用 PMMoV 引物可从病样 XMS1、
XMS3和 XMS5中扩增到预期片段(576 bp)ꎮ RT ̄
PCR结果证实 XMS1、XMS3、XMS5 中同时存在
TMGMV和 PMMoVꎬ也说明 TMGMV 和 PMMoV
存在血清学上的交叉反应ꎮ 鉴于 PMMoV在我国发
生十分普遍ꎬ仅对 TMGMV产物进行测序和分析ꎮ
Fig. 1  RT ̄PCR amplification of TMGMV (A) and PMMoV (B) from diseased pepper plants
M: 100 bp DNA ladderꎻ Lane 1 ̄6: XMS1ꎬ XMS2ꎬ XMS3ꎬ XMS4ꎬ XMS5ꎬ XMS6ꎻ Lane 7: Negative control.
256
 
  6期 陈 青ꎬ等:辣椒上烟草轻型绿花叶病毒的鉴定
2.3  序列分析
测序结果显示:6份辣椒病样中均扩增到完整
的 CP基因ꎬ该基因由 480个碱基组成ꎬ编码 159个
氨基酸ꎬ大小与已报道的分离物相同ꎻ XMS1、
XMS3、XMS4和 XMS6的核苷酸序列相同ꎬXMS2
和 XMS5的核苷酸序列一致ꎬ二者仅 1个核苷酸有
差异ꎬ但编码相同的氨基酸序列ꎮ 为便于表述ꎬ选
择 XMS6 ( GenBank 登录号 JX534224 ) 与其他
TMGMV分离物进行分析比较ꎮ
XMS6与西班牙辣椒分离物 P87 / 15 的核苷酸
序列同源性最高(99. 8%ꎬ二者仅 1 个核苷酸不
同)ꎬ与另 1个西班牙辣椒分离物 P98 / 12的核苷酸
序列同源性最低(97.9%)ꎬ与其他分离物的核苷酸
序列同源性在 98.1% (P01 / 16ꎬ P96 / 49ꎬ P96 / 52ꎬ
PV ̄120) 和 99. 6% ( PV ̄0113ꎬ PV ̄112 ) 之 间ꎮ
XMS6与 P87 / 15、P99 / 22、PV ̄228、U2、R ̄22、P85 /
2、P98 / 11、P99 / 21的 CP 氨基酸序列相同ꎬ与其他
分离物的氨基酸序列同源性为 97.5%~99.5%ꎮ
亚洲分离物中ꎬXMS6 与日本辣椒分离物 J、
台湾辣椒分离物 HP、韩国分离物(TOBꎬ TOM)
的核苷酸序列同源性分别为 98􀆰 1%、98􀆰 3%和
98􀆰 5%ꎮ 氨基酸序列比较结果显示ꎬXMS 与 HP、
J的氨基酸序列同源性最高(99.4%)ꎬ仅第 59 位
氨基酸不同(M / I)ꎻXMS 与烟草分离物 TOB 的
氨基酸序列同源性最低(97􀆰 5%)ꎬ二者在第 77
位(L / I)、98 位(D / H)、116 位(D / G)和 144 位
(G / S)氨基酸存在差异ꎻXMS 与番茄分离物
TOM的氨基酸序列同源性居中(98.1%)ꎬ二者在
第 27 位(L / P)、78 位(D / A)和 144 位(G / S)氨
基酸存在差异(图 2)ꎮ
Fig. 2  Amino acid sequence alignment of CP of XMS6 (JX534224) with TMGMV ̄HP
(DQ821941)ꎬ TMGMV ̄J (AB078435)ꎬ TMGMV ̄TOB (AF103782)
and TMGMV ̄TOM (AF103783)
Amino acid changes are shown by letters and identity by bars.
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植物病理学报 43卷
3  讨论
大多数 Tobamovirus病毒具有种传特性ꎬ国际
种子贸易是病毒远距离传播的重要途径ꎮ 近年来ꎬ
TMGMV扩散速度很快ꎬ发生地包括以色列、韩国、
日本、中国台湾、委内瑞拉、法国、巴拿马、突尼斯、
英国、伊朗和美国ꎮ 本次辣椒病害调查中ꎬ从 6 份
辣椒病样中检测到 TMGMVꎬ并测定其 CP 基因序
列ꎮ 引物 524 ̄F 和 524 ̄R 位于 CP 基因之外ꎬ直接
对 PCR产物进行两端测序即可获得完整 CP 基因
序列ꎮ 本研究中分离物 XMS6 与已报道分离物的
核苷酸序列同源性为 97.9% ~ 99.8%ꎬ聚类分析显
示各分离物之间不具有明显的寄主相关性或地域
相关性ꎮ 病毒复合侵染现象在田间较为普遍ꎬ发现
3份病样为 TMGMV和 PMMoV复合侵染ꎬ但症状
与 TMGMV 单独侵染无区别ꎮ TMGMV 和 PM ̄
MoV在血清学上有交叉反应ꎬ检测大量的田间样
品时应在进行 ELISA初筛后再使用 RT ̄PCR 进行
确认ꎬ避免出现假阳性结果ꎮ
我国是辣椒种植和消费大国ꎬ种植面积
365 900 hm2ꎮ 番茄是我国的重要经济作物ꎬ我国
已成为世界三大番茄种植区之一ꎮ 我国每年进口
大量辣椒种子和番茄种子ꎬ最近本实验室从一批进
境辣椒种子中检测到 TMGMVꎬ说明该病毒有很高
的传入风险ꎮ 为保护辣椒与番茄产业安全ꎬ有必要
加强辣椒、番茄种子的进境检疫和省间种子调运检
疫ꎬ并在辣椒、番茄的主产区和种子繁育基地进行
病毒监测ꎬ防止病害大范围流行ꎮ
参考文献
[1]   Watterson J C. Development and breeding of resistance
to pepper and tomato viruses [A] . Resistance to viral
diseases of vegetables [M ] . New York: Timberꎬ
1993. 80-101.
[2]   McKinney H H. Evidence of virus mutation in the
common mosaic of virus [ J] . J. Agric. Res.ꎬ 1935ꎬ
39: 557.
[3]   Alishiri Aꎬ Rakhshandehroo Fꎬ Zamanizadeh H R.
First report of Tobacco mild green mosaic virus infec ̄
ting tomato in Iran [ J] . New Disease Reportsꎬ 2011ꎬ
23: 30.
[4]   Cohen Jꎬ Rosner Aꎬ Kagan Sꎬ et al. A new disease in
Tabernaemontana associated with Tobacco mild green
mosaic virus [ J] . Annals of Applied Biologyꎬ 2001ꎬ
138: 153-159.
[5]   Xia H Jꎬ Li Z Yꎬ Guo J Zꎬ et al. Identification of a
new virus on sweet pepper in Baoding district of Hebei
province ( in Chinese) [ J] . Journal of Agricultural
University of Hebei(河北农业大学学报)ꎬ 2006ꎬ 29
(6): 65-67.
责任编辑:于金枝
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