全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０９５ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
任海伟，赵拓，李金平，李雪雁，徐娜，王永刚，王晓力，高晓航．玉米秸秆与废弃白菜的混贮品质及乳酸菌多样性研究．草业学报，２０１６，２５（１）：
１９７２０６．
ＲＥＮＨａｉＷｅｉ，ＺＨＡＯＴｕｏ，ＬＩＪｉｎＰｉｎｇ，ＬＩＸｕｅＹａｎ，ＸＵＮａ，ＷＡＮＧＹｏｎｇＧａｎｇ，ＷＡＮＧＸｉａｏＬｉ，ＧＡＯＸｉａｏＨａｎｇ．Ｑｕａｌｉｔｙａｎｄｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃ
ｔｅｒｉａｏｆｍｉｘｅｄｃｏｒｎｓｔａｌｋａｎｄｃａｂｂａｇｅｗａｓｔｅｓｉｌａｇｅ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（１）：１９７２０６．
玉米秸秆与废弃白菜的混贮品质及
乳酸菌多样性研究
任海伟１，２，３，赵拓２，李金平１，３，李雪雁２，徐娜２，王永刚２，王晓力４，高晓航２
（１．兰州理工大学西部能源与环境研究中心，甘肃 兰州７３００５０；２．兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州７３００５０；
３．西北低碳城镇支撑技术协同创新中心，甘肃 兰州７３００５０；４．中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州７３００５０）
摘要：为研究玉米秸秆和废弃白菜混合青贮可行性，考查二者在不同质量比时的混贮品质，设计了６个不同的混贮
比例，分别为２９∶１９，２７∶２１，２５∶２３，２３∶２５，２１∶２７和１９∶２９。混合青贮３０ｄ后对其化学组分和发酵品质进行
分析，筛选品质最佳的混贮比例，并进一步研究了品质最佳混贮组的乳酸菌多样性。结果表明，质量比为２１∶２７
的混贮５（ＭＥ５）组的ｐＨ 和氨态氮／总氮显著低于其余混贮组（犘＜０．０５），乳酸含量显著高于其余混贮组（犘＜
０．０５）。ＭＥ５ 组的干物质和能源组分综纤维素含量较高，而酸性洗涤木质素含量较低，综合判定该组的混贮品质优
于其他５组。乳酸菌多样性结果显示，从 ＭＥ５ 组中共分离出１０株乳酸菌，分属于３个属，４个种。３个属分别是乳
杆菌属、肠球菌属和明串珠菌属。４个种分别是２株短乳杆菌、１株屎肠球菌、５株肠膜明串珠菌肠膜亚种和２株植
物乳杆菌，其中同型发酵乳酸菌乳杆菌属和肠球菌属为该青贮体系的关键乳酸菌。
关键词：玉米秸秆；废弃白菜；混合青贮；乳酸菌　　
犙狌犪犾犻狋狔犪狀犱犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪狅犳犿犻狓犲犱犮狅狉狀狊狋犪犾犽犪狀犱犮犪犫犫犪犵犲狑犪狊狋犲狊犻犾犪犵犲
ＲＥＮＨａｉＷｅｉ１，２，３，ＺＨＡＯＴｕｏ２，ＬＩＪｉｎＰｉｎｇ１，３，ＬＩＸｕｅＹａｎ２，ＸＵＮａ２，ＷＡＮＧ ＹｏｎｇＧａｎｇ２，ＷＡＮＧ ＸｉａｏＬｉ４，
ＧＡＯＸｉａｏＨａｎｇ２
１．犠犲狊狋犲狉狀犆犺犻狀犪犈狀犲狉犵狔牔犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犚犲狊犲犪狉犮犺犆犲狀狋犲狉，犔犪狀狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００５０，犆犺犻狀犪；２．犛犮犺狅狅犾
狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵，犔犪狀狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００５０，犆犺犻狀犪；３．犆犺犻狀犪犖狅狉狋犺狑犲狊狋犲狉狀犆狅犾犾犪犫狅狉犪
狋犻狏犲犐狀狀狅狏犪狋犻狅狀犆犲狀狋犲狉狅犳犔狅狑犮犪狉犫狅狀犝狉犫犪狀犻狕犪狋犻狅狀犜犲犮犺狀狅犾狅犵犻犲狊，犔犪狀狕犺狅狌７３００５０，犆犺犻狀犪；４．犃狀犻犿犪犾犪狀犱犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犘犺犪狉犿犪犮犲狌
狋犻犮狊犛犮犻犲狀犮犲狅犳犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犔犪狀狕犺狅狌７３００５０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｓｉｌａｇｅｍａｄｅｗｉｔｈａｍｉｘｔｕｒｅｏｆｃｏｒｎｓｔａｌｋ（ＣＳ）ａｎｄｃａｂｂａｇｅｗａｓｔｅ（ＣＷ）ｗｅｒｅｍｉｘｅｄａｎｄｅｎｓｉｌａｇｅｄａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｔｉｏｓ，２９∶１９（ＭＥ１），２７∶２１（ＭＥ２），２５∶２３（ＭＥ３），２３∶２５（ＭＥ４），２１∶２７（ＭＥ５）ａｎｄ１９∶２９
（ＭＥ６），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｒａｉｔｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄａｆｔｅｒ３０ｄａｙｓ（ｄ）ｔｏｉ
ｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｒａｔｉｏｏｆｃｏｒｎｓｔａｌｋａｎｄｃａｂｂａｇｅｗａｓｔｅａｎｄｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｎｅａｃｈｍｉｘ
ｔｕｒｅ．ＴｈｅｐＨａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆａｍｍｏｎｉａｎｉｔｒｏｇｅｎｔｏｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＡＮ／ＴＮ）ｏｆｔｈｅＭＥ５ｓｉｌａｇｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｍｉｘｅｓ（犘＜０．０５）．Ｔｈｅｌａｃｔｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔ（ＬＡ）ｏｆＭＥ５ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅ
第２５卷　第１期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１９７－２０６
２０１６年１月
收稿日期：２０１５０２２０；改回日期：２０１５０５２９
基金项目：国家自然科学基金（５１３６６００９），国家高技术研究发展计划（８６３）（２０１４ＡＡ０５２８０１），甘肃省自然科学基金（１４５ＲＪＺＡ０６４），兰州市人才
创新创业专项（２０１４２２０）和兰州理工大学“红柳青年教师培养计划”（Ｑ２０１２０７）资助。
作者简介：任海伟（１９８３），男，山西孝义人，副教授。Ｅｍａｉｌ：ｒｈｗ５２５７１１１９＠１６３．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｌｉｊｉｎｐｉｎｇ７７＠１６３．ｃｏｍ
ｏｔｈｅｒｍｉｘｅｓ（犘＜０．０５）ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅａｍｍｏｎｉａｎｉｔｒｏｇｅｎ／ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｒａｔｉｏ（ＡＮ／ＴＮ）ｏｆＭＥ５ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｌｏｗｅｒｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｉｘｅｓ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｔｏｔａｌｏｆ１０ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅ
ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅＭＥ５ｇｒｏｕｐ，ｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｅｒａ；犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊，犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊ａｎｄ犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮．
Ｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｏｆ犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊，ｏｎｅｓｔｒａｉｎｏｆ犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊犳犪犲犮犻狌犿，ｆｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｏｆ犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犿犲狊犲狀狋犲
狉狅犻犱犲狊ｓｕｂｓｐ．犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊ａｎｄｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｏｆ犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｓｅｉｓｏｌａｔｅｓ，
犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊ａｎｄ犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊ｗｅｒｅｈｏｍｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｌａｃｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ，ｗｈｉｃｈａｒｅａｂｌｅｔｏｐｒｏｄｕｃｅｍｏｒｅｌａｃｔｉｃ
ａｃｉｄｔｈａｎｈｅｔｅｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｌａｃｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ．犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊ａｎｄ犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊ｐｌａｙｅｄａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｓｉｌａｇｅｓ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｍｉｘｅｄｓｉｌａｇｅｓｏｆＣＳａｎｄＣＷｗｅｒｅｆｏｕｎｄｔｏｂｅｆｅａｓｉｂｌｅｗｉｔｈａｎｏｐｔｉｍｕｍｒａ
ｔｉｏｏｆ２１∶２７ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｃｏｒｎｓｔａｌｋ；ｃａｂｂａｇｅｗａｓｔｅ；ｍｉｘｅｄｓｉｌａｇｅ；ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ
青贮不仅是一种传统的动物饲草贮存方式，还可用于能源植物的贮存［１］。青贮是在厌氧条件下，利用原料表
面附生微生物，以可溶性碳水化合物为底物转化为乳酸等有机酸，降低ｐＨ从而抑制有害微生物繁殖，达到长期
贮存原料的目的［２４］。玉米（犣犲犪犿犪狔狊）秸秆多用作青贮饲料和沼气发酵原料，但因其季节性收获和农民耕作习
惯等因素，秸秆大量收获时已变干黄或枯蔫，水分和营养物质大量流失，无法直接青贮。另一方面，废弃蔬菜富含
水分和糖分，若能将其与秸秆进行混合贮存，则不仅能有效解决玉米秸秆的贮存问题，还能减少蔬菜废弃引发的
环境污染。
有关玉米秸秆与其他原料的混合青贮研究已十分深入。杨道兰等［５］认为花椰菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪狆犻狋犪狋犪）茎叶与
玉米秸秆混贮（质量比７∶３）能显著提高青贮料的可溶性碳水化合物、乳酸和丙酸含量，降低ｐＨ、丁酸含量。李
树成等［６］认为随着白花草木樨（犕犲犾犻犾狅狋狌狊犪犾犫狌狊）比例增大，其与玉米秸秆混贮过程中的ｐＨ、氨态氮／总氮和粗蛋
白含量呈升高趋势，乳酸、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量呈降低趋势。黄晓辉等［７］将苦豆子（犛狅狆犺狅狉犪犪犾狅
狆犲犮狌狉狅犻犱犲狊）和玉米秸秆混贮后发现，混贮料的ｐＨ、氨态氮／总氮和粗蛋白含量随苦豆子比例的升高而增加。究
其原因，混贮品质的提高有赖于乳酸菌发酵作用，因此乳酸菌多样性研究对解析青贮品质变化具有重要意义。
近年来，１６ＳｒＤＮＡ序列分析技术被认为是乳酸菌分类鉴定和多样性研究的有效方法［４，８］。有学者从玉米、
意大利多花黑麦草（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪犾犪狋犻犳狅犾犻犪）和尖叶胡枝子（犔犲狊狆犲犱犲狕犪犺犲犱狔狊犪狉狅犻犱犲狊）的青
贮料中分离得到植物乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿）、短乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊）、乳酸乳球菌（犔犪犮狋狅犮狅犮
犮狌狊犾犪犮狋犻狊）、肠膜明串珠菌（犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅狆狊犲狌犱狅犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊）、乳酸片球菌（犘犲犱犻狅犮狅犮犮狌狊犪犮犻犱犻犾犪犮狋犻犮犻）、戊糖片球菌
（犘犲犱犻狅犮狅犮犮狌狊狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌狊）和粪肠球菌（犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊犳犪犲犮犪犾犻狊）［９１１］。也有学者从其他青贮料中鉴定出一些鲜见
的乳酸菌。Ｃａｉ等［１２］从苏丹草（犛狅狉犵犺狌犿狏狌犾犵犪狉犲）中分离了新种那须乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狀犪狊狌犲狀狊犻狊ｓｐ．狀狅狏．）。
杨杨等［１３］从藏北嵩草（犓狅犫狉犲狊犻犪犾犻狋狋犾犲犱犪犾犲犻）中分离得到１７株乳酸菌，其中６株为食窦魏斯氏乳酸菌（犠犲犻狊狊犲犾犾犪
犮狅狀犳狌狊犪），其余均为融合魏斯氏乳酸菌（犠犲犻狊狊犲犾犾犪犮犻犫犪狉犻犪）。司丙文等［１４］从山竹岩黄芪（犎犲犱狔狊犪狉狌犿犳狉狌狋犻犮狅狊狌犿）
中分离得到１株乳酸菌为蒙氏肠球菌（犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊犿狌狀犱狋犻犻）。
本研究以干玉米秸秆与废弃白菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狆犲犽犻狀犲狀狊犻狊）混合青贮为原料，旨在从化学组分和发酵品质角度分
析不同质量比对二者混合青贮品质的影响，并利用传统培养法和１６ＳｒＲＮＡ序列分析技术相结合的方法对品质
最佳混贮组的乳酸菌进行分离鉴定，为该混贮模式的实践推广奠定理论基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
干玉米秸秆取自甘肃省陇西县，玉米品种为豫玉，采集时间２０１３年１０月，摘穗后田间留置１个月后收集，水
分含量为２８．４７％；废弃白菜叶取自兰州市七里河区菜市场，水分含量为９４．４２％。细菌基因组ＤＮＡ提取试剂
８９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１
盒购自美国Ｂｉｏｍｉｇａ公司。２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ购自上海美吉生物医药科技有限公司。ＤＮＡ ＭａｒｋｅｒＤ购自上
海生工生物工程股份有限公司。
１．２　试验设计
根据青贮含水量为６５％～７５％的基本要求，将干玉米秸秆与废弃白菜按不同质量比（依次为２９∶１９，
２７∶２１，２５∶２３，２３∶２５，２１∶２７和１９∶２９）进行混贮，混贮体系对应的水分含量为６５％，６７％，６９％，７１％，７３％
和７５％，分别编号为 ＭＥ１、ＭＥ２、ＭＥ３、ＭＥ４、ＭＥ５ 和 ＭＥ６。每个试验组３个重复。
１．３　青贮调制
将玉米秸秆切断至１～２ｃｍ后与长宽为２ｃｍ×２ｃｍ废弃白菜按一定质量比例进行混合，混匀后装入１．５Ｌ
青贮瓶中。为减少原料空隙一边装填一边压实，２５℃恒温密封贮存３０ｄ。贮存时间为２０１３年１１月至１２月。
１．４　分析方法
１．４．１　理化指标分析　　准确称取５０ｇ青贮料，按１∶１０比例加入蒸馏水混合打浆，过滤后对滤液和滤渣进行
分析。干物质（ｄｒｙｍａｔｔｅｒ，ＤＭ）测定采用１０５℃烘干法；中性洗涤纤维（ｎｅｕｔｒａｌｄｅｔｅｒｇｅｎｔｆｉｂｅｒ，ＮＤＦ）、酸性洗涤
纤维（ａｃｉｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｆｉｂｅｒ，ＡＤＦ）和酸性洗涤木质素（ａｃｉｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｌｉｇｎｉｎ，ＡＤＬ）测定采用ＡＮＫＯＭＡ２００ｉ全自
动纤维分析仪；纤维素（ｃｅｌｕｌｏｓｅ，ＣＬ）、半纤维素（ｈｅｍｉｃｅｌｕｌｏｓｅ，ＨＣ）和综纤维素（ｈｏｌｏｃｅｌｕｌｏｓｅ，ＨｏＣ）含量由公
式计算，ＣＬ＝ＡＤＦ－ＡＤＬ，ＨＣ＝ＮＤＦ－ＡＤＦ，ＨｏＣ＝ＣＬ＋ＨＣ；氨态氮（ａｍｍｏｎｉａｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＡＮ）测定采用苯酚－
次氯酸钠比色法［１５］；可溶性碳水化合物（ｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，ＷＳＣ）测定采用蒽酮硫酸法［１６］；乳酸（ｌａｃｔｉｃ
ａｃｉｄ，ＬＡ）测定采用ＳＢＡ４０Ｘ生物传感器；总氮（ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＴＮ）测定采用凯氏定氮法［１７］；乙酸（ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，
ＡＡ）、丁酸（ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ，ＢＡ）等有机酸分析采用ＧＣ９７９０Ⅱ气相色谱仪，测试条件为进样口温度２００℃，载气为高
纯氮气（９９．９９９％），不分流进样，升温程序：４０℃保持２ｍｉｎ，以２℃／ｍｉｎ升至１００℃后保持５ｍｉｎ，再以１０℃／ｍｉｎ
升至２００℃，保持５ｍｉｎ。
１．４．２　微生物分析　　无菌环境称取 ＭＥ５ 组青贮料２５ｇ加入到２２５ｍＬ无菌生理盐水中，３７℃恒温振荡２ｈ，
将菌悬液进行梯度稀释，取１０－３，１０－４和１０－５三个稀释度液体各０．２ｍＬ分别涂布于 ＭＲＳ（ＭａｎＲｏｇｏｓａ
Ｓｈａｒｐｅ，乳酸细菌培养基）固体平板上，每个稀释度分别做３个重复，３７℃厌氧培养７２ｈ。根据菌落的大小、光
泽、透明程度等挑取 ＭＲＳ固体平板上不同的典型菌落分离纯化２～３次后，观察记录菌落形态并进行革兰氏染
色和过氧化氢酶试验。
生理生化试验包括明胶液化、吲哚试验、硝酸盐还原、Ｈ２Ｓ产气、精氨酸水解、０．１％美兰还原、１０和４５℃生
长、ｐＨ４．５和ｐＨ９．６生长、６．５％ ＮａＣｌ生长试验等［１８］。采用糖微量发酵管法进行糖发酵试验。
参考乳酸菌通用引物进行细菌１６ＳｒＤＮＡ基因扩增，正向引物为２７ｆ：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ［１９］；
反向引物为１４９２ｒ：ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡ［２０］，上述引物由上海桑尼生物技术有限公司合成。细菌基
因组ＤＮＡ提取按照试剂盒说明进行，采用ＤＹＹ１１电泳仪进行ＤＮＡ检测，并在 ＭＧ９６＋ＰＣＲ仪中进行ＰＣＲ扩
增，扩增体系为５０μＬ：２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ、上下游引物各２μＬ、模板ＤＮＡ１μＬ、ＲＮａｓｅＦｒｅｅＷａｔｅｒ２０
μＬ。反应条件为：９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ３０ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保
存。预计扩增片段长度约为１６００ｂｐ。将未纯化ＰＣＲ产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
同源性与系统发育分析：将测序结果利用ＤＮＡｓｔａｒ进行序列拼接处理，并与ＮＣＢＩ上 ＭｉｃｒｏｂｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
数据库进行同源性比对分析，同时采用ＭＥＧＡ５．１软件中的ＣｌｕｓｔａｌＷ 对序列进行多重比较，利用邻位相连法构
建系统发育树，采用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ法对进化树进行１０００次重复统计验证，获得分类或系统发育地位。
１．５　统计分析
利用ＳＰＳＳ１８．０软件对试验数据进行统计分析，对不同混合比例处理进行单因素方差分析，犘＜０．０５代表数
据存在显著性差异。
９９１第２５卷第１期 草业学报２０１６年
２　结果与分析
２．１　青贮原料的化学成分分析
由表１可知，玉米秸秆中干物质含量为７１．５３％，ＷＳＣ含量为２８．０４％，ＣＬ和 ＨＣ含量丰富，二者之和高达
为５３．７６％。废弃白菜中水分含量丰富，高达９４．４２％，ＷＳＣ含量为２３．７４％。因此，玉米秸秆与废弃白菜混贮能
实现水分含量的互补性，弥补干秸秆水分缺失，达到青贮基本要求。
表１　青贮原料的化学成分（干物质基础）
犜犪犫犾犲１　犆犺犲犿犻犮犪犾犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狊狅犳狉犪狑犿犪狋犲狉犻犪犾（犇犕犫犪狊犻犮） ％
原料
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
干物质含量
ＤＭ
中性洗涤
纤维ＮＤＦ
酸性洗涤
纤维ＡＤＦ
酸性洗涤木
质素ＡＤＬ
纤维素
ＣＬ
半纤维素
ＨＣ
综纤维素
ＨｏＣ
可溶性碳水
化合物 ＷＳＣ
废弃白菜Ｃａｂｂａｇｅｗａｓｔｅ（ＣＷ） ５．５８±０．１５ ２１．２９±１．２０１３．１９±０．９７ ０．７４±０．４５ １０．９２±０．６４ ８．１１±０．４６ １９．０３±０．５５２３．７４±０．０３
玉米秸秆Ｃｏｒｎｓｔａｌｋ（ＣＳ） ７１．５３±０．０１ ５６．０２±０．０２３４．６８±０．０１ １．５２±０．０３ ３２．４２±０．０２２１．３４±０．０２ ５３．７６±０．０２２８．０４±０．０２
由表２可知，玉米秸秆与废弃白菜按照不同比例混贮３０ｄ后，与表１中原料相比，所有混贮组中的 ＷＳＣ含
量显著下降（犘＜０．０５），ＷＳＣ被青贮过程中的乳酸菌等微生物繁殖代谢所利用。ＭＥ２ 组的ＤＭ含量显著高于其
他混贮组（犘＜０．０５），且ＤＭ高于５０％，但该组ＡＤＬ含量相对较高，仅次于ＭＥ６ 组。从能源物质组分ＨｏＣ角度
来看，ＭＥ１ 和 ＭＥ５ 组的ＨｏＣ含量显著高于其他组（犘＜０．０５），但 ＭＥ１ 和 ＭＥ５ 组之间无显著差异。尽管６个混
贮组之间的组分变化规律不明显，但总体上看 ＭＥ５ 组的ＤＭ损失小，且 ＨｏＣ保存较好，ＡＤＬ含量相对较低。
表２　不同质量比对混贮中化学组分的影响（干物质基础）
犜犪犫犾犲２　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犿犪狊狊狆狉狅狆狅狉狋犻狅狀狅狀犮犺犲犿犻犮犪犾犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狅犳狊犻犾犪犵犲狊（犇犕犫犪狊犻犮） ％
混贮 Ｍｉｘｅｄｅｎｓｉｌｉｎｇ 干物质含量ＤＭ 酸性洗涤木质素ＡＤＬ 纤维素ＣＬ 半纤维素 ＨＣ 综纤维素 ＨｏＣ 可溶性碳水化合物 ＷＳＣ
ＭＥ１ ３６．３９±０．０１ｄ ２．８０±０．０１ｄ ３７．８８±０．０１ｂ ３０．０２±０．０１ｂ ６７．９０±０．０１ａ ０．４０±０．０４ｂ
ＭＥ２ ５１．４８±０．０２ａ ３．２１±０．０１ｂ ３６．０５±０．０３ｃ ３０．３８±０．０１ａ ６６．４３±０．０２ｂ ０．５１±０．０１ａ
ＭＥ３ ２８．２３±０．０５ｅ ２．８１±０．０２ｄ ３５．９２±０．０１ｃ ３０．３２±０．２７ａ ６６．２４±０．１２ｂ ０．２７±０．０４ｄ
ＭＥ４ ４３．５４±０．０２ｃ ２．９１±０．０２ｃ ３３．８６±０．０２ｄ ２７．９１±０．０２ｄ ６１．５７±０．０２ｄ ０．３４±０．０３ｃ
ＭＥ５ ４９．５２±０．２１ｂ ２．８２±０．０１ｄ ３８．７５±０．０１ａ ２８．７３±０．０１ｃ ６７．４８±０．０１ａ ０．４９±０．０４ａ
ＭＥ６ ２８．５７±０．１８ｅ ３．５４±０．０８ａ ３８．１１±０．０１ｂ ２４．３３±０．０１ｅ ６２．４４±０．０１ｃ ０．２８±０．０４ｄ
标准误ＳＥＭ ０．１０９ ０．０３８ ０．０１６ ０．１０３ ０．０４７ ０．０３３
犘值犘ｖａｌｕｅ ０．０１３ ０．００１ ＜０．００１ ０．０１２ ０．００３ ０．００１
　注：表中同列不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５），下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｍｅａｎｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．２　发酵品质分析
由表３可知，６个试验组的ｐＨ均处于发酵品质优良的青贮ｐＨ 范围３．５～４．５，且随着废弃白菜比例的增
加，混贮组中ｐＨ总体呈现先增加后减少的趋势。其中，ＭＥ５ 组中的ｐＨ和ＡＮ／ＴＮ最低，显著低于其他混贮组
（犘＜０．０５）；且ＬＡ含量最高，显著高于其他组（犘＜０．０５）。说明混贮过程中白菜的适当增加有利于乳酸菌的快
速繁殖和ｐＨ快速下降。另一方面，６个混贮组中的ＡＡ和ＢＡ含量微弱，浓度均小于０．０１％，推测玉米秸秆与
废弃白菜的混贮过程以同型发酵为主，有利于减少干物质的损失。综合分析化学组分和发酵品质的结果，确定
ＭＥ５ 组的贮存品质优于其他混贮组。
２．３　乳酸菌的多样性分析
２．３．１　形态学鉴定　　挑取ＭＲＳ固体平板上直径２～３ｍｍ、白色或乳白色、表面光滑凸起、大小不一的菌
００２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１
落，经革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性
的菌株标记为乳酸菌，共分离到１０株，编号为
ＣＳＣＷＬ１２、ＣＳＣＷＬ１４、ＣＳＣＷＬ１６、ＣＳＣＷＬ
１７、ＣＳＣＷＬ１１１、ＣＳＣＷＬ１１４、ＣＳＣＷＬ１１６、
ＣＳＣＷＬ１１７、ＣＳＣＷＬ１１８和ＣＳＣＷＬ１１９。
２．３．２　生理生化鉴定　　如表４可知，菌株
ＣＳＣＷＬ１２、ＣＳＣＷＬ１７、ＣＳＣＷＬ１１７和ＣＳＣ
ＷＬ１１８为革兰氏阳性杆菌，过氧化氢酶试验、硝
酸盐还原试验、明胶液化试验为阴性，不产生吲哚
和硫化氢，ｐＨ４．５条件下能够正常生长，初步认
定为乳杆菌属（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊）。
从表５可知，菌株ＣＳＣＷＬ１４为革兰氏阳性
球菌，过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验为阴性，
表３　不同质量比对青贮发酵品质的影响
犜犪犫犾犲３　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犿犻狓犲犱狆狉狅狆狅狉狋犻狅狀狅狀犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀
犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳狊犻犾犪犵犲狊 ％ ＤＭ
混贮
Ｍｉｘｅｄｅｎｓｉｌｉｎｇ
ｐＨ值
ｐＨｖａｌｕｅ
乳酸
ＬＡ
氨态氮／总氮
ＡＮ／ＴＮ
乙酸
ＡＡ
丁酸
ＢＡ
ＭＥ１ ３．８５±０．０３ｄ １８．６２±０．０５ｂ １．６０±０．０２ｄ ＜０．０１ ＜０．０１
ＭＥ２ ４．０３±０．１５ｂ １４．６９±０．０３ｆ ２．６５±０．１０ｃ ＜０．０１ ＜０．０１
ＭＥ３ ３．９６±０．０６ｃ １６．３７±０．０２ｄ １．１２±０．１５ｅ ＜０．０１ ＜０．０１
ＭＥ４ ３．９４±０．０８ｃ １７．８１±０．０６ｃ ２．８１±０．１９ｂ ＜０．０１ ＜０．０１
ＭＥ５ ３．７２±０．０３ｅ ２０．７６±０．１１ａ １．１１±０．１９ｅ ＜０．０１ ＜０．０１
ＭＥ６ ４．３２±０．０５ａ １５．８７±０．０５ｅ ３．２４±０．２７ａ ＜０．０１ ＜０．０１
标准误ＳＥＭ ０．０７７ ０．０５７ ０．１６１ ＜０．００１＜０．００１
犘值犘ｖａｌｕｅ ０．００６ ０．００３ ０．０２６ ＜０．００１＜０．００１
０．１％美兰还原试验、ｐＨ９．６和６．５％ ＮａＣｌ生长试验为阳性，在１５和４５℃条件下生长，符合肠球菌属（犈狀狋犲狉狅
犮狅犮犮犪犮犲犪犲）的特征，初步确定为肠球菌属；菌株ＣＳＣＷＬ１６、ＣＳＣＷＬ１１１、ＣＳＣＷＬ１１４、ＣＳＣＷＬ１１６和ＣＳＣＷＬ
１１９为革兰氏阳性球菌，过氧化氢酶试验和硝酸盐还原试验为阴性，ｐＨ９．６生长试验为阳性，０．１％美兰还原试
验为阴性，在１５℃条件下生长，４５℃条件下不生长，根据以上结果暂不能在属水平上做出准确判断。
表４　乳杆菌属的鉴定结果
犜犪犫犾犲４　犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊
试验菌株
Ｓｔｒａｉｎ
革兰氏染色
Ｇｒａｍ
ｓｔａｉｎｉｎｇ
过氧化氢酶试验
Ｃａｔａｌａｓｅ
ｔｅｓｔ
硝酸盐还原试验
Ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｅｓｔ
明胶液化试验
Ｇｅｌａｔｉｎｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ
ｔｅｓｔ
吲哚试验
Ｉｎｄｏｌｅ
ｔｅｓｔ
硫化氢产气试验
Ｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｉｄｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｅｓｔ
ｐＨ４．５生长试验
Ｇｒｏｗｔｈａｔ
ｐＨ４．５
ＣＳＣＷＬ１２ ＋ － － － － － ＋
ＣＳＣＷＬ１７ ＋ － － － － － ＋
ＣＳＣＷＬ１１７ ＋ － － － － － ＋
ＣＳＣＷＬ１１８ ＋ － － － － － ＋
　＋：阳性Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；－：阴性Ｎｅｇａｔｉｖｅ．下同Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
表５　球状乳酸菌的鉴定结果
犜犪犫犾犲５　犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狊狆犺犲狉犻犮犪犾犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪
试验菌株
Ｓｔｒａｉｎ
革兰氏染色
Ｇｒａｍ
ｓｔａｉｎｉｎｇ
过氧化氢酶
试验Ｃａｔａｌａｓｅ
ｔｅｓｔ
硝酸盐还原试验
Ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｅｓｔ
１５℃生长
试验Ｇｒｏｗｔｈ
ａｔ１５℃
４５℃生长
试验Ｇｒｏｗｔｈ
ａｔ４５℃
ｐＨ９．６生长
试验Ｇｒｏｗｔｈ
ａｔｐＨ９．６
６．５％ ＮａＣｌ生长
试验Ｇｒｏｗｔｈａｔ
６．５％ ＮａＣｌ
０．１％美兰还原试验
Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｌｕｅ
ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｔｅｓｔ
ＣＳＣＷＬ１４ ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
ＣＳＣＷＬ１６ ＋ － － ＋ － ＋ － －
ＣＳＣＷＬ１１１ ＋ － － ＋ － ＋ ＋ －
ＣＳＣＷＬ１１４ ＋ － － ＋ － ＋ － －
ＣＳＣＷＬ１１６ ＋ － － ＋ － ＋ － －
ＣＳＣＷＬ１１９ ＋ － － ＋ － ＋ ＋ －
由表６可知，菌株ＣＳＣＷＬ１２和ＣＳＣＷＬ１１７在１５℃条件下生长，４５℃条件下不生长，能利用葡萄糖产酸
产气，可发酵果糖产酸，水解精氨酸，显微镜下为短杆状，初步确定为异型发酵短乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊）。
１０２第２５卷第１期 草业学报２０１６年
菌株ＣＳＣＷＬ１７和ＣＳＣＷＬ１１８能利用葡萄糖产酸但不产气，可发酵阿拉伯糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦
芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉籽糖、蔗糖和纤维二糖产酸，不能水解精氨酸，初步确定为植物乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪
犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿）。结合表５和６结果，球状菌株ＣＳＣＷＬ１４能在１５℃、４５℃、ｐＨ９．６和６．５％ ＮａＣｌ条件下生
长，０．１％美兰还原试验为阳性，精氨酸产氨，利用葡萄糖产酸但不产气，可发酵阿拉伯糖、果糖、半乳糖、蜜二糖、
海藻糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖产酸，不能发酵松三糖和山梨醇，暂无法对其在种水平上进行判断。菌株ＣＳＣ
ＷＬ１６、ＣＳＣＷＬ１１１、ＣＳＣＷＬ１１４、ＣＳＣＷＬ１１６和ＣＳＣＷＬ１１９能利用葡萄糖产酸但不产气，所以均为同型
发酵乳酸菌，不能发酵利用松三糖、鼠李糖和山梨醇，精氨酸产氨试验为阴性，符合明串珠菌属（犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犪犮犲
犪犲）的特征，暂无法在种水平上做出判断。故菌株ＣＳＣＷＬ１４、ＣＳＣＷＬ１６、ＣＳＣＷＬ１１１、ＣＳＣＷＬ１１４、ＣＳＣＷＬ
１１６和ＣＳＣＷＬ１１９的鉴定结果需要结合１６ＳｒＲＮＡ序列分析技术进行准确判断。
表６　乳酸菌糖发酵试验结果
犜犪犫犾犲６　犌犾狔犮狅犾狔狊犻狊犳狌狀犮狋犻狅狀狅犳犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪
项目Ｉｔｅｍ
ＣＳＣＷＬ
１２
ＣＳＣＷＬ
１４
ＣＳＣＷＬ
１６
ＣＳＣＷＬ
１７
ＣＳＣＷＬ
１１１
ＣＳＣＷＬ
１１４
ＣＳＣＷＬ
１１６
ＣＳＣＷＬ
１１７
ＣＳＣＷＬ
１１８
ＣＳＣＷＬ
１１９
１５℃生长Ｇｒｏｗｔｈａｔ１５℃ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
４５℃生长Ｇｒｏｗｔｈａｔ４５℃ － ＋ － － － － － － － ＋
精氨酸水解Ａｒｇｉｎｉｎｅａｎｄｐｒｏｄｕｃｅｓａｍｍｏｎｉａ ＋ ＋ － － － － － ＋ － －
葡萄糖产酸Ｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｐｒｏｄｕｃｅｓａｃｉｄ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
葡萄糖产气Ｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｐｒｏｄｕｃｅｓｇａｓ ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
阿拉伯糖Ａｒａｂｉｎｏｓｅ － ＋ － ＋ － － － － ＋ －
七叶苷Ａｅｓｃｕｌｉｎ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
果糖Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
半乳糖Ｇａｌａｃｔｏｓｅ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
乳糖Ｌａｃｔｏｓｅ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
麦芽糖 Ｍａｌｔｏｓｅ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
甘露醇 Ｍａｎｎｉｔｏｌ － － － ＋ － － － － ＋ －
甘露糖 Ｍａｎｎｏｓｅ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
松三糖 Ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ － － － ＋ － － － － ＋ －
蜜二糖 Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
棉籽糖Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
鼠李糖Ｒｈａｍｎｏｓｅ － － － － － － － － － －
水杨苷Ｓａｌｉｃｉｎ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
蔗糖Ｓｕｃｒｏｓｅ － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
海藻糖Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － － ＋
木糖Ｘｙｌｏｓｅ － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － － ＋
纤维二糖Ｃｅｌｏｂｉｏｓｅ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
山梨醇Ｓｏｒｂｉｔｏｌ － － － ＋ － － － － ＋ －
２．３．３　１６ＳｒＲＮＡ序列同源性分析　　提取１０株乳酸菌的基因组ＤＮＡ，电泳检测结果为单一清晰条带（图１），
能满足ＰＣＲ扩增条件，如图２所示，所扩增的目的片段条带清晰，长度约为１５００ｂｐ，满足测序要求。
将测序结果利用ＤＮＡｓｔａｒ软件进行拼接处理，并与 ＭｉｃｒｏｂｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ数据库中已发表的细菌１６ＳｒＲＮＡ
序列进行比对分析，找出与目的序列同源性最高的菌种，如表７所示。
２０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１
图１　基因组犇犖犃检测电泳图
犉犻犵．１　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狆犻犮狋狌狉犲狅犳犵犲狀狅犿犲犇犖犃犱犲狋犲犮狋犻狅狀　
图２　犘犆犚产物检测电泳图
犉犻犵．２　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狆犻犮狋狌狉犲狅犳犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊　
表７　１６犛狉犚犖犃同源性比对结果
犜犪犫犾犲７　犎狅犿狅犾狅犵狅狌狊犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳１６犛狉犚犖犃
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
登记号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
最大分
Ｍａｘ
ｓｃｏｒｅ
总分
Ｔｏｔａｌ
ｓｃｏｒｅ
覆盖度
Ｑｕｅｒｙ
ｃｏｖｅｒ（％）
期望值
Ｅｖａｌｕｅ
相似度
Ｉｄｅｎｔ
（％）
相似性比对结果
Ｂｌａｓｔｒｅｓｕｌｔ
ＣＳＣＷＬ１２ ＮＣ＿００８４９７．１ ２５９７ １２９８２ ９９ ０．０ ９９ 短乳杆菌犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊
ＣＳＣＷＬ１４ ＮＣ＿０１７９６０．１ ２６１４ １５６０１ ９９ ０．０ ９９ 屎肠球菌犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊犳犪犲犮犻狌犿
ＣＳＣＷＬ１６ ＮＣ＿００８５３１．１ ２６１４ １０４５６ ９９ ０．０ ９９ 肠膜明串珠菌肠膜亚种犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊ｓｕｂｓｐ．犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊
ＣＳＣＷＬ１７ ＮＣ＿００４５６７．２ ２５５１ １２７４０ ９９ ０．０ ９９ 植物乳杆菌犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿
ＣＳＣＷＬ１１１ ＮＣ＿００８５３１．１ ２６１０ １０４４１ ９９ ０．０ ９９ 肠膜明串珠菌肠膜亚种犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊ｓｕｂｓｐ．犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊
ＣＳＣＷＬ１１４ ＮＣ＿００８５３１．１ ２５９３ １０３７５ １００ ０．０ ９９ 肠膜明串珠菌肠膜亚种犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊ｓｕｂｓｐ．犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊
ＣＳＣＷＬ１１６ ＮＣ＿００８５３１．１ ２５６６ １０２６４ ９９ ０．０ ９９ 肠膜明串珠菌肠膜亚种犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊ｓｕｂｓｐ．犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊
ＣＳＣＷＬ１１７ ＮＣ＿００８４９７．１ ２６４１ １３２０３ １００ ０．０ ９９ 短乳杆菌犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊
ＣＳＣＷＬ１１８ ＮＣ＿００４５６７．２ ２６３８ １３１７４ ９９ ０．０ ９９ 植物乳杆菌犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿
ＣＳＣＷＬ１１９ ＮＣ＿００８５３１．１ ２６２３ １０４９３ ９９ ０．０ ９９ 肠膜明串珠菌肠膜亚种犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊ｓｕｂｓｐ．犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊
由表７可知，菌株ＣＳＣＷＬ１２和ＣＳＣＷＬ１１７与短乳杆菌的同源性最高；菌株ＣＳＣＷＬ１４与屎肠球菌的同
源性最高；菌株ＣＳＣＷＬ１６、ＣＳＣＷＬ１１１、ＣＳＣＷＬ１１４、ＣＳＣＷＬ１１６和ＣＳＣＷＬ１１９与肠膜明串珠菌肠膜亚
种的同源性最高；菌株ＣＳＣＷＬ１１和ＣＳＣＷＬ１１８与植物乳杆菌的同源性最高。
构建１０株乳酸菌的系统发育树如图３所示。菌株ＣＳＣＷＬ１７和ＣＳＣＷＬ１１８聚为第１类群，同时与其他
乳杆菌属标准菌株亲缘关系较近；菌株ＣＳＣＷＬ１２和ＣＳＣＷＬ１１７单独聚为一类，且与第１类群相似性达
１００％；菌株ＣＳＣＷＬ１４聚为第２类群，且与其他肠球菌属标准菌株相似性达１００％；菌株ＣＳＣＷＬ１６、ＣＳＣＷＬ
１１１、ＣＳＣＷＬ１１４、ＣＳＣＷＬ１１６和ＣＳＣＷＬ１１９聚为第３类群，且与其他明串珠菌属标准菌株亲缘关系较近。
故确定菌株ＣＳＣＷＬ１７和ＣＳＣＷＬ１１８为植物乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿）；菌株ＣＳＣＷＬ１２和ＣＳＣＷＬ
１１７为短乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊）；菌株ＣＳＣＷＬ１４为屎肠球菌（犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊犳犪犲犮犻狌犿）；菌株ＣＳＣＷＬ１６、
ＣＳＣＷＬ１１１、ＣＳＣＷＬ１１４、ＣＳＣＷＬ１１６和ＣＳＣＷＬ１１９为肠膜明串珠菌肠膜亚种（犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊
ｓｕｂｓｐ．犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊）。将分离的１０株乳酸菌序列提交ＧｅｎＢａｎｋ，所得注册号按菌株编号依次为ＫＭ９８５４４９～
ＫＭ９８５４５８。
３０２第２５卷第１期 草业学报２０１６年
图３　１６犛狉犚犖犃序列系统进化树
犉犻犵．３　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀狋犺犲１６犛狉犚犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲
　图中分支数字表示Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ验证中该分支可信度百分数；标尺表示序列差异度。Ｎｕｍｂｅｒｓｉｎｔｒｅｅｂｒａｎｃｈｒｅｐｒｅｓｅｎｔｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅｆｏｒ
ｅａｃｈｂｒａｎｃｈ；ｓｃａｌｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅ．
３　讨论
原料中 ＷＳＣ和水分是青贮发酵的必备条件，适宜的 ＷＳＣ和水分含量有利于乳酸生成和ｐＨ的快速下降。
本研究中玉米秸秆与废弃白菜的水分含量具有良好互补性，且 ＷＳＣ含量较高，二者混贮可实现水分含量的互
补，从而达到青贮基本要求［２１］。另一方面，ＣＬ是由β（１→４）Ｄ葡聚糖链聚合形成的亚晶体聚合物，ＨＣ则包括
木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖以及β（１→３，１→４）葡聚糖等多糖。玉米秸秆中的ＣＬ和 ＨＣ含量高达
５３％以上，这２种组分是生物能源转换过程中微生物或酶降解的重要底物。因此，ＣＬ和 ＨＣ的高保存率是评价
混贮过程中化学组分变化的主要指标之一，即ＨｏＣ含量越高意味着可转化为生物能源的潜力越大。另一方面，
ＣＬ与ＨＣ和ＡＤＬ相互交联形成木质纤维网络结构，ＡＤＬ的存在对ＣＬ和ＨＣ的生物降解有屏障作用［２２］。表２
中显示，ＭＥ５ 组的ＤＭ含量为４９．５２％，且ＤＭ 和 ＨｏＬ含量较高，ＡＤＬ相对较低，贮存过程中的能源组分损失
少，这对提高玉米秸秆的生物能源转化量具有积极意义。
乳酸菌的快速繁殖和ｐＨ迅速降低是青贮成功与否和品质高低的关键所在。因此，ｐＨ可间接反映青贮品质
的高低。ｐＨ快速降低能够抑制不利于青贮的厌氧微生物如肠细菌和梭菌的生长，减少蛋白质等营养成分的损
失。高ｐＨ（＞４．５）是发酵失败的标志之一［２３］。试验中６个混贮组的ｐＨ均低于４．５，低ｐＨ能使青贮发酵过程
停滞，减少ＤＭ损失。当ｐＨ低于４．５时，蛋白质分解成较为稳定的氨基酸，对青贮料不会造成损失，同时可以抑
制蛋白质水解微生物的生长［２４２５］，故６个混贮组的ＡＮ／ＴＮ均较低，说明蛋白质分解较少。青贮料中有机酸的种
类和浓度可以反映青贮发酵过程的好坏，其中最重要的是ＡＡ、ＢＡ和ＬＡ。ＬＡ有利于ｐＨ降低，减少发酵过程中
４０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１
ＤＭ损失。ＡＡ能有效抑制酵母菌生长，是抑制酵母等真菌生长的主要物质。ＢＡ是梭菌等不良微生物分解青贮
料中蛋白质或氨基酸等生成的产物。ＬＡ含量越高意味着ｐＨ下降越迅速，其ＤＭ 和能量组分流失少，发酵品质
越好［２６］。同时，本试验中６个混贮组的ＡＡ和ＢＡ含量均小于０．０１％，推测同型发酵乳酸菌占主导地位，梭菌等
有害微生物被有效抑制。综合考虑混贮过程中的化学组分和发酵品质，ＭＥ５ 组的混贮效果优于其余５组，故确
定 ＭＥ５ 组为贮存品质最佳的混贮比例，即玉米秸秆和废弃白菜的质量比为２１∶２７。
采用传统的分离培养法从 ＭＥ５ 组中分离得到１０株乳酸菌，利用１６ＳｒＤＮＡ序列分析技术鉴定发现，这１０
株乳酸菌分属于乳杆菌属（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊）、肠球菌属（犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊）和明串珠菌属（犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮）３个属和４个种。
４个种分别是短乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犫狉犲狏犻狊）２株、屎肠球菌（犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮狌狊犳犪犲犮犻狌犿）１株、肠膜明串珠菌肠膜亚种
（犔犲狌犮狅狀狅狊狋狅犮犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊ｓｕｂｓｐ．犿犲狊犲狀狋犲狉狅犻犱犲狊）５株和植物乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿）２株。其中，乳
杆菌属和肠球菌属均为同型发酵乳酸菌，对青贮发酵品质起着关键作用。
然而，由于传统微生物学分离培养方法的不足，若要全面准确了解混贮料中的乳酸菌群落多样性，还需要借
助高通量测序技术等方法从分子水平研究其多样性，这也是今后工作的研究内容。
４　结论
干玉米秸秆与废弃白菜的混合比例为２１∶２７时混贮品质最佳，二者混合青贮不仅可以实现干秸秆的长期保
存，还能使白菜在贮存期间得到降解。该混贮模式的提出为干黄秸秆的长时间贮存和尾菜污染防治提供了一条
新途径，方法可行，也具有实际利用价值。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＷｅｉｌａｎｄＰ．Ｂｉｏｇａｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｅａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，８５（４）：８４９８６０．
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ｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１８５（３４）：１９６２００．
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ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｎａｌｆａｌｆａｓｉｌａｇｅａｎｄｓｔｏｒｅｄｃｏｒｎｓｔｏｖｅｒ．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，７１（３）：３２９３３８．
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ｌｉｌｏｔｕｓａｌｂｕｓａｎｄｃｏｒｎｓｔｒａｗ．ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３１（２）：３２１３２７．
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ｃｏｒｎｓｔｒａｗｍｉｘｅｄｓｉｌａｇｅ．ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３０（１０）：１６３３１６３９．
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ｉａｎｒｙｅｇｒａｓｓｓｉｌａｇｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１２，８３（２）：１１１１２０．
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１６ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡａｎａｌｙｓｉｓ．ＡｐｐｌｉｅｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６９（１）：４４４４５１．
［１１］　ＳｉＢＷ，ＷａｎｇＺＬ，ＳｕｎＱＺ，犲狋犪犾．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｃｈａｎｇｅｓｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｅｎｓｉｌｉｎｇ
犔犲狊狆犲犱犲狕犪犺犲犱狔狊犪狉狅犻犱犲狊．ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１２，２９（４）：６５０６５７．
［１２］　ＣａｉＹＭ，ＰａｎｇＨＬ，ＫｉｔａｈａｒａＭ，犲狋犪犾．犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狀犪狊狌犲狀狊犻狊狊狆．ｎｏｖ．，ａｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｉｌａｇｅ，ａｎｄｅ
ｍｅｎｄｅｄｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓ犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，
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［１３］　ＹａｎｇＹ，ＳｈｉＣ，ＧｕｏＸＳ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犠犲犻狊狊犲犾犾犪ｓｐｅｃｉｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ犓狅犫狉犲狊犻犪犾犻狋狋犾犲犱犪犾犲犻ｇｒｏｗｉｎｇ
ｉｎａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１４，２３（１）：２６６２７５．
［１４］　ＳｉＢＷ，ＷａｎｇＺＬ，ＳｕｎＱＺ，犲狋犪犾．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｎ犎犲犱狔狊犪狉狌犿犳狉狌狋犻犮狅狊狌犿
ｐａｌ．ｓｉｌａｇｅ．ＡｃｔａＡｇｒｅｓｔｉａＳｉｎｉｃａ，２０１２，２０（１）：１６６１７０．
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５０２第２５卷第１期 草业学报２０１６年
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ｓｉｌａｇｅｈａｒｖｅｓｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｙｉｎｇｌｅｖｅｌｓｏｆｔｏｔａｌｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，１９９９，３９（６）：１８７３１８８０．
［１７］　ＳｈａｏＴ，ＺｈａｎｇＺＸ，ＳｈｉｍｏｊｏＭ，犲狋犪犾．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＩｔａｌｉａｎｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿
Ｌａｍ．）ａｎｄｇｕｉｎｅａｇｒａｓｓ（犘犪狀犻犮狌犿犿犪狓犻犿狌犿Ｊａｃｑ．）ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｅｎｓｉｌｉｎｇ．ＡｓｉａｎＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，１８（２２）：１７２７１７３４．
［１８］　ＧｕｏＸＨ，ＬｉｎｇＤＷ．ＭｏｄｅｒｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＬａｃｔｉｃＡｃｉｄＢａｃｔｅｒｉａ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ，２０１３：２８５２８６．
［１９］　ＭｏｒａＤ，ＦｏｒｔｉｎａＭＧ，ＮｉｃａｓｔｒｏＧ，犲狋犪犾．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｂａｃｉｌｉ：ａｓｔｕｄｙｏｎｎｅｗｓｏｉｌｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄ
ｓｅｖｅｒａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔｒａｉｎｓ．ＲｅｓｅａｒｃｈＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１４９（１０）：７１１７２２．
［２０］　ＪｅｎｓｅｎＭＡ，ＷｅｂｓｔｅｒＪＡ，ＳｔｒａｕｓｓＮ．Ｒａｐｉｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｉ
ｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｐａｃｅｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．ＡｐｐｌｉｅｄＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，５９（４）：９４５９５２．
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Ｓｉｎｉｃａ，２０１５，４８（２）：２２９２４０．
［２３］　ＬｉｕＪＪ，ＧａｏＬＪ，ＳｈｉＪＦ，犲狋犪犾．Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｎｄ犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｓｉｌａｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆ
ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ．ＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１５，３１（９）：２９５３０２．
［２４］　ＫｏｎｄｏＭ，ＫｉｔａＫ，ＹｏｋｏｔａＨ．Ｆｅｅｄｉｎｇｖａｌｕｅｔｏｇｏａｔｓｏｆｗｈｏｌｅｃｒｏｐｏａｔｅｎｓｉｌｅｄｗｉｔｈｔｅａｗａｓｔｅ．ＡｎｉｍａｌＦｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１１３（１４）：７１８１．
［２５］　ＧｅＪ，ＹａｎｇＣＪ，ＹａｎｇＺＭ，犲狋犪犾．Ｑｕａｌｉｔｙｏｆｍｉｘｅｄｎａｋｅｄｏａｔｓ（犃狏犲狀犪狀狌犱犪）ａｎｄａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）ｓｉｌａｇｅ．Ａｃｔａ
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６０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１