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Cloning and sequence analysis of terminase gene of glycoalkaloid biosynthesis
metabolismic pathway in potato

马铃薯SGAs合成代谢途径末端SGT酶基因克隆及序列分析



全 文 :书马铃薯犛犌犃狊合成代谢途径末端犛犌犜
酶基因克隆及序列分析
牛继平1,2,3,张金文1,2,王旺田1,2,王蒂1,2,陆艳梅1,2,张俊莲1,2
(1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃 兰州730070;2.甘肃省干旱生境作物学重点实验室,
甘肃 兰州730070;3.甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃 兰州730070)
摘要:糖苷生物碱(SGAs)是一类存在于茄科植物和百合科植物的重要次生代谢物,与植物抗逆性和产品品质有密
切关系,同时在医药上具有广泛的药理学活性。茄啶:糖基转移酶(SGT)为SGAs合成代谢途径末端关键酶,研究
其基因结构及其编码的酶蛋白特性,对于调控植物体内SGAs合成及其通过微生物发酵生产SGTs有重要的作用
和意义。通过生物信息学分析方法预测3个糖基转移酶cDNA编码的酶蛋白结构和特性。以马铃薯块茎表皮总
RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出3个糖基转移酶(SGT1、SGT2和SGT3)基因片段并克隆到pMDR19T
载体。阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,序列分析结果表明,克隆到的狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3三个同源的序列片段
(1467~1518bp),编码488~505个氨基酸;所得序列与 GenBank中注册的高等植物SGT酶基因核苷酸序列
(U82367.2、DQ218276.1和DQ266437)的同源性均在99.12%以上,氨基酸同源性达到99%以上,3个基因都具
有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;PI为5.52~5.62。三级结构预测表明,该氨基酸同糖基转
移酶单体结构模型相似,都为糖基转移酶家族成员,具有合成类固醇糖苷生物碱的功能,基因序列已注册到 Gen
Bank,序列注册号分别为:狊犵狋1,JN695005;狊犵狋2,JN695006;狊犵狋3,HM188447。
关键词:马铃薯;糖苷生物碱;茄啶糖苷转移酶;基因克隆;生物信息学分析
中图分类号:Q943.2;S532.03  文献标识码:A  文章编号:10045759(2012)03010611
  甾醇类糖苷生物碱(steroidalglycoalkaloids,SGAs,简称糖苷生物碱)是一类广泛存在于茄科(Solanaceae)、
某些百合科(Liliaceae)植物及一些微生物中的次生代谢物,具有广泛的生态学效应,如抵御病原微生物侵袭和拒
避食草昆虫采食,在医疗上还具有广泛的药理学活性,如抗菌、抗病毒、抗原虫、抗炎、抗肿瘤、强心、抗胆碱酯酶
等[13]。马铃薯(犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿)栽培种中,α茄碱(αsolanine,又称龙葵素)和α卡茄碱(αchaconine)为主要
的甾醇类糖苷生物碱,占总生物碱的95%[4],可增强植株对病原物及非生物逆境的抗性,并且这2种生物碱具有
协同增效作用[5],但块茎中SGAs含量过高对人和动物会产生明显的剧毒性和潜在的慢毒性,主要是麻痹呼吸系
统和运动中枢神经系统,并有溶血和刺激、腐蚀粘膜的作用,含量超过一定值(20mg/100gFW)时严重影响其食
味和食用安全性[6],甚至有致畸和致死的可能。在不同发育时期和不同器官中,马铃薯的SGAs积累量有很大差
异[79],该基因很可能也受干旱、高盐、低温及激素等逆境胁迫的诱导,并在这些诱导条件下其表达量可能会显著
升高[10],这有待进一步的研究。因此,调控不同器官中SGAs的分布和含量,对于协调抗性及品质之间的矛盾至
关重要。
前人研究认为,SGAs生物合成过程可分为3个阶段(图1),其中第1和第2阶段(乙酰CoA…→环阿乔醇)
为初级代谢,而由环阿乔醇转变为油菜素内酯(brassinolide)、谷甾醇(stigmasterol)或SGAs的第3阶段为次生
代谢[11]。中间代谢物环阿乔醇(cycloartenol)为分支点,其甲基化为油菜素内酯和谷甾醇合成支路,而糖基化则
朝着SGAs合成方向进行。SGTs合成代谢支路的末端茄啶糖基转移酶(solanidineglycosyltransferases,SGTs)
是茄碱或卡茄碱合成的关键限速酶,其中茄啶葡萄糖基转移酶(solanidineglucosyltransferase,SGT2)和茄啶半
106-116
2012年6月
   草 业 学 报   
   ACTAPRATACULTURAESINICA   
第21卷 第3期
Vol.21,No.3
收稿日期:20111205;改回日期:20120216
基金项目:科技部国家重点基础研究发展计划(973计划)前期项目(2010CB134404)和甘肃省自然科学基金项目(0710RJZA088)资助。
作者简介:牛继平(1983),男,甘肃陇南人,在读硕士。Email:niujiping0513@163.com
通讯作者。Email:jwzhang305@163.com,wangd@gsau.edu.cn
乳糖基转移酶(solanidinegalactosyltransferase,SGT1)分别催化产生γ-查茄碱和γ茄碱,鼠李糖基转移酶(so
lanidinerhamnosyltransferase,SGT3)催化β查茄碱和β茄碱转化为α查茄碱和α茄碱。Moehs等
[12]和 McCue
等[13,14]已鉴定并克隆了狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3基因的cDNA序列。本研究通过调控SGAs合成代谢末端糖基转移酶
基因的表达及其在植物体内空间分布,成为茄科植物品质和抗性育种的重要研究内容,但对这3个基因编码的酶
蛋白结构和功能方面的研究未见报道。本研究采用RT-PCR方法克隆了马铃薯块茎的狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3的
cDNA,并通过生物信息学分析方法预测了SGT1、SGT2和SGT3的结构、性质和功能,为进一步分离酶蛋白和
研究其活性提供理论基础,并为调控植物体内SGAs的空间分布以及在其他遗传系统中表达提供必要的理论基础。
图1 甾醇类糖苷生物碱生物合成简图
犉犻犵.1 犛犻犿狆犾犻犳犻犲犱犫犻狅狊狔狀狋犺犲狋犻犮狆犪狋犺狑犪狔犳狅狉狊狋犲狉狅犻犱犪犾犵犾狔犮狅犪犾犽犪犾狅犻犱狊
 丙酮酸Pyruvicacid;辅酶ACoenzymeA;3羟基3甲基戊二酰CoA还原酶3hydroxy3methylglutarylcoenzymeAreductase;乙酰辅酶AAce
tylCoA;异戊烯焦磷酸Isopenyldiphosphate;法呢基焦磷酸Farnesyldiphosphate;倍半萜类Sesquiterpenes;鲨烯合酶Squalenesynthase;2,3氧
化鲨烯环化酶2,3oxidosqualene;其他三萜类 Othertriterpenes;环阿乔醇Cycloartenol;甾醇C24甲基转移酶SterolC24methyltransferase;谷甾
醇Sitosterol;芸苔甾醇Campesterol;芸苔类固醇Brassinosteroids;胆固醇Cholesterol;茄啶Solanidine;茄碱Solanine;查茄碱Chaconine;茄啶:糖
基转移酶Solanidine:UDPglucosyltransferase(SGT).
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验样品 根据前期研究,红光诱导下马铃薯普通四倍体栽培种“庄薯3号”的SGAs含量剧增,因此选
用此品种为实验材料,其试管薯由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室提供。该基因是光敏感基因型,在
长日照与短日照条件下昼夜24h的表达存在明显差异,不同的光周期SGAs含量的积累有差异[15],本实验所用
的材料在人工气候箱中,10℃、红光照射试管薯48h后,用解剖刀削0.05mm表皮,加液氮速冻并贮于-80℃超
低温冰箱备用。整个试验于2010年11月-2011年9月在甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室进行。
1.1.2 菌株与载体 大肠杆菌(犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻)菌株DH5α由本实验室保存,pMDR19TVector(Ampr)购自
宝生物工程(大连)有限公司。
701第21卷第3期 草业学报2012年
1.1.3 主要试剂 总RNA提取试剂盒(RNAsimpleTotalRNAKit)、反转录试剂盒(QuantscriptRTKit)和普
通琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒(TIANgenMidiPurificationKit)购自天根生化科技有限公司。TaqDNA
聚合酶、PfuDNA聚合酶、dNTPs、焦碳酸二乙酯(DEPC)、限制性内切酶购自上海宝生物工程有限公司,其他药
品试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 马铃薯块茎总RNA提取 利用总RNA提取试剂盒提取“庄薯3号”试管薯表皮层总RNA;加入DNaseI
去除可能存在的基因组DNA,将提取的总RNA进行小分装,一部分于-80℃保存备用,另一部分用于紫外分光
光度仪测定和琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 马铃薯块茎组织第1链cDNA合成 按照天根生化科技有限公司的Quantscript第1链cDNA合成试
剂盒说明进行操作,合成后-20℃保存备用。
1.2.3 3个糖基转移酶基因引物设计 通过GenBank中已报道的茄啶半乳糖基转移酶SGT1(DQ218276.1)、
茄啶葡萄糖基转移酶SGT2(U82367.2)、和鼠李糖基转移酶SGT3(DQ266437)三个基因的cDNA序列,利用分
子生物学软件Oligo6.0和Premer5.0设计特异性克隆引物各1对(表1)。
表1 目的基因犘犆犚扩增引物
犜犪犫犾犲1 犛狆犲犮犻犳犻犮犘犆犚狆狉犻犿犲狉犳狅狉狋犪狉犵犲狋犵犲狀犲狊
基因Gene 引物序列Primerssequence(5′-3′) 退火温度Annealingtemperature(℃) 产物长度Lengthofproduct(bp)
狊犵狋1 F:CGACAATGGTAGCAACCTGCAAC 54.8 1505
R:CGCACCAAGTTACAATGCAAGGAC
狊犵狋2 F:CGACAATGGATAACGGGAGCAAGCAACT 57.5 1497
R:CGCCCAGCCCTAGTCGAAACTTTAAG
狊犵狋3 F:CGACAATGGCGATGGAACAGAATGAAG 55.5 1518
R:CGTCAAGAGGATTTCTTGAAAGCACAAC
1.2.4 3个糖基转移酶基因cDNA克隆 以cDNA第一链为模板,用设计合成的特异引物进行PCR扩增。其
反应体系为:2.5μL10×pfubuffer,1.5μLMgCl2(25mmol/L),2.5mmol/LdNTPMixtu2μL,10pmol/L
N端和C端引物各1μL,0.25μLpuf聚合酶5U/μL),50~100ng模板,加ddH2O至25μL。PCR反应条件
为:95℃预变性4min;94℃55s,54.8℃/57.5℃/55.5℃1min,72℃2min,35个循环数;72℃后延伸反应10
min;4℃保存。取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳,用DNA琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化目的片段,与pMDR19
TVector于16℃过夜连接;将连接产物转化DH5α感受态细胞,将转化细胞涂布在含50μg/mLAmp
r、100μL
(20mg/mL)5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷(Xgal)和20μL(0.5mol/L)异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)的
SOC平板上37℃培养16h后进行蓝白斑筛选,对所获得的白斑通过滞后质粒、PCR扩增、HindIII和EcoRI双
酶切鉴定,重复10次,-80℃下保存。
1.3 3个糖基转移酶基因序列测定及分析
将鉴定合格的菌液分别送到上海美吉生物医药科技有限公司、生工生物工程(上海)有限公司和北京六合华
大基因科技股份有限公司进行DNA序列测定,重复8次。测序序列采用CLCProteinWorkbench5.0软件分析
拼接,得到正确调控马铃薯SGAs合成酶基因序列和氨基酸序列。提交到GenBank上,用BLAST软件与NCBI
收录的基因序列和蛋白序列进行比较。同时对测序结果进行核酸、蛋白质性质及结构的分析、预测。
1.3.1 核苷酸性质分析 基因的编码框用NCBI提供的在线 ORFFinder寻找(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/gorf/gorf.html);核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜索登陆NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)网上的
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在线BLASTn,寻找所克隆的3个基因相同源的核苷酸序列,分析它们在核苷酸与氨基酸水平上的同源性;运用
软件CHIPS对调控马铃薯SGAs合成基因进行有效密码子数(effectivenumberofcodons,ENc)统计,再运用
CUSP和CodonW计算有效密码子数、CDS区的GC含量和密码子的使用频率。
1.3.2 蛋白质性质分析 应用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)保守功能区
(conservedomain)在线分析调控马铃薯SGAs酶合成酶的保守序列;用TMHMMServerV.2.0(http://www.
cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)检测跨膜结构;用 ProtParam 软件(http://www.expasy.ch/tools/prot
param.html)分析克隆基因编码蛋白质的分子量,等电点和不稳定系数等;用SignalP3.0Server(http://www.
cbs.dtu.dk/services/SignalP/)检测编码蛋白的信号肽序列;用ProtScale软件(http://www.expasy.ch/tools/
protscale.html)分析氨基酸序列亲/疏水性分析。三级结构利用Phyle网站分析,用PSI-BLAST方法多序列
比对建模进行三级结构预测。
1.3.3 基于茄啶糖苷转移酶基因的物种进化分析 采用近邻结合法(neighborjoining)将NCBI中不同物种的
24种茄啶糖苷转移酶序列数据集合在一起,利用CLCProteinWorkbench5.0软件多重序列比对并绘制基因进
化树,进一步了解功能结构域的进化。
2 结果与分析
2.1 目的基因的克隆
以红光诱导下的马铃薯“庄薯3号”试管薯为材料,提取总RNA反转录获得cDNA第1链;利用已知的马铃
薯狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3基因cDNA序列设计3对特异引物,以cDNA第1链为模板,通过PCR扩增分别获得了约
1500bp的DNA片段(图2)。分别将扩增获得的3个片段与T载体pMDR19TVector连接后,转化感受态
犈.犮狅犾犻。通过滞后质粒筛选、PCR扩增和酶切鉴定,初步鉴定正确的重组子命名为pSGT1、pSGT2和pSGT3。
测序结果表明,克隆的狊犵狋1cDNA全长1505bp,与 GenBank中登录的序列(登陆号:U82367.2)同源性达到
99.12%,其中编码区长1467bp,编码488个氨基酸残基,编码的氨基酸序列相似性达到99.18%;克隆的狊犵狋2
基因序列全长1497bp,与GenBank登录的序列(登陆号:DQ218276.1)同源性达到99.80%,其中编码区长
1470bp,共编码489个氨基酸残基,氨基酸序列相似性达到99.59%;克隆的狊犵狋3基因序列全长1518bp,与
GenBank登录的序列(登陆号:DQ266437)同源性达到99.54%,共编码505个氨基残基,氨基酸序列相似性达到
99.01%。现已将克隆的3个基因cDNA序列注册到GenBank(狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3的注册号分别为JN695005、
JN695006和HM188447)。
图2 狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3的犘犆犚产物
犉犻犵.2 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳狊犵狋1,狊犵狋2,狊犵狋3犮犇犖犃犻狀狆狅狋犪狋狅
 M1,M2:DL5000DNAmarker;M3:DL2000DNAmarker;1:狊犵狋1;2:狊犵狋2;3:狊犵狋3.
901第21卷第3期 草业学报2012年
2.2 茄啶糖苷转移酶基因的生物信息学分析
2.2.1 茄啶糖苷转移酶基因系统进化 已克隆的3个马铃薯茄啶糖苷转移酶基因与番茄(犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻
犮狌犿)序列同源性都最高,与刺茄(犛狅犾犪狀狌犿犪犮狌犾犲犪狋犻狊狊犻犿狌犿)次之,与栀子(犌犪狉犱犲狀犻犪犼犪狊犿犻狀狅犻犱犲狊)、蒺藜苜蓿
(犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪)、葡萄(犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪)、蓖麻(犚犻犮犻狀狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊)、毛果杨(犘狅狆狌犾狌狊狋狉犻犮犺狅犮犪狉狆犪)、枸杞
(犔狔犮犻狌犿犫犪狉犫犪狉狌犿)等植物的序列同源性较低(图3)。
图3 基于马铃薯茄啶糖苷转移酶基因的不同物种间的基因进化树
犉犻犵.3 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狆犲犮犻犲狊犫犪狊犲犱狅狀狊狅犾犪狀犻犱犻狀犲犵犾狌犮狅狊狔犾狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲犵犲狀犲犻狀狆狅狋犪狋狅
 番茄:犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿;马铃薯:犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿;刺茄:犛狅犾犪狀狌犿犪犮狌犾犲犪狋犻狊狊犻犿狌犿;栀子:犌犪狉犱犲狀犻犪犼犪狊犿犻狀狅犻犱犲狊;蒺藜苜蓿:犕犲犱犻犮犪犵狅
狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪;葡萄:犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪;蓖麻:犚犻犮犻狀狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊;毛果杨:犘狅狆狌犾狌狊狋狉犻犮犺狅犮犪狉狆犪;枸杞:犔狔犮犻狌犿犫犪狉犫犪狉狌犿.
2.2.2 3种茄啶糖苷转移酶蛋白同源性 3种茄啶糖苷转移酶氨基酸序列与同属植物番茄的同源性很高,分别
为93%(ADQ37964.1),88%(ADQ37965.1)和86%(ADQ37966.1)(图4)。运用NCBI的ConservedDomains
工具分析克隆基因保守结构域,发现含有名为糖基转移酶超家族基因(Glycosyltransferasesuperfamily)的保守
区;与GenBanK中序列号ABB84472.1的结构域比较表明,克隆的3个基因同属于糖基转移酶基因家族中的
GT-B超家族。
2.3 茄啶糖苷转移酶蛋白特性分析
2.3.1 茄啶糖苷转移酶蛋白理化性质的预测 根据ProtParam软件(http://www.au.expasy.ory/tools/prot
param.html)预测表明(表2):3种茄啶糖苷转移酶蛋白分子式为C2489~2571H3880~4012N635~674O724~743S16~25,分子量
为55.02~55.26kD,理论等电点为5.52~5.62,等电点的差异表明,这3个基因与其他植物的糖基因转移酶基
因在蛋白稳定性、功能或者调控方式上有可能有所差异[16],带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)为60~63,带正
电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)为46~51;不稳定系数为41.35~45.70,均为不稳定蛋白(标准40以下的为稳定
蛋白),理论推导半衰期大约为30h;脂肪系数平均为91.31~92.50,总平均疏水性为-0.189~-0.126。含量
较高的氨基酸依次为Ser(7.4%~10.2%)、Leu(8.9%~10.0%)、Ile(7.0%~9.1%)、Glu(7.4%~8.5%)、Lys
(5.7%~7.4%)、Ala(5.5%~6.5%)和Ala(5.9%~6.1%)。
用ProtScale预测3种茄啶糖苷转移酶蛋白的疏水性/亲水性的结果表明,SGT1多肽链第201位的天冬氨
酸(Asp)具有最低的分值-2.678,亲水性最强,第14位的亮氨酸(Leu)具有最高的分值2.322,疏水性最强;
SGT2多肽链第84位的组氨酸(His)具有最低的分值-2.467,第369位的半胱氨酸(Cys)具有最高的分值
2.533;SGT3多肽链第342位的赖氨酸(Lys)具有最低的分值-2.922,第302位的苯丙氨酸(Phe)具有最高的分
值2.367。整体来看,3种茄啶糖苷转移酶蛋白疏水性氨基酸均匀分布在整个肽链中(图5),且多于亲水性氨基
酸,为疏水蛋白。
011 ACTAPRATACULTURAESINICA(2012) Vol.21,No.3
图4 犛犌犜狊氨基酸序列与茄啶糖苷转移酶家族比对结果
犉犻犵.4 犕狌犾狋犻狆犾犲犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犛犌犜1,犛犌犜2犪狀犱犛犌犜3狆狉狅狋犲犻狀狅犳狊狅犾犪狀犻犱犻狀犲犵犾狌犮狅狊狔犾狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲
 Consensus表示一致性序列,并在序列下面列出;黑色阴影表示6个序列中均保守的茄啶糖苷转移酶结构域,其他根据保守程度高低依次使用蓝
色和红色阴影标示。Consensusindicatessamesequencesandarelistedbelow;Blackshadowindicatessolanidineglucosyltransferaseconserveddo
main,accordingtothedegreeofconservation,blueandredareindicated.
表2 3个犛犌犜酶蛋白一级结构分析结果
犜犪犫犾犲2 犚犲狊狌犾狋狊狅犳狆狉狅狋犲犻狀狆狉犻犿犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲犪狀犪犾狔狊犻狊犻狀狆狅狋犪狋狅
蛋白
Protein
分子式
Formula
分子量
Molecular
weight
理论等电点
Theoretical
PI
天冬氨酸+
谷氨酸
Asp+Glu
精氨酸+
赖氨酸
Arg+Lys
不稳定系数
Instability
index
脂肪指数
Aliphatic
index
总平均疏水性
Grandaverageof
hydropathicity
SGT1 C2502H3880N648O724S20 55.26 5.52 60 46 45.70 92.50 -0.189
SGT2 C2489H3885N635O743S16 55.12 5.53 60 51 41.35 91.31 -0.154
SGT3 C2571H4012N674O742S25 57.02 5.62 63 50 44.07 92.30 -0.126
111第21卷第3期 草业学报2012年
图5 3种犛犌犜酶蛋白疏水性分析
犉犻犵.5 犎狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔狆狉狅犳犻犾犲狅犳狋犺狉犲犲犛犌犜狊狆狉狅狋犲犻狀狊
 横坐标为编码的氨基酸顺序,纵坐标为亲/疏水值,“-”表示亲水性 “+”表示疏水性。Abscissaistheaminoacidsequenceoftheencodedprotein;
ordinateistheprohydrophbicvalue;“-”representshydrophilic;“+”referstohydrophobic.A:SGT1蛋白 HydrophobicityprofileofSGT1pro
tein;B:SGT2蛋白 HydrophobicityprofileofSGT2protein;C:SGT3蛋白 HydrophobicityprofileofSGT3protein.
2.3.2 SGTs蛋白氨基酸序列信号肽的预测和分析 用signalp3.0server软件(http://www.cbs.dtu.dk/
services/SignalP)检测,只有当C、Y、S值的计算结果均为“YES”,平均值在0.5以上时,才可能存在信号肽。D
值是 MeanS和 MaxY的平均值,对区分是否为分泌性蛋白具有重要作用。从预测结果看(表3),只有SGT1具
备信号肽,而且蛋白质N端的氨基酸区域的平均值高且有显著的可能性,说明SGT1蛋白为分泌性蛋白;SGT2
的C值和Y值是“YES”,但S值为“NO”,说明狊犵狋2基因不存在信号肽。SGT3只有C值为“YES”,Y值和S值
为“NO”,说明狊犵狋3基因也不存在信号肽。据此可以认为,狊犵狋2基因和狊犵狋3基因编码的蛋白很有可能不具备信
号肽,SGT2蛋白和SGT3蛋白为非分泌性蛋白。
211 ACTAPRATACULTURAESINICA(2012) Vol.21,No.3
表3 信号肽预测结果
犜犪犫犾犲3 犚犲狊狌犾狋狊狅犳狊犻犵狀犪犾狆犲狆狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狆狉犲犱犻狋犻狅狀
计量单位
Measure
位置Position
SGT1 SGT2 SGT3
有用性Value
SGT1 SGT2 SGT3
临界值Cutoff
SGT1 SGT2 SGT3
信号肽Signalpeptide
SGT1SGT2SGT3
非分泌蛋白Nonsecretoryprotein
SGT1 SGT2 SGT3
Max.C 31 28 23 0.949 0.955 0.408 0.32 0.32 0.32 YES YES YES NO YES YES
Max.Y 31 28 37 0.605 0.572 0.162 0.33 0.33 0.33 YES YES NO NO YES YES
Max.S 20 27 34 0.913 0.834 0.846 0.87 0.87 0.87 YES NO NO NO YES YES
MeanS 1~30 1~27 1~36 0.527 0.372 0.240 0.48 0.48 0.48 YES NO NO NO YES YES
D 1~30 1~27 1~36 0.566 0.472 0.201 0.43 0.43 0.43 YES NO NO NO YES YES
2.3.3 SGTs蛋白氨基酸序列信号肽的预测和分析 跨膜结构域是膜蛋白与膜脂结合的主要部位,一般由20
个左右的疏水性氨基酸残基组成,形成α螺旋与膜脂结合。预测和分析跨膜结构域对认识蛋白结构、功能、分类
以及在细胞中的作用部位均有一定的意义。用TMHMMServerv2.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM/)对3个基因编码的蛋白跨膜区段进行预测,结果(图6)表明,3种酶蛋白部分肽链位于细胞膜上,都
有明显的跨膜结构区域,通常都在靠近N端。其中,狊犵狋1在3~35bp处编码跨膜螺旋,中心位置是23bp处编码
的 His;狊犵狋2在7~25bp处编码跨膜螺旋,中心位置是16bp处编码的Phe;狊犵狋3在13~31bp处编码跨膜螺旋,
中心位置是23bp处编码的Ser。由此可以推断,这3个酶发挥功能的部位结合于生物膜上。
2.3.4 茄啶糖苷转移酶蛋白二级结构预测 登录http://www.predictprotein.org/,按指定格式将狊犵狋1、狊犵狋2
和狊犵狋3编码的氨基酸序列输入对话框,运行程序。对3种酶蛋白的预测结果显示,组成SGT1的488个氨基酸
中,181个氨基酸可能形成α螺旋结构,51个氨基酸可能形成β折叠片,256个氨基酸可能形成无规则卷曲;组成
SGT2的489个氨基酸中,182个氨基酸可能形成α螺旋结构,53个氨基酸可能形成β折叠片,254个氨基酸可能
形成无规则卷曲;组成SGT3的505个氨基酸中,177个氨基酸可能形成α螺旋结构,52个氨基酸可能形成β折
叠片,276个氨基酸可能形成无规则卷曲。
2.3.5 茄啶糖苷转移酶蛋白三级结构预测 将3个基因编码的酶蛋白氨基酸序列提交到Phyre网站,用PSI
BLAST方法进行多序列比对建模,从Phyre处可获得二级结构(secondarystrctureprediction)、无序区预测(dis
orderprediction)和折叠结构识别(foldrecognition)等信息。预测结果表明,3个基因编码蛋白对应C2Vg8A模
板的PSSME值最小(SGT1的E值=3.7e-32,SGT2的犈值=3.6e-31,SGT2的犈值=9.8e-34),C2Vg8A模板
应是3个基因编码蛋白首选的预测模型。C2Vg8A是植物中与新陈代谢相关的糖基转移酶的模板,依此为模型
对3个基因编码蛋白进行三级结构预测。将获得的模板和狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3的PDB文件用Rasmol查看,发现
两两单体结构非常相似(图7),表明马铃薯狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3编码蛋白都具有糖基转移酶的功能。
3 讨论
在植物次生代谢物合成途径中关键酶的分离及其基因的克隆是植物次生代谢酶促反应机制研究的基础,而
特定植物次生代谢物合成与积累量取决于其合成途径中的限速酶,它们在植物次生代谢物生物合成途径中往往
位于代谢支路分叉口或途径的下游[17],对马铃薯SGAs合成代谢途径末端SGT酶的研究,不仅有助于了解类固
醇糖苷生物碱的合成机制,而且还很可能有助于了解马铃薯块茎中糖苷生物碱的代谢途径。然而3个SGAs合
成代谢途径末端SGT酶基因序列相互之间的同源性很低,即使是被认为结合尿苷二磷酸葡萄糖(uridinediphos
phateglucose,UDPG)的特征性序列的44个氨基酸区域也只有43%~68%的相似性[18],很难利用这类基因的
同源或保守区域设计同源简并引物克隆基因。因此本研究根据Genbank已经注册的马铃薯3个SGT酶基因
狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3序列(U82367.2,U82367.2,DQ266437)设计特异引物,利用RT-PCR和序列测定技术获得了
3个相似基因的cDNA序列。生物信息学是一门发展迅速的新兴科学,利用相关软件可分析基因组或目的基因
的序列特征、功能蛋白的结构和功能、分子遗传图谱的构建等[19],为利用功能基因改良作物遗传特性奠定基础。
本研究对克隆到的狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3三个基因的cDNA片段利用相关软件进行了分析,发现狊犵狋1、狊犵狋2和狊犵狋3
311第21卷第3期 草业学报2012年
图6 3个犛犌犜酶蛋白质跨膜区分析
犉犻犵.6 犜狉犪狀狊犿犲犿犫狉犪狀犲狉犲犵犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆狉狅狋犲犻狀狅犳狋犺狉犲犲狊狅犾犪狀犻犱犻狀犲犵犾狌犮狅狊狔犾狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲
 A:SGT1酶蛋白 TransmembraneregionanalysisofSGT1protein;B:SGT2酶蛋白TransmembraneregionanalysisofSGT2protein;C:SGT3酶蛋
白 TransmembraneregionanalysisofSGT3.
图7 预测的3个茄啶糖苷转移酶三级结构
犉犻犵.7 犕狅狀狅犿犲狉3犇狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳狋犺狉犲犲狊狅犾犪狀犻犱犻狀犲犵犾狌犮狅狊狔犾狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲
 A:C2Vg8A单体 Monomer3DstructureofC2Vg8A;B:预测SGT1单体 Monomer3DstructureofSGT1;C:预测SGT2单体 Monomer3Dstruc
tureofSGT2;D:预测SGT3单体 Monomer3DstructureofSGT3.
411 ACTAPRATACULTURAESINICA(2012) Vol.21,No.3
基因都具备一个完整的开放阅读框架,大小分别为1497,1470和1518bp,分别编码488,489和505个氨基酸,
它们都属于糖基转移酶家族蛋白成员,克隆的3个基因都属于糖基转移酶基因家族中的GTB超家族,它们都具
有1个尿苷二磷酸葡萄糖糖基转移酶的保守功能区域,三者同时存在着豆蔻酰化,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、蛋白激
酶C磷酸化、依赖cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化和糖基化等功能位点,在cGMP介导的信号传导途径中蛋白激
酶的N端豆蔻酰化蛋白发挥重要作用。进化分析表明,它们与同属植物番茄的同源性很高,分别为93%
(ADQ37964.1),88%(ADQ37965.1)和86%(ADQ37966.1);与其他植物的同源性分别是70%~73%(SGT1),
68%~84%(SGT2)和87%(SGT3),说明在同源关系相近的植物中这些基因的保守性很强,这与其他学者对不
同基因或不同物种同源性分析时的结论是一致的,即属内同源性高,属间相对低[2022],高等植物SGT酶基因在进
化上可能较为保守,其氨基酸序列相似度在一定程度上反映不同物种亲缘关系远近[23,24]。
在本研究中,对马铃薯SGAs合成代谢途径末端SGT酶基因进行了探讨,通过对3个SGT酶基因进行PCR
扩增,获得了含有SGT酶3个基因狊犵狋1、狊犵狋2、狊犵狋3编码基因的完整序列并对其进行基因序列分析、氨基酸序列
分析、信号肽分析、进化树构建以及其所编码蛋白的三级结构预测。为今后用基因工程技术对马铃薯SGAs合成
代谢途径末端SGT酶基因进行研究与开发提供了理论依据,为利用基因工程创制新型马铃薯SGAs品种奠定了
基础。
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犲狉犿犻狀犪狊犲犵犲狀犲狅犳犵犾狔犮狅犪犾犽犪犾狅犻犱犫犻狅狊狔狀狋犺犲狊犻狊
犿犲狋犪犫狅犾犻狊犿犻犮狆犪狋犺狑犪狔犻狀狆狅狋犪狋狅
NIUJiping1,2,3,ZHANGJinwen1,2,WANGWangtian1,2,WANGDi1,2,
LUYanmei1,2,ZHANGJunlian1,2
(1.GansuKeyLabofCropImprovement&GermplasmEnhancement,Lanzhou730070,China;
2.GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience,Lanzhou730070,
China;3.ColegeofLifeSciencesandTechnology,GansuAgricultural
University,Lanzhou730070,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Thepotatosteroidalglycoalkaloids(SGAs)isanimportantsecondarymetabolitesinsolanaceaeand
liliaceae.Itiscloselyrelatedtotheantireversionforceofplanitselfeandproductquality,simultaneously,it
hasawidepharmacologicalactivityinpharmacology.Solanidine:UDPglucosyltransferase(SGT)wasthekey
enzymeoftheterminalofSGAsanabolicpathwayin犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿.Studyingthegenestructureandits
encodingenzymeproteincharacteristicplaysanimportantroleintheprocessoftheregulationofSGAssynthe
sisandproductionofSGTsbymicrobialfermentationinplant.Analyzingthestructureandpropertiesofthree
enzymeproteinencodedbyglycosyltransferasecDNAstructureandpropertiesbybioinformaticsmethod.Total
RNAwasextractedfromstemof犛.狋狌犫犲狉狅狊狌犿andthreeglycoalkaloidsynthasegene(SGT1,SGT2and
SGT3)fragmentwasobtainedbyreversetranscriptionpolymerasechinreaction(RTPCR).Itwasclonedinto
pMDR19TvectorandthepositiveclonesidentifiedbyPCRweresequenced.ThreeSGTenzymegenefrag
mentsweregainedfromstemof犛.狋狌犫犲狉狅狊狌犿,eachofwhichcontains1467-1518bpandencodesapeptideof
488-505aminoacids.Similaritycomparisonsshowthattheyshareover99.12%similarityinnucleotidese
quenceandover99%similarityinaminoacidsequencewiththoseofotherplantSGTasegene(U82367.2,DQ
218276.1andDQ266437)inGenBank,UDPGglycosyltransferaseconserveddomainandmanyimportantfunc
tionalsites.thePI=5.52-5.62.The3Dstructureofproteinwaspredictedbyhomologycomparativemodel
inginSwissModel,theresultsshowedthatthe3DstructureofSGTwashighlysimilartothatoftheglycosyl
transferase,soitwasinferredthatSGT3shouldbeamemberofglycosyltransferasesuperfamilythathasfunc
tionofsteroidalglycoalkaloid.狊犵狋1,狊犵狋2and狊犵狋3similargeneobtainedherewasrhamnosyltransferasegene,
anditssequencewassubmittedwith GenBank:狊犵狋1,No:JN695005;狊犵狋2,No:JN695006;狊犵狋3,No:
HM188447.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿;glycoalkaloid;solanidineglucosyltransferase;genecloning;sequenceanalysis
611 ACTAPRATACULTURAESINICA(2012) Vol.21,No.3