全 文 ：书利用犛犆狅犜标记分析不同秋眠型
苜蓿的遗传多样性
何庆元１，２，王吴斌２，杨红燕２，向仕华２，周丽英１，王松华１
（１．安徽科技学院生命科学学院，安徽 凤阳２３３１００；２．南京农业大学大豆研究所 国家大豆改良中心
作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏 南京２１００９５）
摘要：用Ｌ１６（４５）正交实验设计研究模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋、犜犪狇酶和引物５个因素的浓度对ＳＣｏＴ扩增迁移率
重现率的影响。结果表明，在２０μＬ反应体系中，２．５ｎｇ／μＬＤＮＡ、１．００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ
２＋、１．２０Ｕ犜犪狇酶、０．４０
ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ和０．３０μｍｏｌ／Ｌ浓度的引物最为稳定，重现率达到１００％。利用最优反应体系从５０条引物中筛选
出１３条扩增效果好的引物，将它们分别扩增３４个苜蓿品种，共检测到１０３个ＳＣｏＴ标记，其中９２个位点具有多态
性。聚类分析表明，从安徽和江苏两地收集的野生南苜蓿和栽培苜蓿的遗传距离最远，单独聚为一类；其余３２个
品种苜蓿在相似系数０．７５７附近分为３个亚群，秋眠型苜蓿品种主要分布在第Ⅱ亚群中，半秋眠型在３个亚群中都
有分布，而非秋眠型苜蓿分布在第一和第二亚群中，表明ＳＣｏＴ标记的聚类结果在一定程度上能够反映苜蓿的秋
眠型，但并不完全一致。
关键词：苜蓿；ＳＣｏＴ；条件优化；秋眠型；遗传多样性
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５５１＋．７０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０２０１３３０８
分子标记技术是近年迅速发展起来的一种技术手段，已广泛地应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基
因定位和分子标记辅助选择等各个方面［１］。按其作用分为随机ＤＮＡ分子标记（ｒａｎｄｏｍＤＮＡｍａｒｋｅｒｓ，ＲＤＭｓ）、
目的基因分子标记（ｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｅｄｍａｋｄｅｒｓ，ＧＴＭｓ）和功能性分子标记（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍａｒｋｅｒｓ，ＦＭｓ）［２］。目前广泛
使用的基于ＰＣＲ基础的分子标记大部分都是扩增非编码区或随机在基因组中，得到的位点一般与目标性状基因
距离较远，经遗传重组，引起了随机ＤＮＡ分子标记与目的等位基因位点之间的交换，导致分子标记在应用上与
其目标有一定的偏差，限制了ＲＤＭｓ作为诊断性分子标记的应用［３］。随着结构及功能基因组学的飞速发展，基
于目的基因开发目的基因和功能性分子标记成为分子标记发展的方向。
ＳＣｏＴ标记（ｓｔａｒｔｃｏｄｏｎｔａｒｇｅｔｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是国际水稻所Ｂｅｒｔｒａｎｄ等在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）上开发的
一种类似ＲＡＰＤ（随机引物扩增多态性）的基因型分子标记，与ＲＡＰＤ一样利用单引物扩增。其引物设计的核心
是依赖短的保守起始序列，在翻译的起始区，都有ＡＴＧ序列的起始密码子（＋１，２，３），紧跟着是一个Ｇ（＋４），在
＋７，８，９位置是Ａ，Ｃ，Ｃ，这７个核苷酸是固定的，引物总长度１８ｎｔ，其他位置为填充序列。以基因的５′起始区域
为起点，扩增２个基因间区域，是一种新型与目的基因紧密连锁的基因型分子标记。同时，它利用较高的退火温
度（５０℃）能够有效保证扩增的保守性，大大降低了假阳性扩增出现的几率，具有ＲＡＰＤ的快速、简单的优点，但
比ＲＡＰＤ技术具有更好的重现性和稳定性［４６］。因此，ＳＣｏＴ技术作为新型分子标记技术在基因作图和遗传多样
性等研究上有较高的应用价值。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）被称之为“牧草之王”，是当今世界分布最广的栽培牧草，目前全世界种植面积
约１２３３万ｈｍ２，在我国已有２０００多年的栽培历史。其适应性广泛，品质优良，适口性好等特点，根系发达而耐
旱且根瘤菌固氮能力强等优良性状，是良好的水土保持和蜜源植物［７］。苜蓿属植物全世界约有６５种，多数为优
良牧草，并且紫花苜蓿为同源四倍体异花授粉植物，其遗传基础复杂［８］，从形态学、细胞学和同工酶水平上较难区
第２１卷 第２期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１３３－１４０
２０１２年４月
收稿日期：２０１１０１１３；改回日期：２０１１０３１８
基金项目：国家“９７３”计划基金项目（２００７ＣＢ１０８９０１），安徽省教育厅重大基金项目（ＺＤ２００９１０）和安徽科技学院校级重点学科（ＡＫＸＫ２０１０２
１）资助。
作者简介：何庆元（１９７８），男，安徽宿松人，助理研究员，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｈｅｑｉｎｇｙｕａｎ１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｓｈｗａｎｇ７０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
分其亲缘关系，分类受到环境和主观因素影响。选用一种合适的分子标记研究苜蓿的遗传资源将为苜蓿育种和
遗传改良打下坚实的基础。目前，苜蓿的遗传、种质资源和重要农业性状ＱＴＬ定位研究的分子标记技术主要有
ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、ＩＳＳＲ和ＳＲＡＰ［９１５］。但这些标记大部分是随机ＤＮＡ标记，在进行ＱＴＬ（数量性状基
因座位）作图时，在不同群体上需要重新标记，而ＳＣｏＴ标记是基因型标记，可以通过选择不同变种表型与等位基
因相关位点的存在和缺失区分种质，精确反映出等位基因的真实多样性［４］。
苜蓿秋眠型是苜蓿引种栽培的重要依据，对生产实践具有指导意义。本研究采用正交设计方法建立苜蓿
ＳＣｏＴ技术的最优体系，并采用该技术从基因组水平上系统考察了３４个不同秋眠型的苜蓿品种的亲缘关系，为
促进苜蓿合理引种及育种利用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试材料
材料为３４个苜蓿品种，包括３２个紫花苜蓿品种和２个南苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅犺犻狊狆犻犱犪）品种（表１）。ＳＣｏＴ引物
（５０条）由上海生工生物工程有限公司合成、Ｔａｑ酶和ｄＮＴＰｓ为天根生物有限公司生产。
１．２ 总ＤＮＡ的提取及纯度和浓度测定
取各品种苜蓿叶片，用液氮研磨碎，用改良十六烷基三甲基溴化铵法提取基因组ＤＮＡ［１６］。在含ＥＢ的１％
琼脂糖凝胶上电泳检测，然后取２０μＬＤＮＡ稀释１５０倍，在紫外分光光度计上测定２６０和２８０ｎｍ的吸收值，计
算其浓度和纯度后，合格样品于－２０℃冰箱保存备用。
１．３ ＳＣｏＴ体系优化的实验设计
以新牧１号苜蓿ＤＮＡ作为模板和经预试能够有效扩增的１条引物（ＡＷ２５３９５）进行正交设计试验，在２０μＬ
的反应体系中添加１μＬ的２５ｍｇ／ｍＬ的牛血清白蛋白，对模板ＤＮＡ浓度、Ｍｇ
２＋浓度、Ｔａｑ酶浓度、ｄＮＴＰｓ浓
度、引物浓度共５个因素，每个因素设置４个水平进行正交实验设计（表２），每个处理重复３次。
１．４ ＰＣＲ扩增、引物筛选和凝胶电泳
聚合酶链式反应程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；然后９４℃变性１ｍｉｎ、５０℃退火１ｍｉｎ、７２℃延伸１．５ｍｉｎ、３５个循
环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。体系优化和引物筛选后，利用最优体系和筛选的引物对３４个苜蓿品种进行
扩增。扩增产物在含０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭的１．２％琼脂糖凝胶中电泳，待溴酚蓝电泳至凝胶尾端约１ｃｍ时停止
电泳，约需２ｈ。电泳完毕观察、再用凝胶成像系统紫外光下拍照。
１．５ 数据获取与分析
用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件分析胶片，统计每个处理扩增得到的ＤＮＡ条带数，经人工校正后，以１００ｂｐＰｌｕｓＤＮＡ
ＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ作为参照标准分子量，对扩增出的条带进行分子量预测，将分子量在±５ｂｐ范围内作为同一位置
的条带，统计条带的重现率，用ＳＰＳＳ进行方差分析，获得最佳反应体系。
重现率（％）＝同一处理中迁移率一致的片段数／总扩增出的片段数×１００
将３４个苜蓿品种上扩增获得的条带，经人工校正后，将其转化为“０”和“１”数字符，同一位置有条带处以“１”
表示，无条带和模糊不清的条带以“０”表示，用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１软件进行相似性分析，并利用非加权组平均法（ｕｎ
ｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｗｉｔｈｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｖｅｒａｇｅ，ＵＰＧＭＡ）对３４个苜蓿品种进行聚类分析。
２ 结果与分析
２．１ 苜蓿基因组ＤＮＡ的质量
电泳检测提取的苜蓿ＤＮＡ为１条主带，说明所提取的ＤＮＡ具有良好的完整性，紫外分光光度计测定２６０
和２８０ｎｍ下的吸光值，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０在１．６左右，能够用于ＰＣＲ扩增（图１）。
２．２ 正交设计各处理扩增结果的分析
２．２．１ 最佳体系的选择 利用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件统计条带，经人工校正后，比较扩增的重现率，结果表明，第５
处理的迁移率重现率达到１００％，其次是１，２，３，６，７，８，１０，１１，１５和１６处理迁移率重现率较高，达到８０％以上，
迁移率重现率最低的是第９处理，只有１１．１９％（表３）。依此确定第５个处理是ＳＣｏＴ反应最优体系，可用来扩
增其他苜蓿品种。
４３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
表１ 供试的苜蓿品种
犜犪犫犾犲１ 犃犾犳犪犾犳犪犮狌犾狋犻狏犪狉狊犻狀狋犺犻狊犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋
序号Ｎｏ． 品种名Ｃｕｌｔｉｖａｒ 秋眠等级Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙｒａｔｅ 秋眠类型Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙｔｙｐｅ 来源Ｏｒｉｇｉｎ
１ 四季旺Ｓｉｒｉｖｅｒ ９ 非秋眠型 Ｎｏｎｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ
２ 新疆大叶 Ｘｉｎｊｉａｎｇｂｉｇｌｅａｆ ５ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 中国Ｃｈｉｎａ
３ 维多利亚 Ｖｉｃｔｏｒｉａ ６ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 德国Ｇｅｒｍａｎｙ
４ 驯鹿 Ａｃ．ｃａｒｉｂｏｕ １ 秋眠型Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 加拿大Ｃａｎａｄａ
５ 路宝Ｌｏｂｏ ５ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
６ ＦＧＣ８２０１ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
７ 爱株＋ＺＡｂｉｌｅｎｅ＋Ｚ ５ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
８ Ｑｕａｄｒｅｌａ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
９ 超级阿波罗Ｓｕｐｅｒａｐｏｌｏ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
１０ 特瑞 Ｔｅｒｒｉ ７ 非秋眠型 Ｎｏｎｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
１１ 新牧１号 ＸｉｎｍｕＮｏ．１ １ 秋眠型Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃ 中国Ｃｈｉｎａ
１２ ＷＬ４１４ ６ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
１３ Ｒａｍｐａｇｅ ２ 秋眠型Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
１４ ＡＣ．Ｎｏｒｏｌｉｃａ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
１５ 猎人和 ＨｕｎｔｅｒＲｉｖｅｒ ７ 非秋眠型 Ｎｏｎｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ
１６ 寒苜１号ＣｏｌｄｍｕＮｏ．１ １ 秋眠型Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ
１７ 金皇后 ＧｏｌｄｅｎＥｍｐｒｅｓｓ ３ 秋眠型Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃ 美国 Ａｍｅｒｉｃａ
１８ 阿尔冈金 Ａｌｇｏｎｇｕｉｎ ２ 秋眠型Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃ 加拿大Ｃａｎａｄａ
１９ ＷＬ３２３ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２０ Ｎｓｏ３３ ７ 非秋眠型 Ｎｏｎｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２１ 超人Ｓｕｐｅｒｍａｎ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２２ Ａｂａｃｕｓ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２３ Ｍａｇｎａ６０１ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２４ 威拉 Ｖｅｌａ ６ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２５ 顶点 Ｄｉｎｇｄｉａｎ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２６ 胜利者 Ｖｉｃｔｏｒｙ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２７ 射手 Ａｒｃｈｅｒ ５ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２８ 苜蓿王 Ａｌｆａｋｉｎｇ ３ 秋眠型Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
２９ 超级１３Ｒ１３ＲＳｕｐｒｅｍｅ ８ 非秋眠型 Ｎｏｎｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国Ａｍｅｒｉｃａ
３０ 德国大叶 Ｇｅｒｍａｎｂｉｇｌｅａｆ 未知Ｕｎｋｎｏｗｎ 未知 Ｕｎｋｎｏｗｎ 中国Ｃｈｉｎａ
３１ ＦＧＣ４０１ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ
３２ 南苜蓿（安徽）犕犲犱犻犮犪犵狅犺犻狊狆犻犱犪（Ａｎｈｕｉ） 未知Ｕｎｋｎｏｗｎ 未知 Ｕｎｋｎｏｗｎ 中国Ｃｈｉｎａ
３３ 德宝 Ｄｅｒｂｙ ４ 半秋眠型Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ 美国 Ａｍｅｒｉｃａ
３４ 南苜蓿（江苏）犕犲犱犻犮犪犵狅犺犻狊狆犻犱犪（Ｊｉａｎｇｓｕ） 未知Ｕｎｋｎｏｗｎ 未知 Ｕｎｋｎｏｗｎ 中国Ｃｈｉｎａ
２．２．２ ＰＣＲ各组分浓度对迁移率重现性的影响 经方差分析结果表明，在２０μＬ的反应体系中，模板ＤＮＡ、
Ｍｇ２＋、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ和引物的浓度都能对重现率产生显著性影响（表４）。其中，ＤＮＡ浓度在２．５ｎｇ／μＬ最高，
并显著高于其他３个浓度下的重现率；而 Ｍｇ２＋浓度以１．５０ｍｍｏｌ／Ｌ迁移率重现率最高，显著高于１．００和１．７５
ｍｍｏｌ／Ｌ的 Ｍｇ２＋浓度的迁移率重现率，但与１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ时的 Ｍｇ２＋浓度没有显著差异；Ｔａｑ酶用量为１．００Ｕ
时迁移率重现率最高，并显著高于其他３个用量下的迁移率重现率；０．３２ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ下的迁移率重现率
最高，显著大于０．１６和０．２４ｍｍｏｌ／Ｌ时的迁移率重现率，与０．４０ｍｍｏｌ／Ｌ时的迁移率重现率没有显著差异；引
５３１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
物浓度在０．３０μｍｏｌ／Ｌ时，迁移率重现率最高，并显
著高于０．２０，０．５０μｍｏｌ／Ｌ 下的重现率；与０．４０
μｍｏｌ／Ｌ之间的重现率差异不显著。
２．３ 引物的筛选
引物筛选按第５处理反应体系进行，５０条引物分
别以新牧１号ＤＮＡ为模板进行扩增，结果有２７条引
物能扩增出有效条带。２７条引物进一步扩增３４个苜
蓿品种，其中，１３条引物能在所有苜蓿品种上都扩增
出有效条带，将这些条带作为遗传标记分析扩增特点
和不同品种亲缘关系（表５）。
表２ 犘犆犚正交试验设计
犜犪犫犾犲２ 犗狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀狅犳犘犆犚
ＤＮＡ模板
ＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ
（ｎｇ／μＬ）
Ｍｇ２＋浓度
Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｔａｑ酶
Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｕ）
ｄＮＴＰｓ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
（μｍｏｌ／Ｌ）
２．０ １．００ ０．８ ０．１６ ０．２０
２．５ １．２５ １．０ ０．２４ ０．３０
３．０ １．５０ １．２ ０．３２ ０．４０
３．５ １．７５ １．４ ０．４０ ０．５０
图１ ３４份苜蓿品种的电泳图
犉犻犵．１ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狆狉狅犳犻犾犲狅犳３４狅犳犪犾犳犪犾犳犪犮狌犾狋犻狏犪狉’狊犇犖犃
表３ 正交设计各处理的迁移率重现率
犜犪犫犾犲３ 犚犲犪狆狆犲犪狉狉犪狋犲犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱犻狊狆狅狊犲狊狅犳狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀犳狅狉犛犆狅犜－犘犆犚狊狔狊狋犲犿
处理号
Ｎｏ．
模板量
ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ
（ｎｇ／μＬ）
Ｍｇ２＋浓度
Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｔａｑ酶
Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｕ）
ｄＮＴＰｓ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
（μｍｏｌ／Ｌ）
迁移率重现平均值
Ａｖｅｒａｇｅｖａｌｕｅｒｅａｐｐｅａｒ
ｒａｔｅ（％）
１ ２．０ １．００ １．００ ０．３２ ０．５０ ９２．１３±６．８５
２ ２．０ １．２５ ０．８０ ０．４０ ０．４０ ８６．０７±９．６２
３ ２．０ １．５０ １．４０ ０．１６ ０．３０ ９２．２１±７．２３
４ ２．０ １．７５ １．２０ ０．２４ ０．２０ ５２．２２±６．４７
５ ２．５ １．００ １．２０ ０．４０ ０．３０ １００．００±０．００
６ ２．５ １．２５ １．４０ ０．３２ ０．２０ ８３．５５±８．６６
７ ２．５ １．５０ ０．８０ ０．２４ ０．５０ ８７．７８±５．７２
８ ２．５ １．７５ １．００ ０．１６ ０．４０ ８６．６７±６．６２
９ ３．０ １．００ ０．８０ ０．１６ ０．２０ １１．１９±２．６２
１０ ３．０ １．２５ １．００ ０．２４ ０．３０ ９４．４１±４．８９
１１ ３．０ １．５０ １．２０ ０．３２ ０．４０ ９３．３３±６．５５
１２ ３．０ １．７５ １．４０ ０．４０ ０．５０ ６１．１１±９．６２
１３ ３．５ １．００ １．４０ ０．２４ ０．４０ ７６．３９±６．４８
１４ ３．５ １．２５ １．２０ ０．１６ ０．５０ ７１．１１±７．７０
１５ ３．５ １．５０ １．００ ０．４０ ０．２０ ８１．９７±８．１４
１６ ３．５ １．７５ ０．８０ ０．３２ ０．３０ ８５．８６±７．２３
２．４ ＰＣＲ扩增结果
１３条引物扩增３４个苜蓿品种共获得１０３个遗传位点，其中有９２个位点在３４个品种间具有多态性，多态性
位点占总位点的８９．３２％。其中引物ＡＷ２５４１６扩增出的标记数最多，达１３个，而ＡＷ２５４１０扩增出的标记最少，
只有４个；引物ＡＷ２５４１６和ＬＷ１６９９５在所有的品种上都扩增出了２个相同位点，引物 ＡＷ２５３９５、ＡＷ２５４０６、
ＬＷ１６９９７、ＬＷ１７００１、Ｗ３４４４１、Ｗ３４４６７和 Ｗ３４４７０在所有苜蓿上都扩增出１个相同位点，但引物 ＡＷ２５４０５、
ＡＷ２５４１０、Ｗ３４４６８和 Ｗ３４４７１所有位点在３４个苜蓿品种上都有多态性（表５，图２）。
６３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
２．５ 不同品种苜蓿的秋眠型和ＳＣｏＴ聚类分析
用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１软件对１３个引物所标记的１０３
个遗传位点进行聚类分析（图３）。３４个苜蓿品种可以
分为两大类，其中来自安徽凤阳和江苏南京的野生南
苜蓿与其他苜蓿的亲缘关系最远，在相似系数０．８５０单
独聚为一类，其余３２个品种聚为第二大类，在相似系
数０．７５７附近，第二大类又分为３个亚群。将聚类结
果与秋眠类型（表１）进行比较可以看出在第一亚群中
聚集了８个品种，包含了５个半休眠型的苜蓿品种，它
们是新疆大叶、ＦＧＣ４０１、德宝、Ｍａｇｎａ６０１和威拉，还
有一个未知休眠型的德国大叶和２个非秋眠型苜蓿品
种四季旺和超级１３Ｒ；第二亚群共聚集了２１个品种，
其中包括所有７个秋眠型苜蓿中的６个，分别是新牧
１号、Ｒａｍｐａｇｅ、金皇后、苜蓿王、寒苜１号、阿尔冈金，
以及１９个半秋眠型中有１２个也聚在此亚群中，分别
是路宝、超级阿波罗、ＦＧＣ８２０１、超人、Ａｂａｃｕｓ、胜利
者、射手、ＡＣ．Ｎｏｒｏｌｉｃａ、ＷＬ３２３、顶点、Ｑｕａｄｒｅｌａ和
ＷＬ４１４，还有３个非秋眠型的苜蓿品种Ｎｓｏ３３、特瑞、
猎人和，其中路宝和超级阿波罗相似性最高，达到０．
９００。第三亚群仅仅包括１个秋眠型的苜蓿品种驯鹿
和２个半秋眠苜蓿品种维多利亚和爱株＋Ｚ。表明
ＳＣｏＴ聚类的结果在一定程度上能够反映苜蓿的秋眠
型，但并不完全一致，同时聚类结果也表明，苜蓿间的
分子亲缘关系和地域来源也不完全一致，同一地域来
源的苜蓿品种被分别聚类到不同亚群中，说明当前育
成的苜蓿品种的亲本来源复杂，不能用单一的地域来
源来判断其亲缘关系。
表４ 犘犆犚反应体系各组分浓度下的迁移率重现平均值
犜犪犫犾犲４ 犚犲犪狆狆犲犪狉狉犪狋犲犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊
狅犳犻狀犵狉犲犱犻犲狀狋狅犳犘犆犚狊狔狊狋犲犿
ＰＣＲ反应体系的各组分
Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆ
ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ
浓度值
Ｖａｌｕｅｏｆ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
迁移率重现平均值
Ａｖｅｒａｇｅｖａｌｕｅ
ｒｅａｐｐｅａｒｒａｔｅ（％）
模板量
ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ
（ｎｇ／μＬ）
２．０ ８０．６６ｂ
２．５ ８９．５０ａ
３．０ ６５．０１ｃ
３．５ ７８．８３ｂ
Ｍｇ２＋浓度
Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
１．００ ６９．９３ｂ
１．２５ ８３．７９ａ
１．５０ ８８．８２ａ
１．７５ ７１．４７ｂ
Ｔａｑ酶用量
ＱｕａｎｔｉｔｙｏｆＴａｑ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ）
０．８０ ６７．７２ｃ
１．００ ８８．７９ａ
１．２０ ７９．１７ｂ
１．４０ ７８．３１ｂ
ｄＮＴＰｓ浓度
ｄＮＴＰｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
０．１６ ６５．２９ｃ
０．２４ ７７．７０ｂ
０．３２ ８８．７２ａ
０．４０ ８２．２９ａｂ
引物浓度
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（μｍｏｌ／Ｌ）
０．２０ ５７．２３ｃ
０．３０ ９３．１２ａ
０．４０ ８５．６２ａｂ
０．５０ ７８．０３ｂ
注：不同字母间表示犘＜０．０５差异显著。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５
ｌｅｖｅｌ．
３ 讨论
３．１ 野生南苜蓿的利用
野生或者近缘种是栽培苜蓿育种的重要遗传材料，将他们的优良等位变异导入栽培品种中在遗传育种中具
有十分重要的意义，本研究所用的２个野生南苜蓿具有返青早，早期茂盛生长，抗生物和非生物胁迫能力强，蛋白
质含量高达２６％左右的优点，但其生育期短，产量低的缺点，为二倍体苜蓿［１７］。本研究中的野生南苜蓿从ＳＣｏＴ
聚类结果看，单独分为一大类，说明目前栽培品种苜蓿遗传背景与南苜蓿有较大的差异，因此，如何将它的优良性
状导入到栽培苜蓿品种中，拓宽苜蓿种质资源的遗传基础，突破南方苜蓿育种中苜蓿耐热性差，不耐涝的瓶颈问
题。
３．２ ＳＣｏＴ标记作为苜蓿遗传标记的稳定性和可行性
本研究采用琼脂糖凝胶电泳方法，首先利用正交设计优化苜蓿ＳＣｏＴ的反应条件，得出在２０μＬ的反应体系
中含有２．５ｎｇ／μＬＤＮＡ、１．００ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋、１．２０ＵＴａｑ酶、０．４０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ和０．３０μｍｏｌ／Ｌ浓度的引物
最为稳定，重现率达到１００％；但方差分析的结果表明，Ｍｇ２＋在１．５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ酶在１．０Ｕ、ｄＮＴＰｓ浓度在
０．３２ｍｍｏｌ／Ｌ时迁移率重现率最高，这与各因素组合在一起时不一致，这可能是因为ＰＣＲ反应体系的稳定性不
但受到各因素的单独影响，同时还受到各因素间的相互作用影响，而本实验的正交设计没有考虑各因素间的相互
作用，而是利用各因素均匀分布的原理用较少的试验处理，找到最佳的反应体系。
７３１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
表５ １３条引物在３４个苜蓿品种上扩增的结果
犜犪犫犾犲５ 犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犛犆狅犜狑犻狋犺１３狆狉犻犿犲狉狊犪犿狅狀犵狋犺犻狉狋狔犳狅狌狉犪犾犳犪犾犳犪犮狌犾狋犻狏犪狉狊
引物名称
Ｎａｍｅｏｆｔｈｅｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｐｒｉｍｅｒ
位点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆａｍｐｌｉｆｉｅｄｂａｎｄｓ
多态位点数Ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ
多态位点比例Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（％）
ＡＷ２５３９５ ＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧ ８ ７ ８７．５
ＡＷ２５４０５ ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣ ５ ５ １００．０
ＡＷ２５４０６ ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＡＧ ８ ７ ８７．５
ＡＷ２５４１０ ＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＡ ４ ４ １００．０
ＡＷ２５４１６ ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＴＧ １３ １１ ８４．６
ＬＷ１６９９５ ＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡ ７ ５ ７１．４
ＬＷ１６９９７ ＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡ ８ ７ ８７．５
ＬＷ１７００１ ＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣ ９ ８ ８８．９
Ｗ３４４４１ ＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＣ ９ ８ ８８．９
Ｗ３４４６７ ＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＡＣ ７ ６ ８５．７
Ｗ３４４６８ ＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧ ７ ７ １００．０
Ｗ３４４７０ ＣＴＡＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＧＣＣＣ ７ ６ ８５．７
Ｗ３４４７１ ＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣ １１ １１ １００．０
总数Ｔｏｔａｌ １０３ ９２ ８９．３２
图２ 引物犔犠１７００１在３４份苜蓿品种上的扩增电泳图谱
犉犻犵．２ 犘狉狅犳犻犾犲狅犳犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳狆狉犻犿犲狉犔犠１７００１犻狀３４犮狌犾狋犻狏犪狉狊
图中各泳道电泳图为表１序号所对应样品的扩增产物。Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｌａｎｅｓｉｎｔｈｅｆｉｇｕｒｅａｒｅａｓｓａｍｅａｓｉｎｔａｂｌｅ１．
同时利用１３条能在３４个品种苜蓿上都能扩增的引物，共扩增出１０３个标记位点，其中９２个标记位点具有
多态性，有１１个标记位点在３４个品种同时拥有同样的等位基因。与先前ＳＲＡＰ研究比较，利用同样的３４份材
料，ＳＣｏＴ标记的标记位点多态性（８９．３％）低于ＳＲＡＰ标记的多态性（９６．６％）［１８］，并且低于毕玉芬等［１０］利用
ＲＡＰＤ分析的弱秋眠品种苜蓿的多态性（９２．０６％）。这在一定程度上表明ＳＣｏＴ标记具有较高的稳定性和重现
性，并且它扩增区域为一个基因起始到另一基因起始区域，这是一个外显子区域；而以往的研究表明，由于外显子
区域行使的功能，外界环境对其有更大的选择压力，因此具有较高的保守性［１９］，其作为遗传多样性研究具有更高
的保真性。最近开发的ＳＣｏＴ标记还没有被大规模引入各个作物的研究，但其具有较高的应用价值。并且其扩
增利用了较高的退火温度，避免了可能存在的假阳性扩增。
３．３ 不同秋眠型苜蓿间的亲缘关系
在苜蓿生产实践中，秋眠型和越冬性是引种和原始种质资源鉴定的重要依据［２０］，这是因为秋眠型与苜蓿适
应性和生产力密切相关，是苜蓿产地和品种鉴定的第一指标，是设计苜蓿种植和收获方案的重要依据［２１］。本研
究中秋眠级数为５和４的苜蓿品种路宝和超级阿波罗具有最高的相似性，本研究的结果也表明，秋眠型和苜蓿的
遗传背景有一定的相关性，可以作为生产中的一个参考指标。
８３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
图３ ３４个苜蓿品种的犛犆狅犜分析计算机聚类树状图
犉犻犵．３ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳３４犪犾犳犪犾犳犪犮狌犾狋犻狏犪狉狊犵犲狀犲狉犪狋犲犱犳狉狅犿狋犺犲犛犆狅犜犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狊
图中编号为表１序号所对应的品种。ＳｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｔｈｅｆｉｇｕｒｅｉｓａｓｓａｍｅａｓｃｕｌｔｉｖａｒｓｎｕｍｂｅｒｉｎＴａｂｌｅ１．
苜蓿是异花授粉植物，并且苜蓿品种育成过程中主要是采用集团选择法，因此，一个品种的苜蓿，其基因型并
不完全一致，在不同个体间是异质个体［１２，１５］，为保证实验结果的可靠性，本研究从每个品种苜蓿上随机选１０株
混合取样，建立的ＤＮＡ样品池，保证取样结果能够反映该苜蓿品种群体的遗传背景。
４ 结论
利用正交设计，优化出苜蓿ＳＣｏＴ－ＰＣＲ反应，在２０μＬ体系中含有２．５ｎｇ／μＬ的ＤＮＡ、１．００ｍｍｏｌ／Ｌ的
Ｍｇ２＋、１．２０Ｕ的Ｔａｑ酶、０．４０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ和０．３０μｍｏｌ／Ｌ浓度的引物最为稳定，重现率达到１００％。用
扩增效果好的１３条引物对３４个苜蓿品种进行扩增，表明来自安徽和江苏的南苜蓿单独聚为一类；其余的苜蓿品
种聚为另一类，并分为３个亚群，聚类结果与苜蓿秋眠型有一定的相关性，但并不完全一致。
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犗狆狋犻犿犻狕犪狋犻狅狀狅犳犛犆狅犜狉犲犪犮狋犻狅狀狊狔狊狋犲犿犪狀犱犵犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犳犪犾犱狅狉犿犪狀犮狔犪犾犳犪犾犳犪
ＨＥＱｉｎｇｙｕａｎ１，２，ＷＡＮＧＷｕｂｉｎ２，ＹＡＮＧＨｏｎｇｙａｎ２，ＸＩＡＮＧＳｈｉｈｕａ２，
ＺＨＯＵＬｉｙｉｎｇ１，ＷＡＮＧＳｏｎｇｈｕａ１
（１．ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｈｕｉＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｅｎｇｙａｎｇ２３３１００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｏｙｂｅａｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＳｏｙｂｅａｎ
ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍ
Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙａｄｖａｎｃｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ａｎｄ犕犲犱犻犮犪犵狅犺犻狊狆犻
犱犪．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍＳＣｏＴ－ＰＣＲ（ｓｔａｒｔｃｏｄｏｎｔａｒｇｅｔｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）ｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎａｌｆａｌｆａｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ
ｗｉｔｈｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｎｆｏｕｒｌｅｖｅｌｓｏｆｆｉｖｅｆａｃｔｏｒｓ（ＤＮＡ，ｄＮＴＰｓ，Ｍｇ２＋，Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ａｎｄ
ｐｒｉｍｅｒ）．ＡｓｕｉｔａｂｌｅＳＣｏＴｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓａ２０μＬｍｉｘｔｕｒｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ５０ｎｇＤＮＡ，１．００ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋，
１．２０ＵＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．４０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓａｎｄ０．３０μｍｏｌ／Ｌｐｒｉｍｅｒｓ．Ｏｆｔｈｅ５０ｐｒｉｍｅｒｓｓｃｒｅｅｎｅｄ，１３ｇｅｎ
ｅｒａｔｅｄｈｉｇｈｌｙｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｓｕｓｅａｂｌｅａｓＳＣｏＴｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄ３４ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｓｅ１３
ｐｒｉｍｅｒｓ．Ａｔｏｔａｌｏｆ１０３ｂａｎｄｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ９２ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅ１３ｃｈｏｓｅｎｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅ
３４ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓ．Ｔｗｏ犕．犺犻狊狆犻犱犪ｃｕｌｔｉｖａｒｓｆｒｏｍＡｎｈｕｉａｎｄＪｉａｎｇｓｕｗｅｒｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄ
ｉｎｔｏｏｎｅｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅｍａｉｎｉｎｇ３２ｃｕｌｔｉｖａｒｓｗｅｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｓｕｂｇｒｏｕｐｓｗｉｔｈａｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆ
０．７５７．Ｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙａｌｆａｌｆａｃｕｌｔｉｖａｒｓｗｅｒｅｍｏｓｔｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｓｕｂｇｒｏｕｐ．Ｓｅｍｉｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙａｎｄ
ｎｏｎｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙａｌｆａｌｆａｃｕｌｔｉｖａｒｓｄｉｄｎｏｔｃｏｎｖｅｒｇｅｉｎｔｏｔｈｅｓａｍｅｓｕｂｇｒｏｕｐｔｈｕｓｓｈｏｗｉｎｇｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ
ｂｅｔｗｅｅｎｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙａｌｆａｌｆａｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅ｓｐｐ．）；ＳＣｏＴ；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
０４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２