全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０４１７ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
王晓娟，李州，彭燕．ＮＯ参与Ｓｐｄ诱导白三叶抗氧化酶活性及其基因表达．草业学报，２０１５，２４（４）：１４０１４７．
ＷａｎｇＸＪ，ＬｉＺ，ＰｅｎｇＹ．Ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｉｎｌｅａｖｅｓｏｆｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅ
Ｓｉｎｉｃａ，２０１５，２４（４）：１４０１４７．
犖犗参与犛狆犱诱导白三叶抗氧化酶活性及其基因表达
王晓娟，李州，彭燕
（四川农业大学动物科技学院草业科学系，四川 雅安６２５０１４）
摘要：以‘拉丁诺’白三叶为试材，采用药理学实验，探讨一氧化氮（ＮＯ）信号在外源亚精胺（Ｓｐｄ）诱导抗氧化酶活性
及其基因表达中的作用。研究结果显示，２０μｍｏｌ／Ｌ的外源Ｓｐｄ可显著提高白三叶叶片硝酸还原酶（ＮＲ）和一氧化
氮合酶（ＮＯＳ）活性，诱导白三叶离体叶片ＮＯ积累，并且具有时间效应，在处理第２ｈ达到最大值；５０μｍｏｌ／ＬＮＯ
清除剂牛血红蛋白（Ｈｂ）、５ｍｍｏｌ／Ｌ硝酸还原酶（ＮＲ）抑制剂偏钒酸钠（ＮａＶＯ３）以及２００μｍｏｌ／Ｌ一氧化氮合酶
（ＮＯＳ）抑制剂 ＮＧ硝基Ｌ精氨酸甲酯盐酸盐（ＬＮＡＭＥ）处理均可不同程度地逆转Ｓｐｄ诱导的 ＮＯ含量的升高。
外源Ｓｐｄ亦可提高白三叶叶片超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）和抗坏血酸过氧化
物酶（ＡＰＸ）的活性及其基因的相对表达量，而 Ｈｂ、ＮａＶＯ３ 和ＬＮＡＭＥ不同程度地抑制了Ｓｐｄ诱导的ＳＯＤ、ＰＯＤ、
ＣＡＴ、ＡＰＸ酶活性及其基因表达。以上结果表明：Ｓｐｄ可能通过激活硝酸还原酶和一氧化氮合酶途径诱导产生
ＮＯ，且ＮＯ信号参与了Ｓｐｄ调控白三叶叶片抗氧化酶活性及其基因表达。
关键词：白三叶；一氧化氮；亚精胺；抗氧化酶；基因表达　　
犜犺犲犪狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犲狀狕狔犿犲犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊犪狀犱犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犱狌犮犲犱犫狔狊狆犲狉犿犻犱犻狀犲犻狀犾犲犪狏犲狊
狅犳狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉
ＷＡＮＧＸｉａｏＪｕａｎ，ＬＩＺｈｏｕ，ＰＥＮＧＹａｎ
犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犛犻犮犺狌犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犢犪’犪狀６２５０１４，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｉｎｔｈｅ
ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（Ｌａｄｉｎｏ）．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ
ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ（Ｓｐｄ）ａｔ２０μｍｏｌ／Ｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄ（犘＜０．０５）ｔｈｅｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＮＲ）ａｎｄ
ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ＮＯＳ）ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｌｅａｖｅｓｏｆｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒａｎｄＮＯｃｏｎｔｅｎｔｒｅａｃｈｅｄａｍａｘｉｍｕｍａｆｔｅｒ２ｈｏｆ
Ｓｐｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｔｈａｔｉｎｃｌｕｄｅｄ５０μｍｏｌ／Ｌｂｏｖｉｎｅｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（Ｈｂ）（ＮＯｓｃａｖｅｎｇｅｒ），５
ｍｍｏｌ／Ｌｐａｒｔｉａｌｓｏｄｉｕｍｖａｎａｄａｔｅ（ＮａＶＯ３）（ａＮＲｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ａｎｄ２００μｍｏｌ／ＬＮＧｎｉｔｒｏＬａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ
ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＬＮＡＭＥ）（ａＮＯＳｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＮＯｉｎＳｐｄｔｒｅａｔｅｄｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ．
ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＳｐｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｃａｎａｌｓｏｅｎｈａｎｃｅｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ），ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ），
ｃａｔａｌａｓｅ（ＣＡＴ）ａｎｄａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＡＰＸ）ａｎｄｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｌｅａｖｅｓ．Ｈｂ，ＮａＶＯ３
ａｎｄＬＮＡＭＥｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅＳｐｄｉｎｄｕｃｅｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＳＯＤ，ＰＯＤ，ＣＡＴ，ＡＰＸａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｏ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｄｅｇｒｅｅｓ．ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔＳｐｄｉｎｄｕｃｅｄＮＯｂｙｅｎｈａｎｃｉｎｇａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ，ａｎｄｔｈａｔＮＯｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｓｐｒｏｂａｂｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅＮＲａｎｄＮＯＳｐａｔｈｗａｙｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）；ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ；ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
第２４卷　第４期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年４月
Ａｐｒｉｌ，２０１５
收稿日期：２０１４０３３１；改回日期：２０１４０５０９
基金项目：国家自然科学基金（３１３７２３７１）和四川省科技厅“十二五”饲草育种攻关（２０１１ＹＺＧＧ１１）资助。
作者简介：王晓娟（１９８８），女，四川南充人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｉａｏｊ１２＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｐｅｎｇｙａｎｌｅｅ＠１６３．ｃｏｍ
多胺（ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ，ＰＡｓ）为生物体代谢过程中产生的具有较高生物活性的物质，是一类低分子量脂肪族含氮
碱。高等植物中常见的多胺主要有腐胺（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ，Ｐｕｔ）、尸胺（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ，Ｃａｄ）、精胺（ｓｐｅｒｍｉｎｅ，Ｓｐｍ）和亚精
胺（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，Ｓｐｄ）等［１］。研究表明，在逆境胁迫下，ＰＡｓ能够诱导抗氧化酶基因的表达，提高抗氧化酶活性，调
节体内活性氧（ＲＯＳ）代谢平衡，有效缓解氧化压力［２］。在番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）、黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻
狏狌狊）的研究中发现，外源Ｓｐｄ通过降低超氧阴离子（Ｏ２－）产生速率、过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）与丙二醛（ＭＤＡ）含量，提
高抗氧化酶活性以增强幼苗的抗渗透胁迫能力［３４］。ＰＡｓ诱导烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）、冰叶日中花（犕犲狊犲犿
犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿）中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）基因的表达，以提高植物抗氧化保
护［５６］。此外，ＰＡｓ还具有保护生物大分子结构和生理功能、诱导可溶性渗透调节物积累并参与逆境胁迫信号传
递等功能［２］。
一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ＮＯ）作为广泛存在于动植物和微生物中的信号分子，在植物生长、发育及逆境胁迫中
发挥重要作用。国内外众多研究表明ＮＯ在植物体内具有广泛的生理效应，ＮＯ参与植物呼吸作用、根和叶片的
生长发育、种子萌发、气孔关闭、光形态建成、细胞程序性死亡、植物组织的成熟和衰老以及植物抗逆反应等［７８］。
外源ＮＯ预处理可以提高干旱胁迫下植物叶片的保水性，降低离子渗漏率，诱导气孔关闭以及增加胚胎发育后期
丰富蛋白编码基因的转录，从而提高植物耐旱性［９］。植物体内ＮＯ的合成主要包括硝酸还原酶（ＮＲ）和一氧化氮
合酶（ＮＯＳ）途径，及其他非酶促生成途径［８］。如水分胁迫可诱导玉米（犣犲犪犿犪狔狊）叶肉细胞中ＮＯ积累，而 ＮＲ
和ＮＯＳ抑制剂均可抑制ＮＯ含量的升高［１０］；激动素（ＫＴ）和玉米素（ＺＴ）通过激活ＮＲ和 ＮＯＳ活性，促进ＮＯ
产生，从而延缓离体小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）叶片衰老过程中叶绿素和可溶性蛋白含量的降低，抑制丙二醛
（ＭＤＡ）的积累［１１］。
有关ＰＡｓ诱导ＮＯ的产生，在植物种子萌发、生长发育中已有相关报道。白旭等［１２］的研究显示，外源ＰＡｓ
尤其是Ｓｐｄ在促进莴苣（犔犪犮狋狌犮犪狊犪狋犻狏犪）种子早萌过程中可能与诱导ＮＯ的产生有关；ＰＡｓ可促进拟南芥（犃狉犪
犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）幼苗组织释放ＮＯ［１３］。我们实验室最新研究表明，外源Ｓｐｄ可以提高白三叶抗氧化酶活性，但
是其作用机理目前还不清楚。ＮＯ信号是否参与Ｓｐｄ诱导抗氧化酶活性，ＮＲ和ＮＯＳ作为植物体内合成ＮＯ的
关键酶是否参与Ｓｐｄ诱导ＮＯ信号的产生，以及Ｓｐｄ调控不同类型抗氧化酶基因的表达模式鲜有报道。本研究
以白三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）为材料，采用ＮＯ清除剂牛血红蛋白（Ｈｂ）［１１］、ＮＲ抑制剂偏钒酸钠（ＮａＶＯ３）［１４］以
及ＮＯＳ抑制剂ＮＧ硝基Ｌ精氨酸甲酯盐酸盐（ＬＮＡＭＥ）［１１］结合亚精胺（Ｓｐｄ）处理离体叶片，探讨外源Ｓｐｄ诱
导白三叶叶片ＮＯ信号产生的途径，以及诱导的ＮＯ在Ｓｐｄ激活抗氧化酶活性及其基因表达中的作用。以期为
深入理解Ｓｐｄ参与调控植物抗氧化防御的生理和分子机制奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料培养与试剂
供试材料白三叶品种为‘拉丁诺’（Ｌａｄｉｎｏ），种子购于成都绿草原种子有限公司。选择籽粒饱满大小一致的
白三叶种子，经０．１％ ＨｇＣｌ２ 消毒３ｍｉｎ，立即用蒸馏水冲洗数次，均匀撒播在预先消毒的盛有石英砂的塑料育
苗盆中，置于光照培养箱中进行培育。培养条件为：光照昼夜温度２３℃／１９℃，时长各为１２ｈ，相对湿度７０％。发
芽７ｄ后，采用Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液培养幼苗，每天更换营养液。待幼苗长至３０ｄ（２片成熟叶片）时剪取叶色一
致、嫩度相同、长势相当的白三叶叶片，于蒸馏水中浸泡１ｈ以洗脱伤害，然后进行各种处理。其中亚精胺（Ｓｐｄ）
浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ；一氧化氮清除剂牛血红蛋白（Ｈｂ），浓度为５０μｍｏｌ／Ｌ
［１１］；硝酸还原酶抑制剂偏钒酸钠（Ｎａ
ＶＯ３），浓度为５ｍｍｏｌ／Ｌ［１４］；一氧化氮合酶抑制剂 ＮＧ硝基Ｌ精氨酸甲酯盐酸盐（ＬＮＡＭＥ）浓度为２００
μｍｏｌ／Ｌ
［１１］。
１．２　试验设计
试验首先以ＣＫ（对照，蒸馏水）和２０μｍｏｌ／ＬＳｐｄ溶液分别浸泡离体叶片１，１．５，２，４，６ｈ后取样，测定样品
中ＮＯ含量的变化，筛选出ＮＯ含量测定的最佳时间点为处理的第２ｈ。在ＮＯ清除剂与ＮＯ合成酶的抑制剂效
应中，将离体叶片分别用各种抑制剂预处理２ｈ［１４］，即将叶片分别用Ｈｂ、ＮａＶＯ３ 和ＬＮＡＭＥ溶液浸泡２ｈ。
１４１第４期 王晓娟　等：ＮＯ参与Ｓｐｄ诱导白三叶抗氧化酶活性及其基因表达
为了研究Ｓｐｄ与ＮＯ清除剂和ＮＯ合成酶抑制剂对白三叶叶片ＮＯ含量以及抗氧化酶活性及其基因表达
的影响，试验设５个处理：１）ＣＫ（对照，蒸馏水）；２）Ｓｐｄ；３）Ｓｐｄ＋Ｈｂ（Ｈｂ浸泡叶片２ｈ后再转移到Ｓｐｄ溶液继续
浸泡）；４）Ｓｐｄ＋ＮａＶＯ３（ＮａＶＯ３ 浸泡叶片２ｈ后再转移到Ｓｐｄ溶液继续浸泡）；５）Ｓｐｄ＋ＬＮＡＭＥ（ＬＮＡＭＥ浸
泡叶片２ｈ后再转移到Ｓｐｄ溶液继续浸泡）；分别在处理后第２ｈ测定ＮＯ含量及抗氧化酶基因表达，在处理后
第８ｈ测定抗氧化酶活性。因植物细胞中ＮＯ合成的酶促途径主要包括ＮＲ和ＮＯＳ两条途径，所以在探讨Ｓｐｄ
诱导ＮＯ合成的途径时，试验分为两个部分。研究ＮＲ是否参与Ｓｐｄ诱导ＮＯ合成设４个处理：１）ＣＫ（对照）；２）
ＮａＶＯ３；３）Ｓｐｄ；４）Ｓｐｄ＋ＮａＶＯ３（材料处理方法同上）；处理２ｈ测定硝酸还原酶活性。研究ＮＯＳ是否参与Ｓｐｄ
诱导ＮＯ合成设４个处理，１）ＣＫ（对照）；２）ＬＮＡＭＥ；３）Ｓｐｄ；４）Ｓｐｄ＋ＬＮＡＭＥ（材料处理方法同上）；处理２ｈ测
定一氧化氮合酶活性。上述处理均设４个重复，置于温度２３℃，全光照的恒温培养箱条件下进行。
１．３　生理指标测定
ＮＯ含量和ＮＯＳ活性均采用试剂盒测定［１５］，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。取０．１ｇ处理过的叶片
加０．９ｍＬ０．９％ＮａＣｌ匀浆：１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清沸水浴３ｍｉｎ；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清用
于ＮＯ含量检测。在５５０ｎｍ波长下测定吸光度值，考马斯亮兰法测定蛋白质含量，计算每克蛋白含ＮＯ的量。
取０．１ｇ处理过的叶片加０．９ｍＬ０．９％ ＮａＣｌ（含０．５ｍｍｏｌ／Ｌ 二硫苏糖醇ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／Ｌ苯甲基磺酰氟
ＰＭＳＦ）匀浆；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清为ＮＯＳ提取液。按照试剂盒说明考马斯亮兰法测定蛋白质含量，
在５３０ｎｍ波长下测定吸光度值，酶活性定义：每毫克组织蛋白每分钟生成１ｎｍｏｌＮＯ为１个活性单位。
ＮＲ活性采用试剂盒测定并有所改进［１６］，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。取０．１ｇ处理过的叶片加
０．９ｍＬ匀浆介质：４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液待测。空白管，标准管以及测定管按照试剂盒说明的步骤
加样，对照管稍加改进：０．２ｍＬ上清液加入１ｍＬ双蒸水３７℃避光水浴准确反应３０ｍｉｎ，然后加１ｍＬ显色剂，
混匀，蒸馏水调０，在５４０ｎｍ、１ｃｍ光径比色测定吸光度值。考马斯亮兰法测定蛋白质含量。酶活性定义：每毫
克组织蛋白在３７℃的条件下每分钟还原１μｍｏｌ硝酸盐为亚硝酸盐为１个酶活性单位。
粗酶液的提取：取０．１ｇ处理过的叶片，加０．９ｍＬ１５０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ值为７的磷酸缓冲液匀浆：４℃下１５０００
ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，上清液即为粗酶提取液。超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性采用核黄素
ＮＢＴ法测定［１７］。过氧化物酶（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ）和过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）参照Ｃｈａｎｃｅ和 Ｍａｅｈｌｙ［１８］的方法
并略有修改。ＰＯＤ活性测定：反应体系中加入０．９２５ｍＬ的 ＨＡｃＮａＡｃ（乙酸醋酸）缓冲液，再加入０．５ｍＬ的
愈创木酚和２５μＬ的粗酶液，混匀后加入５０μＬ的Ｈ２Ｏ２ 启动反应，在４６０ｎｍ处测定吸光值，每１０ｓ记录１次吸
光值，共记录８次。ＣＡＴ活性测定：反应体系中加入０．９５ｍＬ的ＰＢＳ，再加入０．５ｍＬ的Ｈ２Ｏ２（混匀），最后加入
０．０５ｍＬ的粗酶液，充分混匀后在２４０ｎｍ处测定吸光值，每１０ｓ记录１次吸光值，共记录８次。抗坏血酸过氧
化物酶（ａｓｃｏｒｂａｔｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＡＰＸ）活性参照Ｎａｋａｎｏ和Ａｓａｄａ［１９］的方法进行测定。可溶性蛋白含量采用考马
斯亮蓝法测定［２０］。
１．４　荧光实时定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析
采用ｑＲＴ－ＰＣＲ的方法分析白三叶叶片中的抗
氧化酶的转录水平。白三叶叶片总ＲＮＡ提取参照捷
倍斯公司试剂盒（ＰｌａｎｔＲＮＡＫｉｔ）说明书，提取的总
ＲＮＡ参照美国ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司反转录试剂
盒（ｉＳｃｒｉｐｔＴＭｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ）说明书进行反转录
获得ｃＤＮＡ第一链。以白三叶肌动蛋白基因（βＡｃ
ｔｉｎ）为内参，根据白三叶ＰＯＤ基因，ＧｅｎＢａｎｋ中已知
的红三叶（犜．狆狉犪狋犲狀狊犲）ＳＯＤ基因、蚕豆（犞犻犮犻犪犳犪犫犪）
ＣＡＴ基因和蒺藜苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）ＡＰＸ基
因序列设计引物，引物设计如表１。以获得的ｃＤＮＡ
第 一链为模板进行ｑＲＴ－ＰＣＲ扩增。ｑＲＴ－ＰＣＲ在
表１　试验中所用到的引物
犜犪犫犾犲１　犃犾狆狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋
基因 Ｇｅｎｅ 引物序列（５′３′）Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
超氧化物歧化酶
犆狌／犣狀ＳＯＤ
ＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＣ
ＴＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＴ
过氧化氢酶ＣＡＴ ＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＣＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＧ
ＧＡＡＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴ
过氧化物酶ＰＯＤ ＴＣＴＡＧＧＧＣＡＡＣＧＧＴＴＡＡＴＴＣＡＴＴＣ
ＧＧＴＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧ
抗坏血酸过氧化物
酶ＡＰＸ
ＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣ
ＧＧＣＡＡＡＣＣＴＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＣＡＣＧＡ
内参βＡｃｔｉｎ ＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＧＣＧＴＧＴＴＧ
ＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧ
２４１ 草　业　学　报 第２４卷
ＢｉｏＲａｄ公司的ｉＱＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒ实时定量ＰＣＲ检测系统中进行。βＡｃｔｉｎ、犆狌／犣狀ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＰＯＤ基因反应程
序为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５７℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ。ＡＰＸ基因反应程序为：９４℃３ｍｉｎ；
９４℃３０ｓ，６２．５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ。
１．５　统计分析
采用Ｅｘｃｅｌ２００３进行绘图与数据处理；ＳＡＳ８．０软件进行方差分析和显著性检验（犘＜０．０５）。基因表达分
析均以对照为参照进行相对表达比较。
２　结果与分析
图１　亚精胺处理对白三叶叶片犖犗含量的影响
犉犻犵．１　犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊狆犲狉犿犻犱犻狀犲狅狀犖犗
犮狅狀狋犲狀狋犻狀狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犾犲犪狏犲狊
　　　图中不同字母表示不同时间点不同处理差异显著（犘＜０．０５）。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｌｅｔｔｅｒｓｓｈｏｗｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔｔｈｅ０．０５ｌｅｖｅｌａｍｏｎｇｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔ．
图２　不同处理对白三叶叶片犖犗含量的影响
犉犻犵．２　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋狉犲犪狋犿犲狀狋狊狅狀犖犗
犮狅狀狋犲狀狋犻狀狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犾犲犪狏犲狊
　　　不同字母表示差异显著（犘＜０．０５）。下同。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ犘＜０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．１　外源Ｓｐｄ诱导ＮＯ产生变化动态
如图１所示，在一定时间范围内，以蒸馏水浸泡
（ＣＫ）的白三叶叶片中 ＮＯ含量均无显著变化，而
２０μｍｏｌ／ＬＳｐｄ处理的白三叶叶片ＮＯ含量呈先增
加后减少的趋势，且在处理后第２ｈ达到最大值。
在不同时间点Ｓｐｄ处理的白三叶叶片 ＮＯ含量均
高于对照，大部分达到显著，表明Ｓｐｄ能够诱导叶
片ＮＯ合成。据此，在探讨ＮＯ的产生途径时，以处
理后２ｈ为ＮＯ含量测试时间点。
２．２　ＮＯ清除剂及 ＮＲ、ＮＯＳ抑制剂对Ｓｐｄ诱导
ＮＯ含量的影响
为了进一步探讨Ｓｐｄ诱导ＮＯ产生的途径，观
测了ＮＯ清除剂及合成抑制剂对ＮＯ含量的影响。
与ＣＫ比较，Ｓｐｄ处理明显提高了白三叶叶片内源
ＮＯ含量，ＮＯ清除剂 Ｈｂ处理，ＮＯ含量则降低了
６０．６４％。同样，ＮＲ抑制剂ＮａＶＯ３ 和ＮＯＳ抑制剂
ＬＮＡＭＥ处理，ＮＯ含量亦显著降低。由此可见，
Ｈｂ、ＮａＶＯ３ 和ＬＮＡＭＥ可显著抑制Ｓｐｄ引起的白
三叶叶片ＮＯ的产生，推测 ＮＲ和 ＮＯＳ均参与了
Ｓｐｄ诱导ＮＯ的合成（图２）。
２．３　Ｓｐｄ对硝酸还原酶活性的影响
由图３可看出，ＮＲ抑制剂ＮａＶＯ３ 处理使ＮＲ
活性比对照降低３１．３８％，证明ＮａＶＯ３ 可抑制叶片
ＮＲ活性。与ＣＫ相比Ｓｐｄ处理使白三叶叶片 ＮＲ
活性提高了２３．９５％，达到显著水平，表明Ｓｐｄ能够
有效激活ＮＲ活性。Ｓｐｄ＋ＮａＶＯ３ 处理ＮＲ活性较
ＮａＶＯ３ 单独处理有所提高，表明ＮａＶＯ３ 可抑制叶
片ＮＲ活性而Ｓｐｄ能够部分恢复ＮＲ活性。
２．４　Ｓｐｄ对一氧化氮合酶活性的影响
由图４可看出，ＮＯＳ抑制剂ＬＮＡＭＥ处理使ＮＯＳ活性比对照降低了５３．８７％，证明ＬＮＡＭＥ可抑制叶片
ＮＯＳ活性。Ｓｐｄ处理的白三叶叶片 ＮＯＳ活性比ＣＫ提高了２７．０７％，达到显著水平，表明Ｓｐｄ亦能有效激活
ＮＯＳ活性。Ｓｐｄ＋ＬＮＡＭＥ处理较单独ＬＮＡＭＥ处理显著提高，表明ＬＮＡＭＥ可抑制叶片ＮＯＳ活性而Ｓｐｄ
能够完全恢复ＮＯＳ活性。
３４１第４期 王晓娟　等：ＮＯ参与Ｓｐｄ诱导白三叶抗氧化酶活性及其基因表达
图３　犛狆犱和犖犪犞犗３ 对白三叶叶片硝酸还原酶活性的影响
犉犻犵．３　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犛狆犱犪狀犱犖犪犞犗３狅狀犖犚
犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犾犲犪狏犲狊　
图４　犛狆犱和犔犖犃犕犈对离体白三叶叶片一氧化氮合酶活性的影响　
犉犻犵．４　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犛狆犱犪狀犱犔犖犃犕犈狅狀犖犗犛
犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犾犲犪狏犲狊　
２．５　ＮＯ产生抑制剂对Ｓｐｄ诱导抗氧化酶活性的影响
外源Ｓｐｄ诱导白三叶叶片抗氧化酶活性如图５所示。外源Ｓｐｄ处理的白三叶叶片的ＳＯＤ（图５Ａ）、ＣＡＴ（图
５Ｃ）、ＡＰＸ（图５Ｄ）３种抗氧化酶活性显著高于ＣＫ，提高幅度分别为３６．６６％，４９．６３％和２４．２１％，而 Ｈｂ、ＮａＶＯ３
和ＬＮＡＭＥ可显著抑制Ｓｐｄ引起的３种抗氧化酶活性的增加。与ＣＫ相比，Ｓｐｄ亦明显提高了ＰＯＤ活性（图
５Ｂ），但未达显著水平，同样Ｈｂ、ＮａＶＯ３ 和ＬＮＡＭＥ使ＰＯＤ活性恢复到ＣＫ水平。以上表明，Ｓｐｄ提高白三叶
叶片抗氧化酶活性需要ＮＯ的参与。
图５　不同处理对离体白三叶叶片抗氧化酶活性的影响
犉犻犵．５　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋狉犲犪狋犿犲狀狋狊狅狀犪狀狋犻狅狓犻犱犪狋犻狏犲犲狀狕狔犿犲犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊狅犳狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犾犲犪狏犲狊
　
２．６　ＮＯ产生抑制剂对Ｓｐｄ调控抗氧化酶基因相对表达量的影响
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析结果表明，Ｓｐｄ处理使白三叶叶片犆狌／犣狀ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡＴ和ＡＰＸ四种抗氧化酶基因的相
对表达量比ＣＫ分别上调了６２．５６％，６０．６２％，８５．１９％和８０．３５％，均达到显著水平。而 Ｈｂ、ＮａＶＯ３ 和Ｌ
ＮＡＭＥ皆明显下调了由Ｓｐｄ引起的犆狌／犣狀ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡＴ和ＡＰＸ四种抗氧化酶基因的相对表达量（图６）。
由此可以推测，ＮＯ参与了Ｓｐｄ调控白三叶叶片抗氧化酶基因的表达。
４４１ 草　业　学　报 第２４卷
图６　不同处理对白三叶叶片抗氧化酶基因相对表达量的影响
犉犻犵．６　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋狉犲犪狋犿犲狀狋狊狅狀犪狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犲狀狕狔犿犲犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犾犲犪狏犲狊
　
３　讨论
３．１　Ｓｐｄ诱导ＮＯ的产生与ＮＲ和ＮＯＳ途径密切相关
２００６年Ｔｕｎ等［１３］首次报道了ＰＡｓ在拟南介幼苗中诱导合成 ＮＯ，同时通过巴西松（犃狉犪狌犮犪狉犻犪犪狀犵狌狊狋犻犳狅
犾犻犪）的悬浮培养，发现ＰＡｓ中的Ｐｕｔ能够诱导胚细胞产生ＮＯ［２１］，ＰＡｓ预处理亦可诱导干旱胁迫下黄瓜幼苗产生
ＮＯ［２２］。本试验的结果显示，外源Ｓｐｄ能够诱导白三叶离体叶片ＮＯ产量升高，并且具有时间效应，在第２ｈ达
到最大值，而 Ｈｂ、ＮａＶＯ３ 和ＬＮＡＭＥ明显阻止由Ｓｐｄ诱导的ＮＯ含量的升高，可以推测ＮＲ和ＮＯＳ途径均参
与了ＮＯ的产生。同时，外源Ｓｐｄ处理的白三叶叶片，其ＮＯＳ和ＮＲ活性显著增强，而ＮａＶＯ３ 和ＬＮＡＭＥ具
有显著的抑制作用，表明外源Ｓｐｄ可能通过激活ＮＲ和ＮＯＳ代谢，进而促成ＮＯ的大量产生，而Ｓｐｄ能否诱导
ＮＲ和ＮＯＳ基因表达，有关深入机制有待进一步研究。
３．２　Ｓｐｄ能有效调控抗氧化酶活性及基因表达
植物在遭受非生物胁迫的过程中ＲＯＳ积累增多，清除自由基的相关酶活性降低，使植物体内ＲＯＳ代谢平衡
被破坏［２３］。Ｓｐｄ提高逆境胁迫下抗氧化酶活性，有效清除活性氧，从而减轻氧化压力已有较多报道。外源Ｓｐｄ
通过提高大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）幼苗抗氧化酶活性以延缓大豆叶片叶绿素、蛋白质的降解速度［２４］，ＰＡｓ通过介导抗
氧化系统降低超氧阴离子（Ｏ２－）产生速率，从而增强水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）植株耐盐性［２５］。盐胁迫下，外源Ｓｐｄ和
Ｓｐｍ通过上调粗齿冷水花（犝犾狏犪犳犪狊犮犻犪狋犪）中犉犲ＳＯＤ基因表达，以提高抗氧化保护［２６］，我们已有研究表明，外源
Ｓｐｄ能够提高干旱胁迫下白三叶抗氧化酶活性，延缓Ｏ２－、Ｈ２Ｏ２ 积累，减轻膜脂过氧化（论文发表中）。在本试
验中，外源Ｓｐｄ亦可以提高正常条件下白三叶叶片抗氧化酶活性，并且上调相应抗氧化酶基因的表达，从而进一
步探索了Ｓｐｄ在抗氧化保护中可能存在的分子机制。
３．３　ＮＯ信号参与Ｓｐｄ调控抗氧化酶活性及基因表达
在本研究中，Ｈｂ、ＮａＶＯ３ 和ＬＮＡＭＥ除显著抑制Ｓｐｄ诱导白三叶ＮＯ产生外，同时也明显降低由Ｓｐｄ提高
的抗氧化酶活性，并下调相应抗氧酶基因的表达。结合其他相关报道，外源ＮＯ能够显著诱导盐胁迫下紫花苜蓿
（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）叶片ＳＯＤ、ＰＯＤ和ＣＡＴ活性提高［２７］，内源ＮＯ亦能影响ＣＡＴ和ＳＯＤ基因的转录水平［２８］，
我们可以推测，ＮＯ参与了Ｓｐｄ调控白三叶抗氧化酶活性及相关基因的表达。
综上所述，外源Ｓｐｄ可以提高正常水分条件下白三叶离体叶片抗氧化酶活性及其基因表达，提高白三叶叶
５４１第４期 王晓娟　等：ＮＯ参与Ｓｐｄ诱导白三叶抗氧化酶活性及其基因表达
片ＮＲ和ＮＯＳ活性，诱导ＮＯ信号产生。所以推测外源Ｓｐｄ通过激活ＮＲ和ＮＯＳ途径诱导产生ＮＯ，且ＮＯ信
号参与了Ｓｐｄ调控白三叶叶片抗氧化酶活性及其基因表达。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＬｉＣＸ，ＬｉｕＬＦ，ＹｉＹＪ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｐｅｒｍｄｉｎｅｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆｗｈｅａｔ（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狀犿Ｌ）ｓｅｅｄｌｉｎｇｓｕｎｄｅｒＮａＣｌｓｔｒｅｓｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１１，３９（４）：１９７８１９７９，１９９９．
［２］　ＭａｒｔｉｎＴａｎｇｕｙＪ．Ｍｅｔａｂｌｉｓｍａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙａｍｉｎｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ：ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）．ＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２００１，
３４（１）：１３５１４８．
［３］　ＺｈａｎｇＣＭ，ＺｈｏｕＺＲ，ＺｈａｎｇＺＸ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｐｅｒｍｄｉｎｅｏｎｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｌｅｖｅｌｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍｏｆｔｏｍａｔｏｓｅｅｄｌｉｎｇ
ｕｎｄｅｒｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｓｔｒｅｓｓ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，２００９，１５（３）：３０１３０７．
［４］　ＤｕａｎＪＪ，ＧｕｏＳＲ，ＫａｎｇＹＹ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｐｅｒｍｄｉｎｅｏｎｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｌｅｖｅｌｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｓｅｅｄｌｉｎｇｓｕｎｄｅｒ
ｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２００６，３３（３）：６３９６４１．
［５］　ＨｉｒａｇａＳ，ＩｔｏＨ，ＹａｍａｋａｗａＨ，犲狋犪犾．ＡｎＨＲｉｎｄｕｃｅｄｔｏｂａｃｃｏｐｅｒｏｘｉｄｅａｓｅｇｅｎｅｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｏｓｐｅｒｍｉｎｅ，ｂｕｔｎｏｔｔｏＳａｌｉｃｙｌａｔｅ，ｍｅｔｈｙｌｊａｓ
ｍｏｎａｔｅａｎｄｅｔｈａｐｈｏｎ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２０００，１３（２）：２１０２１６．
［６］　ＡｒｏｎｏｖａＥＥ，ＳｈｅｖｙａｋｏｖａＮＩ，ＳｒｅｔｓｅｎｋｏＬＡ，犲狋犪犾．Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲
犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿Ｌ．．ＤｏｋｌａｄｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００５，４０３（１）：２５７２５９．
［７］　ＬｉｕＪＸ，ＷａｎｇＪＣ，ＷａｎｇＲＪ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｎｄｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｒｙｅｇｒａｓｓｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
ｕｎｄｅｒｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（１）：２１０２１６．
［８］　ＷａｎｇＦ，ＣｈａｎｇＰＰ，ＣｈｅｎＹＰ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｓｅｅｄｌｉｎｇｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
ｕｎｄｅｒｃａｄｍｉｕｍｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（２）：１７８１８６．
［９］　ＭａｔａＣＧ，ＬａｍａｔｔｉｎａＬ．Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｉｎｄｕｃｅｓｓｔｏｍａｔａｌｃｌｏｓｕｒｅａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅａｄａｐｔｉｖｅｐｌａｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｇａｉｎｓｔｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏ
ｇｙ，２００１，１２６（３）：１１９６１２０４．
［１０］　ＬｉｕＪＸ，ＨｕＨＢ，ＷａｎｇＸ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｐｒｏｌｉｎｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｒｙｅｇｒａｓｓｓｅｅｄｌｉｎｇｓｓｕｂｊｉｅｃｔｅｄｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＡｇｒｅｓｔｉａ
Ｓｉｎｉｃａ，２００９，１８（６）：７８６７９０．
［１１］　ＺｈａｎｇＦＹ，ＨｅＪＭ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＮＲａｎｄＮＯＳｉｎｔｈｅｃｙｔｏｋｉｎｉｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｗｈｅａｔｌｅａｖｅｓ．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＢｏｒｅａｌｉＯｃｃｉｄｅｎｔａ
ｌｉａＳｉｎｉｃａ，２００９，２９（３）：０５０６０５１１．
［１２］　ＢａｉＸ，ＳｕＧＸ，ＳｕｎＮ，犲狋犪犾．Ｒｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｅｘｏｇｅｎｏｕｓｐｏｌｙａｍｉｎｅｓａｎｄｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｄｕｃｅｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｌｅｔｔｕｃｅｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．
ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＢｏｒｅｓａｌｉＯｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａＳｉｎｉｃａ，２００９，２９（９）：１８６０１８６６．
［１３］　ＴｕｎＮＮ，ＳａｎｔａＣＣ，ＢｅｇｕｍＴ，犲狋犪犾．Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓｉｎｄｕｃｅｒａｐｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，４７（３）：３４６３５４．
［１４］　ＳｈａｏｙｕｎＬ，ＷｅｉＳ，ＨａｉｈａｎｇＬ，犲狋犪犾．ＡｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｉｍｐｒｏｖｅｓｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｒｉｐｌｏｉｄｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓａｎｄｉｎｖｏｌｖｅｓＨ２Ｏ２ａｎｄＮＯｉｎｄｕｃｅｄ
ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，４７（２）：１３２１３８．
［１５］　ＬｉｕＧＨ，ＬｉｕＱ，ＨｏｕＬＸ．ＮＯｍａｙｆｏｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｄｏｗｎｓｒｅａｍｏｆＣａ２＋ｉｎｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｄｕｃｅｄｓｔｏｍａｔａｌｃｌｏｓｕｒｅｉｎ犞犻犮犻犪犳犪犫犪Ｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｅｌＢｉｏｌｏｇｙ，２００９，４２（２）：１４５１４７．
［１６］　ＺｈａｎｇＪ，ＣｈｅｎＣＹ，ＷｅｉＣＢ．Ｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｒｅｄｂｅａｎｌｅａｖｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉａｎｇｈａｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ），２０１２，４０（１）：８６８８．
［１７］　ＧｉａｎｎｏｐｏｌｉｔｉｅｓＣＮ，ＲｉｅｓＳＫ．Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ：Ｉ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９７７，５９（２）：３０９３１４．
［１８］　ＣｈａｎｃｅＢ，ＭａｅｈｌｙＡＣ．Ａｓｓａｙｏｆｃａｔａｌａｓｅａｎｄｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９５５，１３６（２）：７６４７７５．
［１９］　ＮａｋａｎｏＹ，ＡｓａｄａＫ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｉｓｓｃａｖｅｎｇｅｄｂｙａｓｃｏｒｂａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｉｎｓｐｉｎａｃｈｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９８１，
２２（５）：８６７８８０．
［２０］　ＧａｏＪＦ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｍ］．Ｘｉ’ａｎ：ＴｈｅＷｏｒｌｄＢｏｏｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，２０００．
［２１］　ＳｉｌｖｅｉｒａＶ，ＳａｎｔａＣＣ，ＴｕｎＮＮ，犲狋犪犾．Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｐｏｌｙａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｓ，ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｒｅｌｅａｓｅ，ｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆ犃狉犪狌犮犪狉犻犪犪狀犵狌狊狋犻犳狅犾犻犪（Ｂｅｒｔ．）Ｏ．Ｋｔｚｅ．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００６，１７１（１）：９１９８．
［２２］　ＡｒａｓｉｍｏｗｉｃｚＪＭ，ＦｌｏｒｙｓｚａｋＷＪ，ＫｕｂｉＪ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｏｌｙａｍｉｎｅａｎｄｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎａｄａｐｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｄｒｏｕｇｈｔｉｎｃｕ
ｃｕｍｂｅｒ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２００９，２８（２）：１７７１８６．
［２３］　ＭｕｓｔａｐｈａＥ，ＡｈｍａｄｏｕＭＶ，ＨａｈｉｂＫ．Ｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌｅａｆｃｅｌｓｏｆｔｗｏｏｌｉｖｅｃｕｌｔｉｖａｒｓｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｓｅｖｅｒｅｗａｔｅｒ
ｄｅｆｉｃｉｔ．ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅＰｌａｎｔａｒｕｍ，２００９，３１（４）：７１１７２１．
［２４］　ＢｏＳＨ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｐｅｒｍｄｉｎｅｏｎｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｄｅｔａｃｈｅｄｓｏｙｂｅａｎｌｅａｖｅｓ．ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｅｔｉｎ，２００８，２４（６）：２４３２４６．
［２５］　ＷａｎｇＹ，ＬｉｕＱ，ＨｕａＣ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｐｅｒｍｄｉｎｅｏｎａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｒｏｏｔｓｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ．Ａｃｔａ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＢｏｒｅａｌｉｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓＳｉｎｉｃａ，２００９，１８（６）：１６１１６５．
［２６］　ＳｕｎｇＭＳ，ＣｈｏｗＴＪ，ＬｅｅＴＭ．Ｐｏｌｙａｍｉｎｅａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎａｌｅｖｉａｔｅｓｈｙｐｅｒｓａｌｉｎｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎａｍａｒｉｎｅｇｒｅｅｎｍａｃｒｏａｌｇａ，犝犾狏犪犳犪狊
犮犻犪狋犪，ｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，２０１１，４７（３）：５３８５４７．
［２７］　ＸｕＹ，ＷｅｉＸＨ，ＬｉＢＢ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｓｅｅｄｌｉｎｇｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｎ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｕｎｄｅｒ
ＮａＣｌｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（５）：１４５１５３．
［２８］　ＢｅｌｉｇｎｉＭＶ，ＦａｔｈＡ，ＰａｕｌＣＢ，犲狋犪犾．Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅａｃｔｓａｓａｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｎｄｄｅｌａｙｓｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｄｅａｔｈｉｎｂａｒｌｅｙａｌｅｕｒｏｎｅｌａｙｅｒｓ．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００２，１２９（４）：１６４２１６５０．
６４１ 草　业　学　报 第２４卷
参考文献：
［１］　李翠香，刘利芬，伊艳杰，等．外源亚精胺对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响．安徽农业科学，２０１１，３９（４）：１９７８１９７９，１９９９．
［３］　张春梅，邹志荣，张志新，等．外源亚精胺对模拟干旱胁迫下番茄幼苗活性氧水平和抗氧化系统的影响．应用与环境生物学报，２００９，１５（３）：
３０１３０７．
［４］　段九菊，郭世荣，康云艳．外源亚精胺对盐胁迫下黄瓜幼苗活性氧水平和抗氧化酶活性的影响．园艺学报，２００６，３３（３）：６３９６４１．
［７］　刘建新，王金成，王瑞娟，等．外源一氧化氮对渗透胁迫下黑麦草幼苗光合和生物发光特性的影响．草业学报，２０１３，２２（１）：２１０２１６．
［８］　王芳，常盼盼，陈永平，等．外源ＮＯ对镉胁迫下玉米幼苗生长和生理特性的影响．草业学报，２０１３，２２（２）：１７８１８６．
［１０］　刘建新，胡浩斌，王鑫，等．一氧化氮参与盐胁迫下黑麦草幼苗脯氨酸积累的调控．草地学报，２００９，１８（６）：７８６７９０．
［１１］　张凤云，贺军民．ＮＲ和ＮＯＳ在ＣＴＫ延缓离体小麦叶片衰老中的作用．西北植物学报，２００９，２９（３）：０５０６０５１１．
［１２］　白旭，苏国兴，孙娜，等．外源多胺对莴苣种子萌发诱导及其与一氧化氮的关系．西北植物学报，２００９，２９（９）：１８６０１８６６．
［１５］　刘国华，刘菁，侯丽霞．ＮＯ可能作为Ｃａ２＋的下游信号介导乙烯诱导的蚕豆气孔关闭串．分子细胞生物学，２００９，４２（２）：１４５１４７．
［１６］　张静，陈禅友，魏传斌．红小豆叶片硝酸还原酶测定法的改进．江汉大学学报（自然科学版），２０１２，４０（１）：８６８８．
［２０］　高俊凤．植物生理学实验技术［Ｍ］．西安：世界图书出版公司，２０００．
［２４］　柏素花．外源亚精胺对大豆离体叶片衰老的影响．中国农学通报，２００８，２４（６）：２４３２４６．
［２５］　王燕，刘青，华春，等．外源亚精胺对盐胁迫下水稻根系抗氧化酶活性的影响．西北农业学报，２００９，１８（６）：１６１１６５．
［２７］　徐严，魏小红，李兵兵，等．外源ＮＯ对ＮａＣＬ胁迫下紫花苜蓿种子萌发及幼苗氧化损伤的影响．草业学报，２０１３，２２（５）：１４５１５３．
７４１第４期 王晓娟　等：ＮＯ参与Ｓｐｄ诱导白三叶抗氧化酶活性及其基因表达