全 文 ：书转犅犃犇犎基因苜蓿犜１代遗传
稳定性和抗盐性研究
燕丽萍１，夏阳１，梁慧敏２，王珍珍１，李双云１，刘翠兰１，庞彩红１
（１．山东省林业科学研究院，山东 济南２５００１４；２．江苏农林职业技术学院，江苏 句容２１２４００）
摘要：采用分子生物学检测和不同浓度的ＮａＣｌ对转犅犃犇犎 基因苜蓿Ｔ１代２个株系进行遗传稳定性和抗盐性研
究。结果表明，２个株系的Ｔ１代ＰＣＲ阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律；在０．８％ＮａＣｌ胁迫
下，转基因植株Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交表达量明显增加，ＢＡＤＨ酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加２～４和４～５倍；
不同浓度ＮａＣｌ胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株，而电导率和丙二醛
含量显著低于对照植株。表明转入的犅犃犇犎 基因可以稳定遗传，转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。
关键词：苜蓿；犅犃犇犎 基因；盐胁迫
中图分类号：Ｑ９４５．７；Ｓ５５１＋．７０３．４　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０６００６５０７
　 盐碱地是人类面临的世界性问题，全球约有１００多个国家存在不同类型盐碱地，占陆地面积的１０％左右。
我国是盐碱地面积较大的国家之一，有各类盐碱地约３４６０万ｈｍ２，其中盐渍化耕地６００万ｈｍ２［１，２］。苜蓿
（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）素有“牧草之王”的美称，是世界上最重要的豆科牧草之一，因其高营养价值和高产等特性明
显优于其他草类［１］，在世界上栽培面积最广、应用最广泛，它不但具有抗旱、抗寒、高产、优质、营养丰富等特点，还
具有改良土壤结构、理化性质、保持水土和保护环境等作用。但现有的苜蓿品种无论国内培育还是国外引进的，
抗旱、耐盐能力仍然有限，限制了在干旱和盐碱土壤的种植，因此，对苜蓿抗盐性的研究与改良非常重要。提高苜
蓿抗盐能力的方法主要是培育抗盐品种，而基因工程技术是快速实现这一目的有力工具。
甜菜碱（ｂｅｔａｉｎｅ）是一类季铵化合物，能够调节胞内渗透压，保护胞内酶活性，稳定细胞膜结构等，被认为是
许多植物细胞代谢相容的最好渗透保护物质之一，在高等植物中，甜菜碱的合成是经过胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱
两步不可逆的氧化反应催化完成的，甜菜碱醛脱氢酶（ＢＡＤＨ）是合成甜菜碱的关键酶，在干旱和盐胁迫下该酶活
力显著提高，从而大大增加甜菜碱的积累［３，４］。２００５年梁慧敏等［５］利用农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）介
导法将犅犃犇犎 基因导入紫花苜蓿中苜１号中，经转基因植株的分子生物学检测说明外源基因已嵌入苜蓿染色
体并得到表达。本试验以受体亲本中苜１号为对照，对转犅犃犇犎 基因苜蓿自交株系子一代（Ｔ１）试管苗进行了
遗传稳定性和抗盐性研究，旨在探讨转犅犃犇犎 基因苜蓿耐盐性的生理基础，为耐盐株系的筛选提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　材料
转犅犃犇犎 基因紫花苜蓿Ｔ１代自交株系Ｔ１８、Ｔ１１２及其受体亲本“中苜１号”（对照植株）无菌试管苗均由
山东省林业科学研究院省重点改良实验室保存，每２５ｄ在 ＭＳ盐分＋Ｂ５ 有机培养基上继代繁殖１次。
１．２　方法
１．２．１　植物基因组ＤＮＡ提取和ＰＣＲ扩增　植物基因组ＤＮＡ的提取（ＣＴＡＢ法）和ＰＣＲ检测参照王关林和方
宏筠［６］的方法。山菠菜（犃狋狉犻狆犾犲狓犺狅狉狋犲狀狊犻狊）犅犃犇犎 基因ＰＣＲ扩增所用引物：Ｐ１：５′ＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＴＣＣＣＡ
ＡＴＴＣＣＴＧＣＴＣ３′和Ｐ２：５′ＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡ３′；ＰＣＲ反应总体积２５μＬ，１０×反应缓
冲液２．５μＬ，脱氧核苷酸混合物（ｄＮＴＰ）２μＬ，Ｐ１（５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，Ｐ２（５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，模板ＤＮＡ２μＬ，Ｔａｑ
第１８卷　第６期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
６５－７１
２００９年１２月
 收稿日期：２００９０２０５；改回日期：２００９０４０３
基金项目：山东省良种工程项目（２００６ｌｚ１２０２）资助。
作者简介：燕丽萍（１９８０），女，甘肃定西人，工程师，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｙｌｐ＿９８２＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｘｉａｙａｎｇ０５０６＠１２６．ｃｏｍ
ＤＮＡ聚合酶０．２５μＬ；ＰＣＲ反应程序：９５℃预变性１０ｍｉｎ，９３．５℃变性１ｍｉｎ，５５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１．５
ｍｉｎ，循环３０次，７２℃延伸１０ｍｉｎ。１．０％的琼脂糖凝胶电泳，ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ全自动凝胶成像分析系统观察结果并
照相。
１．２．２　材料处理　２００８年４月，在 ＭＳ盐分＋Ｂ５ 有机培养基中分别添加０，０．４％，０．８％和１．２％４个浓度的
ＮａＣｌ，将ＰＣＲ检测阳性的转基因株系和对照植株茎段接入上述培养基上，每茎段各带有３或４片叶，每处理重复
５次（瓶），每重复（瓶）４株，培养温度为（２５±２）℃，光强３０００ｌｘ，光周期１２ｈ。
１．２．３　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交　按文献［７］的方法，分别取约２０μｇ苜蓿叶片的总ＲＮＡ，经甲醛变性凝胶电泳，转至Ｓｉｇ
ｍａ公司的不带电荷的尼龙膜后，以山菠菜犅犃犇犎ｃＤＮＡ中间片段为探针（随机引物法合成放射性探针），进行
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交分析。
１．２．４　ＢＡＤＨ活性分析　苜蓿叶片酶蛋白的提取与活性测定主要参考Ｌｉｕ等［８］和 Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ等［９］的方法，略
有改动。２ｇ植物组织在液氮中研磨后，室温下加入２ｍＬ蛋白提取液［５０ｍｍｏｌ／ＬＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ （ｐＨ值８．０），１
ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，５ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ］，在４℃下离心（１４００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ；活性测定反应体系为：５０ｍｍｏｌ／ＬＨｅｐｅｓ／
ＫＯＨ （ｐＨ值８．０），５ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１ｍｍｏｌ／Ｌ甜菜碱醛，１ｍｍｏｌ／ＬＮＡＤ及酶蛋白提取液，
总体积３．０ｍＬ，以煮沸５ｍｉｎ的酶提取液为空白对照，３７℃ 反应１０ｍｉｎ，紫外分光光度计３４０ｎｍ比色测定。酶
的比活力（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ·ｍｇ蛋白质）＝ΔＯＤ×１０－３（εｍａｘ×犆）×１０９，式中ΔＯＤ为吸光值每 ｍｉｎ增加的平均值，ε
为摩尔消光系数（６２００），犆为测定时加入的酶量。
１．２．５　甜菜碱含量测定　甜菜碱含量测定参考李永华等［１０］的方法。准确称取０．２ｇ冷冻苜蓿叶片，加入２ｍＬ
甲醇－氯仿－ＫＨＣＯ３ 试剂（甲醇∶氯仿∶０．２ｍｏｌ／ＬＫＨＣＯ３＝１２∶５∶１），充分研磨，转入１０ｍＬ塑料离心管
中，于６０℃水浴中恒温振荡２０ｍｉｎ，冷却后，１４００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１０ｍｉｎ；转移上清液到２５ｍＬ离心管中，加２
ｍＬ氯仿和４ｍＬ蒸馏水，充分摇匀，１４００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１０ｍｉｎ。吸取上清液到１０ｍＬ容量瓶中，以蒸馏水定
容，即为甜菜碱粗提液。将粗提液倒入内装３ｍＬ离子交换混合柱的５ｍＬ注射器中，当粗提液全部过柱后，先用
３ｍＬ蒸馏水，再用４ｍＬ４ｍｏｌ／ＬＮＨ４ＯＨ洗脱，收集洗脱液，６５℃减压浓缩，２ｍＬ甲醇溶解残渣，经０．２５μｍ微
孔滤膜过滤，利用岛津ＬＣ－６Ａ型高效液相色谱仪测定甜菜碱含量。本测定在山东农业大学生命科学院完成。
１．２．６　生理指标的测定　经３周盐胁迫后测定相关生理生化指标：１）细胞膜透性采用电导仪法测定［１１］；２）丙二
醛（ＭＤＡ）含量采用硫代巴比妥酸法测定［１２］；３）可溶性糖采用蒽酮法测定［１１］；４）脯氨酸（ｐｒｏ）含量采用酸性茚三
酮比色法［１１］；５）超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性采用Ｇｉａｎｎｏｐｏｌｉｔｉｓ和Ｒｉｅｓ［１３］的方法测定；６）过氧化物酶（ＰＯＤ）活性
参考Ｃａｋｍａｋ和 Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ［１４］的方法测定；７）过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性采用Ｌｉａｎｇ和 Ｈｕａｎｇ［１５］的方法测定。每一
处理重复测定３次，取平均值。
２　结果与分析
２．１　转基因Ｔ１代植株的ＰＣＲ检测
将２个转基因株系的Ｔ１代自交株系种子苗和随
图１　 转基因苜蓿犜１代株系的犘犆犚检测
犉犻犵．１　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犜１犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪犾犳犪犾犳犪
Ｍ：ＤＬ１５０００；Ｐ：质粒ＤＮＡＰｌａｓｍｉｄＤＮＡ；ＣＫ：阴性对照
Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；１～１１：Ｔ１代转基因植株
ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｏｆＴ１ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
机挑选的８株对照植株进行ＰＣＲ检测（部分ＰＣＲ结
果如图１），以ＰＣＲ扩增产物有无犅犃犇犎 基因的特异
性片断为抗性基因的分离指标（表１）。
从转基因当代植株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果可知［５］，
Ｔ０８和Ｔ０１２中的外源犅犃犇犎 基因拷贝数分别为２
和１个。对２个转基因植株后代（Ｔ１）ＰＣＲ检测结果
可以看出，有１７５株扩增出与阳性对照一致的特异条
带，而对照和其余的转基因Ｔ１代植株无此条带，２个
株系的分离比符合孟德尔遗传规律，即３∶１（表１），获
得了稳定遗传的Ｔ１代植株，说明犅犃犇犎 基因能够稳
定遗传到子代。
６６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
表１　转基因苜蓿犜１代株系的犘犆犚检测
犜犪犫犾犲１　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犜１犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪犾犳犪犾犳犪
株系
Ｌｉｎｅ
外源基因拷贝数
Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｃｏｐｙ
总株数
Ｔｏｔａｌ
ＰＣＲ阳性株数
Ｎｏ．ｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｎｔｓ
ＰＣＲ阴性株数
Ｎｏ．ｏｆｎｅｇａｔｉｖｅｐｌａｎｔｓ
ＰＣＲ阳性株数／ＰＣＲ阴性株数
Ｎｏ．ｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｎｔｓ／Ｎｏ．ｏｆｎｅｇａｔｉｖｅｐｌａｎｔｓ
ＣＫ ０ ８ ０ ８ ０
Ｔ１８ ２ １４８ １０１ ４７ ３∶１
Ｔ１１２ １ ９７ ７４ ２３ ３∶１
２．２　盐胁迫下转基因植株犅犃犇犎 表达、ＢＡＤＨ活性及甜菜碱含量变化
用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交法分析Ｔ１代转基因株系‘Ｔ１８’、‘Ｔ１１２’和对照植株叶片中犅犃犇犎 的表达情况（图
２）。结果表明，在无盐条件下，２个转基因苜蓿株系叶片中的犅犃犇犎 表达量很低，当在０．８％ＮａＣｌ浓度下胁迫３
周时，犅犃犇犎 的表达水平明显增加，且‘Ｔ１８’叶片中的表达量高于‘Ｔ１１２’；对照植株未检测到转录体。说明盐
胁迫会导致犅犃犇犎 基因表达水平的增加，不同转基因株系抗盐性有差异，‘Ｔ１８’抗盐性大于‘Ｔ１１２’。
图２　犖狅狉狋犺犲狉狀杂交分析
犉犻犵．２　犖狅狉狋犺犲狉狀犫犾狅狋狋犻狀犵犪狀犪犾狔狊犻狊
ＣＫ：对照植株 Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；Ｔ１８、Ｔ１１２：０．８％ＮａＣｌ处理的转基因植株 Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔａｔ０．８％
ＮａＣｌｓｔｒｅｓｓ；Ｔ１８’、Ｔ１１２’：ＮａＣｌ未处理的转基因株系 Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔａｔ０ＮａＣｌｓｔｒｅｓｓ。
　　为了进一步分析外源基因的功能，对转基因株系
在无盐及０．８％ＮａＣｌ的胁迫条件下测定了转基因苜
蓿Ｔ１代植株ＢＡＤＨ活性和甜菜碱含量（表２）。结果
表明：在无盐条件下，对照植株和转基因植株ＢＡＤＨ
活性和甜菜碱含量较低，在０．８％ＮａＣｌ浓度胁迫下，
转基因植株ＢＡＤＨ活性和甜菜碱含量比对照植株增
加２～４和４～５倍，且不同株系之间差异很大。因而，
盐胁迫下转基因苜蓿具有较强的渗透调节能力，降低
了盐胁迫对叶片细胞造成的伤害。
表２　转基因植株犅犃犇犎活性和甜菜碱含量测定
犜犪犫犾犲２　犅犃犇犎犪犮狋犻狏犻狋狔犪狀犱犫犲狋犪犻狀犲犮狅狀狋犲狀狋狊
犪狊狊犪狔狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
参数
Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
ＮａＣｌ
（％）
株系Ｌｉｎｅｓ
Ｔ１８ Ｔ１１２ ＷＴ
ＢＡＤＨ活性 ０ １．６４６ １．９５５ １．４２５
ＢＡＤＨａｃｔｉｖｉｔｙ（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ·ｇ） ０．８ ５．９２９ ３．７４１ １．５４５
甜菜碱含量 ０ ２．５８３ ２．２４１ １．８９７
Ｂｅｔａｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｓ（μｍｏｌ／ｇ） ０．８ １２．６７３ ９．９７５ ２．０６３
２．３　盐胁迫对苜蓿试管苗膜透性及丙二醛（ＭＤＡ）含量的影响
在无盐条件下，各株系电解质相对渗出率较低，转基因苜蓿试管苗与对照间差异不显著；在盐胁迫条件下，细
胞膜透性随着盐浓度的增加而增加；当ＮａＣｌ浓度≥０．８％时，转基因株系电解质相对渗出率明显低于对照，差异
极显著；‘Ｔ１８’株系随着盐浓度的增加，电解质相对渗出率增加最少，表明转基因植株的膜结构完整性较好，受
到的伤害最小，抗盐性强（图３）。随着盐浓度的升高，苜蓿试管苗的 ＭＤＡ含量增加（图４），膜脂过氧化程度加
重，其变化趋势与电导率基本一致；在０．８％ＮａＣｌ胁迫下，‘Ｔ１８’ＭＤＡ含量与‘Ｔ１１２’相近且低于对照品种，差
异极显著，说明在较高浓度盐胁迫下，转基因株系膜脂质过氧化程度较低，膜结构受到的伤害较小，这进一步说明
转基因株系抗盐性较强。
７６第１８卷第６期 草业学报２００９年
图３　不同盐浓度下电导率的变化
犉犻犵．３　犆犺犪狀犵犲狊狅犳犮狅狀犱狌犮狋犻狏犻狋狔狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
图４　不同盐浓度下 犕犇犃含量的变化
犉犻犵．４　犕犇犃犮狅狀狋犲狀狋狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
表示差异显著（犘＜０．０５），表示差异极显著（犘＜０．０１），下同 Ｔｈｅａｎｄｓｔａｎｄｆｏｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５）
ａｎｄｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
２．４　盐胁迫对苜蓿试管苗渗透调节物质的影响
在无盐培养条件下，‘Ｔ１８’株系脯氨酸含量显著高于其他株系（图５）；当ＮａＣｌ浓度≤０．８％时，随着盐浓度
的升高，各株系苜蓿试管苗的脯氨酸含量均逐渐增加；在０．８％ＮａＣｌ浓度下，转基因植株脯氨酸含量比对照增长
了３倍多；当ＮａＣｌ浓度为１．２％时，各株系的脯氨酸含量降低，转基因株系仍显著高于对照；‘Ｔ１８’在不同浓度
盐胁迫下的含量均高于其他株系，达到极显著水平。在无盐培养条件下，各株系的可溶性糖含量无显著差异（图
６）；在盐胁迫条件下，各株系试管苗的可溶性糖含量随盐浓度的升高而上升，其中‘Ｔ１８’的增加幅度较大，在不
同浓度盐胁迫下与对照差异极显著，与‘Ｔ１１２’差异显著。
图５　不同盐浓度下狆狉狅含量变化
犉犻犵．５　犆犺犪狀犵犲狊狅犳狆狉狅犮狅狀狋犲狀狋狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
图６　不同盐浓度下可溶性糖的变化
犉犻犵．６　犆犺犪狀犵狊狅犳狊狅犾狌犫犾犲狊狌犵犪狉狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
２．５　盐胁迫对苜蓿试管苗抗氧化酶活性的影响
在无盐培养条件下，转基因株系和对照植株ＳＯＤ活性均较低（表３），且差异不明显，随着盐浓度的升高，苜
蓿试管苗ＳＯＤ活性呈增强的趋势；在０．４％ＮａＣｌ处理时，各株系ＳＯＤ活性无显著差异；当 ＮａＣｌ浓度≥０．８％
时，转基因株系均与对照差异显著或极显著，而且‘Ｔ１８’的活性最强；在１．２％ＮａＣｌ浓度胁迫下，转基因株系
‘Ｔ１８’和‘Ｔ１１２’与对照相比分别提高３０％和２１％。在无盐培养条件下，转基因株系‘Ｔ１８’ＰＯＤ活性较高（表
４），显著高于对照；在不同浓度的盐胁迫条件下，‘Ｔ１８’ＰＯＤ活性大幅度增加，均与对照差异极显著，在１．２％
ＮａＣｌ时，ＰＯＤ活性提高４８．５％；而‘Ｔ１１２’株系在ＮａＣｌ浓度≤０．４％时，ＰＯＤ活性与对照没有差异，在ＮａＣｌ
８６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
浓度≥０．８％时，差异显著或极显著。当ＮａＣｌ浓度≤
０．８％时，转基因株系ＣＡＴ活性随着盐浓度的增大而
增加（表５），在１．２％ＮａＣｌ浓度下，各株系酶活性反而
降低；低浓度盐胁迫，各株系ＣＡＴ活性无显著差异；
当ＮａＣｌ浓度≥０．８％时，‘Ｔ１８’、‘Ｔ１１２’与对照差异
显著或极显著；在０．８％ＮａＣｌ浓度下，‘Ｔ１８’、‘Ｔ１
１２’ＣＡＴ活性分别比对照提高了４０％和２８％。从上
述结果可以看出，‘Ｔ１８’在不同盐胁迫条件下，ＳＯＤ、
ＰＯＤ和ＣＡＴ酶活性最高。
表３　不同盐浓度下苜蓿试管苗的犛犗犇活性
犜犪犫犾犲３　犛犗犇犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊狅犳犪犾犳犪犾犳犪狊犲犲犱犾犻狀犵狊犪狋
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊 Ｕ／（ｇ·ｍｉｎ）
ＮａＣｌ浓度ＮａＣｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（％） ＣＫ Ｔ１８ Ｔ１１２
０ ２３０．２４ ２４６．６９ ２２０．５４
０．４ ２６３．７７ ２７２．１２ ２８３．６２
０．８ ２８３．６２ ３７３．７７ ３１３．１１
１．２ ３０４．９１ ３９５．７６ ３６９．６７
表４　不同盐浓度下苜蓿试管苗的犘犗犇活性
犜犪犫犾犲４　犘犗犇犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊狅犳犪犳犪犾犳犪狊犲犲犱犾犻狀犵狊犪狋
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊 Ｕ／（ｇ·ｍｉｎ）
ＮａＣｌ浓度ＮａＣｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（％） ＣＫ Ｔ１８ Ｔ１１２
０ ４２０．６８ ４８３．６６ ３９８．６１
０．４ ４４５．５９ ６１０．７５ ４６３．２３
０．８ ４６３．９３ ６２５．５９ ５００．８９
１．２ ５２９．５５ ７８６．４５ ６２０．７４
表５　不同盐浓度下苜蓿试管苗的犆犃犜活性
犜犪犫犾犲５　犆犃犜犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊狅犳犪犾犳犪犾犳犪狊犲犲犱犾犻狀犵狊犪狋
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊 Ｕ／（ｇ·ｍｉｎ）
ＮａＣｌ浓度ＮａＣｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（％） ＣＫ Ｔ１８ Ｔ１１２
０ ８．１２ ８．７１ ８．５６
０．４ １２．０３ １５．７２ １３．４３
０．８ １４．４１ ２０．２４ １８．４５
１．２ １１．５５ １８．７８ １５．２４
３　讨论
转基因植株的遗传分离现象受转化方法、外界环境和植物自身生物学特性等因素的影响，一般来说，农杆菌
介导的遗传转化后代多呈简单的孟德尔遗传［１６］。当外源基因以单拷贝或多拷贝串联方式插入染色体的单一位
点时，整合的外源基因拷贝可作为一个独立的遗传单位共同分离，即表现为单基因显性孟德尔遗传［１７］。本研究
的２个转基因苜蓿Ｔ１代株系ＰＣＲ检测分析表明，ＰＣＲ阳性株数／ＰＣＲ阴性株数分离比为３∶１，可以推测，转基
因植株Ｔ０８的２个拷贝的外源基因应该是插入到苜蓿基因组的同一条染色体单一位点上，为单基因显性方式进
行遗传，符合单拷贝单位点整合或串联多拷贝单位点整合的孟德尔遗传规律［１６～１８］，表明犅犃犇犎 基因稳定遗传到
子代。这也是遗传育种中最需要的遗传方式，尽可能利用单位点整合的转基因植株，在后代筛选中易获得基因型
纯合的转基因植株抗逆优良品系。
犅犃犇犎 基因的表达受盐胁迫的诱导。当ＮａＣｌ的浓度从零逐渐增加到５００ｍｍｏｌ／Ｌ时，菠菜（犛狆犻狀犪犮犻犪狅犾犲狉
犪犮犲犪）叶片中的犅犃犇犎 的ｍＲＮＡ含量增加３～４倍［１９］；在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫条件下的大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾
犵犪狉犲）叶片中，犅犃犇犎 的ｍＲＮＡ含量比对照增加了８倍，在无盐条件下，犅犃犇犎 ｍＲＮＡ的量就恢复到接近正常
的状态［２０］。本研究结果也证实了这一点，在盐胁迫条件下，转基因植株的犅犃犇犎 表达量明显增加（图２）。在转
基因苜蓿植株中，不论ＮａＣｌ胁迫存在与否，都可以检测到ＢＡＤＨ活性和甜菜碱含量，但盐胁迫下ＢＡＤＨ的活性
和甜菜碱含量比对照植株增加２～４和４～５倍。在其他文献中也有同样的报道［２１～２３］。上述研究结果显示甜菜
碱的积累与盐胁迫密切相关，盐浓度的变化可能对甜菜碱生物合成过程中相关基因的表达进行调控，从而控制甜
菜碱的积累。但转基因植株个体间ＢＡＤＨ活性和甜菜碱含量差异较大，导致不同植株间ＢＡＤＨ活力和甜菜碱
含量有较大差距的原因尚不清楚，推测可能与外源犅犃犇犎 基因插入位点、插入的的拷贝数及甲基化程度不同有
关，应在后续研究中加强筛选，以获得抗逆性明显提高的株系。
大量的研究表明，在抗逆胁迫下细胞内自由基如羟自由基、超氧自由基、单线态氧等会引发膜脂过氧化，造成
细胞膜系统的损伤，膜透性增加，使细胞内的大量无机离子和氨基酸、可溶性糖等小分子外渗［２４，２５］。本试验证
明，转犅犃犇犎 基因苜蓿株系‘Ｔ１８’和‘Ｔ１１２’试管苗在盐胁迫下膜的结构较稳定，透性变化较小，ＭＤＡ积累较
少，膜脂过氧化程度较低，受到的伤害较轻，因而抗盐性较强。
９６第１８卷第６期 草业学报２００９年
逆境下植物细胞中脯氨酸积累的生理意义至今仍然存在着截然相反的结论［２６］。一些研究认为Ｐｒｏ可作为
渗透调节物质、氮源贮藏、酶和细胞结构的保护剂及清除羟自由基等而对植物起保护作用，其研究结果表明逆境
下抗逆性较强的品种Ｐｒｏ积累较多，而抗逆性较弱的品种积累Ｐｒｏ较少［２７］。本研究也发现，在０．８％ＮａＣｌ盐胁
迫下，转基因植株Ｐｒｏ积累较多，极显著高于对照植株，当胁迫伤害超过一定限度时（ＮａＣｌ浓度≥１．２％），植物体
开始死亡，Ｐｒｏ含量不再积累反而降低。
可溶性糖是细胞渗透调节物质，在盐胁迫下其含量提高，可降低细胞渗透势，使细胞具有较强的保水能力，以
维持正常的生理活动。因此，转基因株系不仅能合成甜菜碱，还使盐胁迫下试管苗具有较高的可溶性糖，从而增
强渗透调节能力，提高抗盐性。
ＳＯＤ、ＰＯＤ和ＣＡＴ为生物体内极为重要的保护酶，能清除细胞内过多的自由基和过氧化物，使其维持在较
低水平，避免细胞的结构受到损伤，其活性的升高，有利于转基因苜蓿试管苗在盐胁迫下维持正常生理活动，提高
抗盐能力。
综合渗透调节物质、抗氧化酶活性、质膜透性等各项指标测定结果，３个株系耐盐力的顺序是：‘Ｔ１８’＞‘Ｔ１
１２’＞对照植株，说明转犅犃犇犎 基因苜蓿试管苗在耐盐性方面要强于对照株系；而所测定的犅犃犇犎 基因表达、
ＢＡＤＨ活性和甜菜碱含量与其耐盐力的顺序完全吻合，表明犅犃犇犎 基因已经在苜蓿转化植株体内表达，导入
犅犃犇犎 基因可以提高盐胁迫下苜蓿试管苗的渗透调节物质和抗氧化酶活性、增强酶活性、降低氧自由基浓度，减
轻其对细胞的伤害，并且可以稳定细胞膜的通透性，从而减轻植株的伤盐害的程度，其耐盐性得到了提高。
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犃狊狋狌犱狔狅狀狊犪犾狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲犪狀犱狋犺犲犵犲狀犲狋犻犮狊狋犪犫犻犾犻狋狔狅犳犜１犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪犾犳犪犾犳犪狑犻狋犺狋犺犲犅犃犇犎犵犲狀犲
ＹＡＮＬｉｐｉｎｇ１，ＸＩＡＹａｎｇ１，ＬＩＡＮＧＨｕｉｍｉｎ２，ＷＡＮＧＺｈｅｎｚｈｅｎ１，
ＬＩＳｈｕａｎｇｙｕｎ１，ＬＩＵＣｕｉｌａｎ１，ＰＡＮＧＣａｉｈｏｎｇ１
（１．ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｊｉｎａｎ２５００１４，Ｃｈｉｎａ；２．ＪｉａｎｇｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ
ＦｏｒｅｓｔｒｙＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｌｅｇｅ，Ｊｕｒｏｎｇ２１２４００，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｅｓａｎｄｉｔｓＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＴｈｅｒａｔｉｏｏｆｎｅｇａｔｉｖｅｔｏｐｏｓｉｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈｅｆｉｒｓｔＭｅｎｄｅｌｉａｎｌａｗ．
ＴｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｎｉｃＴ１ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｓｈｏｗｅｄｅｎｈａｎｃｅｄＢＡＤＨａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｂｅｔａｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔ，ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｎｏｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｔ０．８％ ＮａＣｌｓｔｒｅｓｓ．Ｐｒｏｌｉｎｅａｎｄｓｏｌｕｂｌｅｓｕｇａｒｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＴ１ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｅｓ，ｗｈｉｌｅｅｌｅｃ
ｔｒｏｌｙｔｅｌｅａｋａｇｅａｎｄｍａｌｏｎａｌｄｅｈｙｄｅｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｌｏｗｅｒ．Ｔｈｉｓｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｅ犅犃犇犎ｇｅｎｅｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ
ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＴ１ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｉｍｐｒｏｖｅｄｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｆａｌｆａ；犅犃犇犎ｇｅｎｅ；ｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ
１７第１８卷第６期 草业学报２００９年