全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"%#$+%, +%+
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!!文章编号!$##$($)*&""#$%##%(#+%,(#%
余甘子精粉的体外抗氧化活性分析
李!娴" 甘!瑾" 张雯雯" 侯!彬" 张!弘" 冯!颖!
"中国林业科学研究院资源昆虫研究所* 国家林业局资源昆虫培育与利用实验室!云南 昆明!%#"")#
收稿日期$ "#$%(#%($%
基金项目$ %十二五&国家科技支撑计划项目子课题""#$"-./,-#, J#,#
作者简介$ 李!娴"$*&%)#!女!硕士!助理研究员!从事天然产物活性分析及细胞工程相关研究2
!
通讯作者2
关键词!余甘子精粉*体外抗氧化* 0^.G法*MZ(Mf%f细胞*Z
"
b
"
损伤
中图分类号!M+2* 文献标识码!.
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"
b
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Z
"
b
"
(69RW=PR =P7R545:P
余甘子"0*12(@&*4%$+52,)( H2#是大戟科"3W(
U@>BA65=P5P#叶下珠属"0*12(@&*4%#植物!其果鲜食
酸而微涩!回味甘甜!故名余甘!又名滇橄榄油柑
子庵摩勒等( 全世界约有 $+ 个国家的传统药物体
系中使用余甘子!在我国的中药藏药等均有应用!
作为一味重要的传统民族药!已被载入多版/中国药
典0 ,$- ( 余甘子具有清热凉血生津止咳等药用功
效!具有较高的食用和药用价值,"- !是卫生部审核颁
布的%药食同源&植物!营养价值丰富( 现代药理学
研究证明!余甘子具有抗肿瘤抗衰老抗病原微生
物降血脂降血压等作用 ,, J)- !并已证实!余甘子
显著的抗氧化活性是其生理功能的基础,% J- (
目前!余甘子的加工利用主要产品有果汁果脯
等!其中果汁含有丰富的抗氧化活性成分,+- !笔者所
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
在课题组前期研究发现!存放后的余甘子果汁稳定
性不佳!超氧化物歧化酶"Mb/#维生素 E"mE#等
活性成分含量随存放时间延长而下降*为保护余甘
子的敏感性功效成分!提高其保健功效!可采用超声
波破壁逆流多级渗滤提取!通过喷雾干燥法制成余
甘子精粉( 经检测!精粉中mE保持率达 %"2g!对
邻苯三酚氧化抑制率为 "*2g!营养成分损失少!
干燥物速溶性冲调性好,& J*- ( 为进一步验证其抗
氧化活性!本文通过化学检测法和细胞模型法对余
甘子精粉进行体外抗氧化活性研究!以期为更好地
开发利用余甘子资源提供参考(
$!材料与方法
;2;<仪器
m5B6>De59 7^5D@ 全波长多功能酶标仪 "美国
F@PB4>D=6P9O6Q6=#二氧化碳培养箱 "美国 F@PB4>
D=6P9O6Q6=#倒置显微镜"日本b7T4UWD#生物安全柜
"美国-5ePB#细胞活力计数仪"美国-P=e459#(
;2><材料与试剂
余甘子精粉!由云南天启生物科技有限公司提供(
/C3C高糖培养基 "美国 L6A=>#胎牛血清
" -^M#"美国 ZT=7>9#磷酸盐缓冲液"G-M# "美国
ZT=7>9#胰蛋白酶"美国 .4BPD=>#甲基噻唑基四
唑溴盐"CFF# "美国 .4BPD=>#二甲基亚砜"/C(
Mb#"美国.4BPD=>#维生素E"美国 M6:45#其他试
剂均为国产分析纯( 人神经母细胞瘤细胞 " MZ(
Mf%f#购于中国科学院昆明动物研究所(
;2B<化学测定法
$2,2$!余甘子精粉抗脂质过氧化能力的测定!参
照文献方法,$#- !选择mE为阳性对照!将余甘子精粉
用蒸馏水配制成与 mE相同的浓度!过滤后冷藏备
用( 使空白管和样品管反应体系"表 $#在 ,+K分别
反应 #2% @ 后!分别加入 #2#% 4H"#g三氯乙酸
"FE.#" 4H#2&g 硫代巴比妥酸"F-.#!充分混合
后在 $##K反应 ,# 469!冷却后加入 ) 4H正丁醇萃
取! , ### B+469J$离心 $# 469!取上清液于比色皿
中!用分光光度计测 %," 94处的吸光度!同一浓度
重复 , 次!取平均值!以不加热反应的反应体系作为
空白调零管( 按下列公式计算抗脂质过氧化率!式
中7
NKO"样品#为样品管的吸光度*7NKO"空白#为空白管的
吸光度(
抗脂质过氧化率"g# ],$ J7
NKO"样品#P7NKO"空白# -
$`##g
表 ;<反应体系组成
试剂 空白管\4H
样品管\4H
$ " , ) %
#2%g亚油酸乳液 $ $ $ $ $ $
$# 44>7+H
J$
P^Mb
)
#2" #2" #2" #2" #2" #2"
$# 44>7+H
J$
Z
"
b
"
#2" #2" #2" #2" #2" #2"
样品 J #2" #2) #2 #2& $2#
提取溶剂 $ #2& #2 #2) #2" J
样品浓度\"4:+4HJ$# # &# $# ")# ,"# )##
总体积 "2) "2) "2) "2) "2) "2)
$2,2"!余甘子精粉铁还原能力的测定!参考文
献,$$-方法!并略作修改!以 P^Mb
)
为标准物质绘制
标准曲线!分别吸取 ##2#"#2#)#2##2#$
#2$"#2$)#2$ 4H的 $ 44>7+4HJ$ P^Mb
)
溶液!
并加蒸馏水补充至 #2" 4H!再分别加入 ,2& 4H
0^.G试剂"现用现配$$# 44>7+4HJ$三吡啶三吖
嗪"FGFh#"# 44>7+4HJ$ P^E7
,
+ Z
"
b和乙酸缓
冲液"UZ],2#以 $$$$$# 的体积比混匀! ,+K保温
备用#!混匀后 ,+K反应 $# 469!测定 %*, 94波长
处吸光度( 以吸光度为纵坐标! P^Mb
)
浓度为横坐
标!绘制标准曲线( 样品的测定则分别取 )#&#
$"#$#"##
!
H样品!用蒸馏水补充至 "##
!
H!使
样品浓度为 &#$#")#,"#)## 4:+4HJ$!再分
别加入 ,2& 4H 0^.G试剂!混匀后 ,+K反应 $#
469!于 %*, 94处测定吸光度!同一浓度重复 , 次!
取平均值( 样品的铁还原能力等于样品与 P^"NN#
JFGFh反应后在 %*, 94处产生的吸光值所相当的
标准 P^Mb
)
溶液的浓度"
!
4>7+4H
J$
#! P^Mb
)
浓度
越大!表示样品抗氧化活性越强(
;2E<细胞模型法
$2)2$!细胞的培养!MZ(Mf%f细胞培养于完全培
养液"含 $#g -^M的/C3C培养液#中!置于 ,+K
%gEb
"
饱和湿度的Eb
"
培养箱中培养!" , 天传
代( 细胞传代时!先吸去瓶中的培养液!再用G-M液
清洗 $ 次!加入适量的 #2"%g 胰蛋白酶消化后轻轻
吹打!当细胞脱离瓶壁后!加入完全培养液终止消
化!细胞悬液离心!弃上清液后收集细胞!取对数生
长期的细胞进行实验(
$2)2"!Z
"
b
"
诱导 MZ(Mf%f细胞氧化损伤模型的
建立!参照文献方法,$" J$,- !将 MZ(Mf%f细胞按 2#
$`#
%
=P7D+4H
J$的浓度接种于 * 孔板!每孔 "##
!
H!置于 ,+K%gEb
"
饱和湿度的 Eb
"
培养箱中
培养 ") @后!弃上清液!将细胞分为正常对照组!不
同浓度的Z
"
b
"
损伤组"模型组#!正常对照组加入
完全培养液!模型组分别加入含 )## ## &##
)%+
第 % 期 李!娴!等$余甘子精粉的体外抗氧化活性分析
$ ###$ "##$ )##
!
4>7+H
J$
Z
"
b
"
的完全培养液!
每组设 ) 个平行孔!置于 Eb
"
培养箱中培养 $@ 后!
每孔加入 "#
!
H浓度为 % 4:+4HJ$的CFF溶液!于
Eb
"
培养箱继续培养 )@ 后!吸去上清液!每孔加入
$%#
!
H/CMb!振荡 $% 469!使结晶物充分溶解!在
酶标仪上测定各孔在 %+# 94处的吸光度!计算细胞
相对存活率!计算方法如下!选择细胞相对存活率在
%#g左右的Z
"
b
"
浓度作为 $ @的造模浓度(
细胞相对存活率"g# ]"模型孔或样品孔吸光
度\正常对照孔吸光度# $`##g
$2)2,!余甘子精粉对 Z
"
b
"
损伤的 MZ(Mf%f细胞
相对存活率的影响!将对数生长期细胞按 $`#%
=P7D+4H
J$的浓度加入 * 孔培养板!每孔 "##
!
H!
置于 ,+K%gEb
"
*%g空气饱和湿度的Eb
"
培养
箱中培养 ") @ 后!吸去上清液!加入含样品的完全
培养液!样品组设 & 个浓度!分别为 "##)####
&##$ ###$ "##$ )##$ ##
!
:+4H
J$
!每孔 "##
!
H!每个浓度设 ) 个平行孔!同时设空白对照孔"无
细胞!只有培养液和样品#!以扣除溶媒颜色的干扰!
以及正常对照孔"细胞 a培养液#!阳性对照为 mE!
浓度为 #2$ )##
!
:+4H
J$等 & 个浓度( 加入样品
后置于Eb
"
培养箱中培养 ") @!吸去上清液!用G-M
液清洗一遍后!加入 $ ###
!
4>7+H
J$的 Z
"
b
"
再培
养 $ @后用CFF法"方法同 $2,2)#在酶标仪上测定
各孔在 %+# 94处的吸光度!计算细胞相对存活率(
;2F<统计学处理
实验数据用
+
Vk%表示!采用 MGMM软件处理!方
差齐性采用!检验!方差齐的数据进行方差分析*方
差不齐的数据则用非参数检验(
"!结果与分析
>2;<化学测定法
"2$2$!余甘子精粉抗脂质过氧化能力的测定!结
果表明!余甘子有较强的抗脂质过氧化能力!并随浓
度的增加而增强!呈明显的量效关系"图 $#( 当浓
度为 &##
!
:+ 4H
J$时!抗脂质过氧化能力与同浓度
阳性对照mE相当!有明显的活性(
"2$2"!余甘子精粉铁还原能力的测定!由图 " 结
果可见!各浓度的余甘子精粉和 mE对铁离子的还
原能力随浓度的增加而增强!虽然两者均呈浓度依
赖性增长!但铁还原能力仍存在差别!当精粉浓度达
,+2%
!
:+ 4H
J$时!铁还原能力为 ,&"2
!
4>7+
H
J$
P^Mb
)
!仅与浓度为 $&2+%
!
:+ 4H
J$的mE铁还
图 $!余甘子精粉的抗脂质过氧化能力
原能力 ",+$
!
4>7+ H
J$
P^Mb
)
#相当!而同浓度
",+c%
!
:+ 4H
J$
#mE的铁还原能力则达到 +#2&
!
4>7+ H
J$
P^Mb
)
!由此可见!余甘子精粉体外还原
力强度不及mE(
图 "!余甘子精粉的铁还原能力
>2><细胞模型法
"2"2$!Z
"
b
"
诱导 MZ(Mf%f细胞氧化损伤模型的
建立!CFF实验结果显示$细胞相对存活率随Z
"
b
"
浓度的升高而降低!当 $ ###
!
4>7+H
J$
Z
"
b
"
处理
$ @后!能使 MZ(Mf%f细胞相对存活率降低至 %#g
左右!与正常组比较!差异有显著意义"0i#2#$#!
为理想造模条件( 选用 $ ###
!
4>7+H
J$
Z
"
b
"
处理
$ @作为最佳造模条件!结果如图 , 所示!成功复制
了氧化损伤细胞模型!可用于余甘子精粉体外抗氧
化活性的检测(
"2"2"!余甘子精粉对 Z
"
b
"
损伤的 MZ(Mf%f细胞
相对存活率的影响!阳性对照 mE对本实验中的模
型细胞显示出较好的抗氧化活性!表明本评价体系
可信( 经不同浓度 mE预保护 ") @ 后!模型细胞相
对存活率随 mE浓度的增加而提高!呈浓度依赖性
"图 )#!与模型组相比!"##
!
:+4H
J$
mE组细胞相
%%+
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
#
0i#2#% VD=>9OB>7
图 ,!不同浓度Z
"
b
"
对 MZ(Mf%f细胞吸光度的影响
对存活率明显提高"0i#2#$#*经不同浓度余甘子
精粉预保护 ") @后!模型细胞相对存活率随精粉浓
度增加而提高!呈量效关系"图 %#!其中 &## $ ##
!
:+4H
J$各浓度精粉组细胞相对存活率明显高于
模型组!差异有显著性意义"0i#2#$#!当浓度达
$ "##
!
:+4H
J$时显示出最佳活性( 当 mE浓度为
"##
!
:+4H
J$时!细胞相对存活率已达 &#g以上
"图 )#*与阳性对照组 mE相比!余甘子精粉浓度要
到达 $ ###
!
:+4H
J$后!细胞存活率才达到 &#g以
上"图 %#*mE在较低浓度时就具有与其约 , 倍浓度
精粉相当的保护模型细胞的作用( 试验发现!当mE
和精粉浓度高于一定程度后!细胞相对存活率反而
降低!结合显微观察!分析这种现象的原因可能与样
品加入培养液后使其 UZ值渗透压等发生改变!从
而影响细胞的生存状态有关(
#
0i#2#% VD=>9OB>7*
!
0i#2#% VDZ
"
b
"
:B>WU!
!!
0i#2#$ VD
Z
"
b
"
:B>WU
图 )!mE对Z
"
b
"
损伤的 MZ(Mf%f细胞相对
存活率的影响
,!结论与讨论
研究结果表明!本文试验条件下!各浓度余甘子
精粉均表现出较好的抗脂质过氧化能力和还原铁的
#
0i#2#% VD=>9OB>7*
!
0i#2#% VDZ
"
b
"
:B>WU!
!!
0i#2#$ VD
Z
"
b
"
:B>WU
图 %!余甘子精粉对Z
"
b
"
损伤的 MZ(Mf%f细胞相对
存活率的影响
能力!与阳性对照 mE相比!在一定浓度时精粉抗脂
质过氧化能力与之相当!而铁还原能力则远不及
mE!表明余甘子精粉的体外抗脂质过氧化能力高于
铁还原能力*余甘子精粉能够显著提高氧化损伤模
型细胞的相对存活率!可保护 MZ(Mf%f细胞免受氧
化损伤!但与 mE相比!同浓度时其保护作用不及
mE( " 种方法均证实余甘子精粉具有较好的体外抗
氧化作用!作为天然抗氧化剂具有很好的开发潜力(
人体的许多疾病和组织损伤都与体内的氧化应
激反应有关!氧化 J抗氧化状态之间的不平衡造成
的氧化损伤与众多疾病的发生相关!包括癌症神经
系统疾病等( 因此!应用抗氧化物质来保持人体健
康和预防疾病的研究得到了越来越多科学家的关
注,$) J$%- ( 目前!体外抗氧化活性评价方法种类繁
多!其中包含化学测定法细胞模型法动物模型试
验等!它们各有其优势及局限性!单一的评价方法并
不能全面的评价一种物质的抗氧化活性,$- !应当选
择多种反应机制的评价模型!以便客观准确的对具
有抗氧化活性的物质进行评价( 研究中选择了目前
较为常用的化学测定法!可间接评价其抗氧化活性(
与动物模型试验相比!细胞模型法具有耗时短成本
相对较低的优点!研究采用能产生羟自由基"+bZ#
引发脂质过氧化反应的Z
"
b
"
诱导 MZ(Mf%f细胞氧
化损伤复制细胞模型,$+- !Z
"
b
"
造成的损伤模型已
成为研究细胞氧化损伤的重要工具之一,$&- (
余甘子果汁营养成分分析研究发现,$* J"#- !其中
含有丰富的 Mb/mE多酚黄酮和多糖等!起抗氧
化作用的主要是酚类物质!它能够提供活泼的氢质
%+
第 % 期 李!娴!等$余甘子精粉的体外抗氧化活性分析
子!有效的清除氧自由基*还能够与过氧化自由基结
合成稳定的化合物!阻止氧化过程中的链锁反应的
传播*另外!酚类通过对金属离子络合作用清除自由
基( 还有研究者发现,"$- !余甘子对酶性及非酶性体
系产生的bJ"+和+bZ具有明显的清除作用!并发
现余甘子能抑制 P^" a诱发卵黄脂蛋白不饱和脂肪
酸"G_^.#过氧化作用!认为这些抗氧化活性与余甘
子中存在着以丰富的mEMb/为代表的抗氧化物质
有关( 由此可知!余甘子的抗氧化活性可能是由酚
类物质mEMb/等多种有效成分共同作用的结果(
本研究发现!余甘子精粉在抗脂质过氧化能力
铁还原能力提高 Z
"
b
"
损伤的 MZ(Mf%f细胞相对
存活率方面都表现出一定的抗氧化活性!尤其当浓
度达到一定范围时活性更加显著!但与 mE相比!各
检测指标达到同一水平时!所用精粉浓度往往高于
mE" 至 % 倍( 这可能是由于余甘子精粉并非单一
成分!它是含有上述多种成分的复合体!其中 mE抗
氧化作用表现在可以与b
"
J
Zbb
J及bZ J迅速反
应!生成半脱氢抗坏血酸!清除单线态氧!还原硫自
由基!依靠可逆的脱氢反应来完成其抗氧化作
用,""- ( Mb/能够催化 b
"
J发生歧化反应形成
Z
"
b
"
!Z
"
b
"
通过酶促体系分解成Z
"
b和b
"
!最后清
除b
"
J,",-
( 酚类物质则是由于其羟基取代的高反
应性和吞噬自由基的能力而具有很好的抗氧化活
性,")- ( 因此分析!余甘子精粉的抗氧化活性是通过
多种成分多途径协同作用的结果( 由于经过浓缩
处理!精粉不仅在有效成分含量上优于果汁!其稳定
性和易于保存的特点也是果汁所不能及!下一步将
通过提取分离活性追踪!去除其中与抗氧化活性不
相关的成分!得到更纯的有效成分!从而进一步提高
余甘子精粉的抗氧化活性(
参考文献!
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J*2
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59R E@T5V595UB5D@,k-2k>WB957bQ3O@9>U@5B45=>7>:T! "###! +"
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食品与发酵工业! "##!,""%#$ $%$ J$%)2
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化工艺,k-2食品科学! "#$%! ,""#$ "% J"*2
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RBT69:>9 0*12(@&*4%$+52,)( H259R 59O6(>Y6R5O6>9 >QO@PUB>RW=O
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,$#- 15e5D@645.!b@O585C!C5DWR51!$&(2.9O6>Y6R5O6VPPQP=OD>Q
Q7WV5DO5O69!59R 6OD45;>B4PO5A>76OPD,k-2f5e
!
:5eW h5DD@6! "##$
!$"$ "$#$ $$, J$$2
,$$- -P9?6PN^ ! MOB569 kk2F@P P^B6=0PRW=69:.A676OT>QG75D45
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