全 文 ：书高能混合粒子场处理种子对龙牧８０３
苜蓿 犕２代的抗寒性影响
尚晨１，韩贵清２，陈积山２，刘杰琳２，张月学２，
唐凤兰２，韩微波２，蒿若超２，刘凤歧２
（１．哈尔滨师范大学，黑龙江 哈尔滨１５００８６；２．黑龙江省农业科学院草业所，黑龙江 哈尔滨１５００８６）
摘要：利用高能粒子处理紫花苜蓿干种子，观测龙牧８０３苜蓿 Ｍ２代在秋末冬初低温条件下叶片游离脯氨酸含量
（Ｐｒｏ）、过氧化物歧化酶活性（ＳＯＤ）、可溶性糖含量（ＬＳＳＣ）、叶绿素ａ含量（Ｃｈｌａ）和叶绿素ｂ含量（Ｃｈｌｂ）。结果表
明，高能粒子处理在秋末冬初低温条件下 Ｍ２代的抗寒性指标显著高于对照（犘＜０．０５）；随着辐照剂量的增大，Ｍ２
代叶片Ｐｒｏ含量、ＳＯＤ酶活性、ＬＳＳＣ含量、Ｃｈｌ含量明显递减。低剂量辐照下 Ｍ２代获得的抗寒性强于高剂量辐
照，由此确定苜蓿的最佳高能粒子辐照剂量为１４５Ｇｙ，其次是１９５Ｇｙ。
关键词：高能粒子；苜蓿；龙牧８０３；抗寒性
中图分类号：Ｓ５５１＋．７０３．５；Ｑ９４５．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０６０１６４０５
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是世界上分布范围最广的豆科牧草，也是我国种植面积最大的人工牧草［１］。在
我国北方高纬度、高海拔地区，苜蓿普遍存在越冬率低，容易发生冻害和死亡的现象。因此在选育品种和引种驯
化过程中，品种的抗寒性是考虑的重要因素之一。因此开展苜蓿抗寒性研究，提高越冬率，是紫花苜蓿研究的热
点问题之一［２］。自从１９８７年全国牧草品种审定委员会正式成立以来，我国苜蓿育种取得了较快发展，在抗寒品
种选育方面已经育成很多品种，其主要采用传统的常规育种方法，现代育种技术在苜蓿育种中的应用相对较
低［３］。近年来，我国将卫星搭载（航天育种）与常规育种、杂种优势利用和生物技术等相结合，加速了育种进程，提
高了育种效率［４］。中国农业科学院航天育种研究中心等单位利用地面加速器产生的高能单粒子和混合粒子，以
及屏蔽了地球磁场的零磁空间等模拟航天环境因素，从粒子生物学、物理场生物学和重力生物学等不同角度研究
了航天环境各因素对小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、牧草等作物的诱变效应与分子机理，探索
建立起地面模拟航天环境诱变育种技术方法，并培育出水稻和牧草新品种。尽管如此，目前国内外还不能对航天
环境中的各种诱变因素做出综合模拟，但在单因素（高能粒子或伽玛射线）模拟方面已取得进展［５］。研究认为，辐
射育种在创新种质、培育新品种方面具有独特的优势［６］。目前我国航天育种的研究应用总体上还处在初级发展
阶段，在作物空间环境响应或诱变机理、提高突变预见性和选择效率等基础研究方面明显滞后于应用研究。为了
适应航天技术发展的需要，结合地面模拟试验，进一步探讨诱变环境因素影响植物生长发育的规律，对生物体遗
传稳定性和变异的影响，本研究利用高能粒子场进行不同辐照剂量处理种子，研究龙牧８０３苜蓿 Ｍ２代低温下的
生理变化，探究高能粒子处理对苜蓿抗寒性的辐射效应，旨在为我国苜蓿辐射育种提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验地概况
试验在黑龙江农业科学院草业所试验地进行。试验地地理位置为北纬４５．２°，东经１２２．６°；最高气温３８℃，
最低气温－３０℃，无霜期１３９ｄ左右，年平均风速３．３ｍ／ｓ，属大陆性季风气候，≥１０℃年活动积温２８８７℃，土壤
为黑土。
１．２ 供试材料
２００４年，通过北京正负电子对撞机（ＢＥＰＣ）直线加速器Ｅ２束流打靶产生多种次级粒子束的混合粒子辐射场
１６４－１６８
２００９年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第６期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
收稿日期：２００９０１１２；改回日期：２００９０２１０
作者简介：尚晨（１９８２），男，黑龙江哈尔滨人，在读博士。
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｇｓｃｊｓ２００８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
（ＣＲ）处理紫花苜蓿龙牧８０３干种子，设有５种辐照剂量（１０９，１４５，１９５，２８４，５６０Ｇｙ），每一剂量辐照干种子共３０
粒。２００５年３月，在黑龙江农业科学院草业所试验地，将处理的龙牧８０３干种子（Ｍ１）进行大田种植。由于诱变
Ｍ１不作为品种选育世代，成熟期Ｍ１代收获的种子分别按照５种剂量进行单株单收（Ｍ２），２００７年对Ｍ２代种子
继续进行种植。２００８年秋末冬初，哈尔滨地区日平均气温只有３℃左右。根据 Ｍ２代田间的生长性状、品质表
现，２００８年１０月２１日下午，采用龙牧８０３苜蓿 Ｍ２代健株大小一致的功能叶样分别来自３种辐照剂量（１４５，１９５
和２８４Ｇｙ）。将采集的叶片（３次重复）立即放入自封塑料袋中，带回实验室进行测定。
１．３ 测定指标及方法
１．３．１ 游离脯氨酸含量采用茚三酮比色法测定［７］ 称叶样０．５０ｇ，剪碎置于试管中，加３％磺基水杨酸５ｍＬ加
塞，沸水中浸提１０ｍｉｎ，冷却，取提取液２ｍＬ，加冰乙酸２ｍＬ、水２ｍＬ及２．５％酸性茚三酮４ｍＬ，沸水浴中显
色６０ｍｉｎ，冷却，以４ｍＬ甲苯萃取，测ＯＤ５２０值，并以μｇ／ｇＦＷ为单位。
１．３．２ 超氧化物歧化酶活性采用ＮＢＴ光还原法测定［８］ 取１ｇ样品，加入１．５ｍＬ６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ为７．８）
的磷酸缓冲液于冰浴中研磨（研前加入适量ＰＶＰ），１２０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１５ｍｉｎ，上清液为酶液，４℃冰箱保存
备用。６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ为７．８的磷酸缓冲液４ｍＬ，０．０６ｍｏｌ／Ｌ核黄素０．２ｍＬ，３０ｍｍｏｌ／Ｌ氮蓝四唑（ＮＢＴ）
０．２ｍＬ和适量酶液，用缓冲液作空白对照（用缓冲液代替 ＮＢＴ），以不加酶液用缓冲液代替为最大光化还原
（ＯＤｍａｘ）。将各管于４０００ｌｘ下光照２５ｍｉｎ进行光化还原，测定反应液ＯＤ５６０值，Ｕ＝（ＯＤｍａｘ－ＯＤ５６０）／（ＯＤｍａｘ／
２），其单位Ｕ／ｇＦＷ。
１．３．３ 可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定［９］ 称取叶片０．２～０．３ｇ，放入试管中，加入５ｍＬ蒸馏水在沸水浴
中提取３０ｍｉｎ（提取２次）。提取液过滤入５０ｍＬ容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。吸取样品提取
液０．５ｍＬ于刻度试管中，依次加入１．５ｍＬ水，０．５ｍＬ乙酸乙酯和５ｍＬ浓硫酸，充分振荡，放入沸水浴中保温
１ｍｉｎ，冷却至室温，以空白作参比，在６３０ｎｍ测其吸光值，根据标准曲线计算出可溶性糖的含量ｍｇ／ｇＦＷ。
１．３．４ 叶绿素含量采用丙酮法测定［１０］ 植株中部向阳面成熟叶片０．２ｇ，８０％丙酮＋９５％乙醇水浴５０℃避光浸
提２４ｈ，立即用７２２型分光光度计，在波长为６４５和６６３ｎｍ处测定光密度值。以原提取液为空白溶液，每一测
定，设重复３次。用Ａｒｎｏｎ法［１０］的修正公式分别计算叶绿素ａ、ｂ及叶绿素总量的浓度及含量ｍｇ／ｇＦＷ。
２ 结果与分析
２．１ 游离脯氨酸含量的变化
脯氨酸绝对含量的增加有利于提高苜蓿的抗寒
性［１１］。试验表明（表１），不同辐照剂量下的 Ｍ２代，在
低温条件下，叶片游离脯氨酸含量均高于对照且差异
显著（犘＜０．０５），其中１４５Ｇｙ处理的游离脯氨酸含量
最高（０．０６０±０．００５μｇ／ｇＦＷ），其次是１９５Ｇｙ（０．０４８
±０．００２μｇ／ｇＦＷ），最少是２８４Ｇｙ（０．０４７±０．００２
μｇ／ｇＦＷ）。与对照相比（表１），辐照处理的 Ｍ２代体
内游离脯氨酸含量平均提高４１％。在低温条件下，３
种处理 Ｍ２代积累的游离脯氨酸百分比不同（表１），
随着辐照剂量变大，游离脯氨酸积累量依次下降，但与
对照相比其绝对含量仍然较高，其中１４５Ｇｙ处理的
Ｍ２代植株低温下叶片游离脯氨酸含量最高。
表１ 低温对龙牧８０３苜蓿 犕２代游离脯氨酸含量的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕２’狊犘狉狅狅犳犔狅狀犵犿狌犖狅．８０３
犪犾犳犪犾犳犪狊狌犫犼犲犮狋犲犱狋狅犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋
处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １４５Ｇｙ １９５Ｇｙ ２８４Ｇｙ 平均 Ｍｅａｎ
对照ＣＫ（μｇ／ｇ） ０．０３６Ａｂ ０．０３６Ａｂ ０．０３６Ａｂ
辐照Ｒａｄｉａｔｉｏｎ（μｇ／ｇ）０．０６０Ａａ ０．０４８Ａａ ０．０４７Ａｂ
增加Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（％） ６４．０ ３１．０ ２８．０ ４１．０
注：大写字母表示犘＜０．０１水平显著，小写字母表示犘＜０．０５水平显
著，同列中标注相同字母的值之间差异不显著，下同。
Ｎｏｔｅ：Ｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｓｔａｎｄｆｏｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｅｖｅｌｓａｔ犘＜０．０１，ｓｍａｌ
ｌｅｔｔｅｒｓｓｔａｎｄｆｏｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｅｖｅｌｓａｔ犘＜０．０５，ｖａｌｕｅｓｆｏｌｏｗｅｄｂｙａ
ｃｏｍｍｏｎｌｅｔｔｅｒｗｉｔｈｉｎａｒａｎｋａｒｅｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ，ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．２ 超氧化物歧化酶活性的变化
不同辐照剂量处理下 Ｍ２代获得的超氧化物歧化酶活性差异显著（犘＜０．０５）（表２）。剂量１４５Ｇｙ处理可以
使 Ｍ２代在低温条件下获得最高的超氧化物歧化酶活性（０．３９４±０．０３６Ｕ／ｇＦＷ），剂量２８４Ｇｙ处理获得最小，
剂量１９５Ｇｙ处理居中。与对照相比（表２），辐照处理使 Ｍ２代植株获得ＳＯＤ酶活性含量平均提高６．９％，不同
剂量处理使 Ｍ２代植株积累的ＳＯＤ含量百分比不同。随着辐照剂量的变大，ＳＯＤ积累量依次降低。其中剂量
５６１第１８卷第６期 草业学报２００９年
１４５Ｇｙ处理可使 Ｍ２代植株获得较高的ＳＯＤ酶活性，在低温下清除更多的氧自由基，从而降低了膜脂过氧化从
而避免了膜系统受损，最终使组织受到保护。
２．３ 可溶性糖（ＬＳＳＣ）含量的变化
试验表明（表３），在低温条件下，不同剂量诱变的 Ｍ２代植株体内积累的ＬＳＳＣ含量差异显著（犘＜０．０５）。
１４５Ｇｙ剂量处理能使 Ｍ２代获得ＬＳＳＣ含量最多（２６．７７２±０．００２ｍｇ／ｇＦＷ），与对照比较，３种处理的绝对
ＬＳＳＣ含量平均提高６．９％。３种处理 Ｍ２代在低温条件下，随着剂量的变大，ＬＳＳＣ积累量依次降低。其中１４５
Ｇｙ处理使 Ｍ２代植株ＬＳＳＣ含量提高，最终产生对不良因子的抗性，使得组织受到保护。
表２ 低温对龙牧８０３苜蓿 犕２代犛犗犇酶活性的影响
犜犪犫犾犲２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕２’狊犛犗犇犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犔狅狀犵犿狌犖狅．８０３
犪犾犳犪犾犳犪狊狌犫犼犲犮狋犲犱狋狅犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋
处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １４５Ｇｙ １９５Ｇｙ ２８４Ｇｙ 平均 Ｍｅａｎ
对照ＣＫ（Ｕ／ｇ） ０．２６３Ｂｃ ０．２６３Ｂｃ ０．２６３Ｂｃ
辐照Ｒａｄｉａｔｉｏｎ（Ｕ／ｇ） ０．３９４Ａａ ０．３３１Ｂｂ ０．２７１Ｂｃ
增加Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（％） １３．０ ６．８ ０．８ ６．９
表３ 低温对龙牧８０３苜蓿 犕２代可溶性糖含量的影响
犜犪犫犾犲３ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕２’狊犔犛犛犆狅犳犔狅狀犵犿狌犖狅．８０３
犪犾犳犪犾犳犪狊狌犫犼犲犮狋犲犱狋狅犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲
处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １４５Ｇｙ １９５Ｇｙ ２８４Ｇｙ 平均 Ｍｅａｎ
对照ＣＫ（ｍｇ／ｇ） ２６．７７２Ａｂ２６．７７２Ａｂ２６．７７２Ａｂ
辐照Ｒａｄｉａｔｉｏｎ（ｍｇ／ｇ）３７．２１０Ａａ３１．７２２Ａａ２８．２７７Ａｂ
增加Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（％） １０．０ ４．９ １．５ ５．６
２．４ 叶绿素含量的变化
在低温条件下，不同剂量处理下的 Ｍ２代叶片叶绿素含量差异显著（犘＜０．０５）（表４）。不同剂量处理使 Ｍ２
代叶片叶绿素ａ含量在低温条件下均高于对照，其中１４５，１９５和２８４Ｇｙ处理使 Ｍ２代叶绿素ａ含量分别提高
７．７％，６．１％，４．４％，平均提高６．０％；叶绿素ｂ含量在低温条件下不完全高于对照，除１４５Ｇｙ外，１９５和２８４Ｇｙ
处理使 Ｍ２代叶绿素ｂ含量比对照分别下降－０．９５％和－０．３９％。与对照相比，叶绿素含量随剂量的变大而降
低，说明不同剂量处理对植株叶绿素的合成有一定的刺激作用，但超出一定剂量范围后，将抑制叶绿素合成酶的
活性，从而阻碍了叶绿素的合成，导致植株叶绿素含量急剧下降［１３］，特别表现在处理对 Ｍ２代叶片叶绿素ｂ的影
响大于对叶绿素ａ的影响。叶绿素ａ和ｂ含量随剂量的变大而降低，但 Ｍ２代叶片叶绿素总量仍然维持比对照
较高的水平，表明低剂量处理更有利于 Ｍ２代低温下叶片叶绿素总含量的提高。
表４ 低温对龙牧８０３苜蓿 犕２代犆犺犾含量的影响
犜犪犫犾犲４ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕２’狊犆犺犾狅犳犔狅狀犵犿狌犖狅．８０３犪犾犳犪犾犳犪狊狌犫犼犲犮狋犲犱狋狅犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋
项目Ｉｔｅｍ 处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １４５Ｇｙ １９５Ｇｙ ２８４Ｇｙ 平均 Ｍｅａｎ
叶绿素ａＣｈｌａ
对照ＣＫ（ｍｇ／ｇ） ０．４７１Ａｂ ０．４７１Ａｂ ０．４７１Ａｂ
辐照Ｒａｄｉａｔｉｏｎ（ｍｇ／ｇ） ０．５４９Ａａ ０．５３２Ａｂ ０．５１３Ａｂ
增加Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（％） ７．７ ６．１ ４．１ ６．００
叶绿素ｂＣｈｌｂ
对照ＣＫ（ｍｇ／ｇ） ０．２０７Ａｂ ０．２０７Ａｂ ０．２０７Ａｂ
辐照Ｒａｄｉａｔｉｏｎ（ｍｇ／ｇ） ０．２２４Ａａ ０．２０３Ａｂ ０．１９７Ａｂ
增加Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（％） １．７０ －０．９５ －０．３９ １．３０
叶绿素总量ａ＋ｂＣｈｌ（ａ＋ｂ） 增加Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（％） ９．４０ ５．１５ ３．７１ ６．１０
３ 讨论
游离脯氨酸作为细胞质的渗透调节物质在植物对抗低温胁迫时起到平衡细胞代谢的作用，以保持细胞内环
境的相对稳定［１２］。在植物体内它能增加细胞液的浓度，对原生质具有保护作用［１３］。大量研究表明，胁迫下植物
体内游离脯氨酸含量与植物抗寒性之间存在相关性［１４］。本试验表明，辐照剂量１４５Ｇｙ处理的 Ｍ２代植株低温
下叶片Ｐｒｏ含量最高，Ｍ２代获得的抗寒性最强。
６６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
在不同的逆境下，植物会通过调动各种酶和整个防御系统来抵抗逆境诱导的氧化伤害，以减少活性氧的积
累，降低膜伤害程度［１５］。一般情况下，细胞内的活性氧与防御系统之间保持着平衡［１６］。研究表明，ＳＯＤ和ＰＯＤ
作为植物系统防御外界不良环境的保护酶，其酶活性与植物抗寒性呈一定的相关性［１７，１８］。多数研究认为［１９～２１］，
抗寒性强的植物在低温胁迫下，ＳＯＤ和ＰＯＤ等保护酶系统仍能维持较高的活性水平，因而防止了因冷害产生的
毒害物质如活性氧自由基的积累，减轻了由膜脂过氧化所引起的膜伤害，从而增加了机体的抗寒能力。这与试验
结果一致。
可溶性糖是高等植物体内重要的渗透调节物质。在逆境条件下，植物会在逆境信号的诱导下诱导渗透调节
物质超量合成。这些物质的积累能够提高细胞的渗透调节能力，降低因渗透失水造成对细胞膜、酶及蛋白质结构
与功能的伤害，在调节植物对环境胁迫的适应性，提高植物对各种胁迫因子抗性等方面起着十分重要的作用［２２］。
在寒冷胁迫下所有植物组织中的可溶性糖含量都会升高是一个普遍现象［２３］。秋季随着气温下降苜蓿根中可溶
性糖含量持续增加，尤其是在１１月间，豆科牧草根内会积累较多的可溶性糖［２４］。本试验表明，辐照剂量１４５Ｇｙ
处理使 Ｍ２代植株提高了ＬＳＳＣ含量，最终产生抗寒性保护了组织。
叶绿素作为植物进行光合作用的主要色素，其含量高低可直接反映光合作用能力的强弱。如果植物叶片叶
绿素含量低，光合作用弱，那么对植物生长不利［２５］。在逆境环境下，植物感知胁迫作用后，通常表现出光合作用
下降，光合色素含量降低［２６］。本试验表明，低剂量处理更有利于 Ｍ２代低温下叶片叶绿素总含量的提高，增强植
物的抗寒性。
高能粒子处理紫花苜蓿种子提高了苜蓿的抗寒性，表现在低温条件下，辐照剂量越高，辐射效应越明显，由此
确定最佳处理剂量１４５Ｇｙ，其次为１９５Ｇｙ处理。２８４Ｇｙ处理效果最差，但更广泛的处理剂量范围还需进一步探
讨。利用高能粒子场处理技术探索辐射育种的机理仍需要深入研究。
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ＳＨＡＮＧＣｈｅｎ１，ＨＡＮＧｕｉｑｉｎｇ２，ＣＨＥＮＪｉｓｈａｎ２，ＬＩＵＪｉｅｌｉｎ２，ＺＨＡＮＧＹｕｅｘｕｅ２，
ＴＡＮＧＦｅｎｇｌａｎ２，ＨＡＮＷｅｉｂｏ２，ＨＡＯＲｕｏｃｈａｏ２，ＬＩＵＦｅｎｇｑｉ２
（１．ＨａｒｂｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００８６，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，
ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｒｂｉｎ１５００８６，Ｃｈｉｎａ）
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８６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６