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The effects of lactic acid bacteria inoculation on the fermentation quality and aerobic stability of king grass silage

乳酸菌添加剂对王草青贮发酵品质及有氧稳定性的影响



全 文 :书乳酸菌添加剂对王草青贮发酵
品质及有氧稳定性的影响
刘秦华,张建国,卢小良
(华南农业大学农学院草业科学系,广东 广州510642)
摘要:为提高王草青贮发酵品质与有氧稳定性,对材料水分含量(高、中、低)和添加剂(无添加:CK;乳酸菌 A:LA;
乳酸菌B:LB;乳酸菌A与B混合添加:LA+LB)的影响进行了研究。试验结果表明,所有处理的王草发酵品质都
良好,中水分含量王草的发酵品质优于高水分和低水分。LA对王草发酵品质无显著影响,但使高、中水分含量王
草发酵品质达到最佳。LB与LA+LB显著增加了高、中水分含量王草的pH值(犘<0.05),极显著降低了乳酸/乙
酸、乳酸/总酸和乳酸含量 (犘<0.01),明显增加了乙酸含量。青贮开封后,LB与LA+LB处理的王草青贮料有氧
稳定性较好。
关键词:乳酸菌;王草;青贮;发酵品质;有氧稳定性
中图分类号:S816.6  文献标识码:A  文章编号:10045759(2009)04013107
  王草(犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿狆狌狉狆狌狉犲狌犿×犘.犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿),英文名Kinggrass,又叫皇草、杂交狼尾草、皇竹草等。是
由象草(犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿)和美洲狼尾草(犘.犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿)杂交育成,属热带多年生禾本科牧草[1]。王草可以通过
种茎进行无性繁殖,一年能刈割4~5次,亩产鲜草10t左右,适口性较好。近年来,拉美热带、亚热带国家对王
草青贮发酵品质进行了研究,并以此作为促进畜牧业发展的重要途径[2,3]。自1983年中国从哥伦比亚引种后,许
多学者对王草栽培技术、生物产量、饲用价值等进行了研究[4~6],但关于王草青贮发酵品质及有氧稳定性的研究
较少。
青贮是指厌氧条件下经乳酸发酵来贮藏牧草的方法,当乳酸发酵占优势并抑制有害微生物活动时就可以获
得较佳的青贮饲料。Michelena等[2]通过萎焉或添加甲酸或丙酸提高了王草的发酵品质,但由于操作安全及成
本方面的原因,甲酸或丙酸在生产上的应用并不普遍。近年来,研究证明添加乳酸菌可以提高象草的发酵品质和
有氧稳定性[7,8],但对王草的影响尚不清楚。因此,本研究通过预干(调节水分含量)和添加乳酸菌,研究其青贮
特性,为王草青贮加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2007年10月26日收割株高1.8~2.0m的王草为试验材料。添加剂分别为鼠李糖乳杆菌(犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊
狉犺犪犿狀狅狊狌狊,从青贮饲料中分离所得,含活菌1.0×1010cfu/g)、布氏乳杆菌(犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犫狌犮犺狀犲狉犻,含活菌4.0×
1010cfu/g)粉剂(PioneerHiBredInternationalInc.,U.S.A)。
1.2 试验设计
对高、中、低含水量的王草材料(室温自然风干4,12和24h)进行如下处理:无添加(CK)、添加鼠李糖乳杆菌
(LA)4.0×105cfu/gFM、添加布氏乳杆菌(LB)4.0×105cfu/gFM,添加鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌(LA+LB)
各2.0×105cfu/gFM,每个处理3个重复。
1.3 试验方法
1.3.1 青贮饲料的调制 王草切短至20~30mm后,混匀,室温自然风干获取高、中、低含水量的王草材料,然
第18卷 第4期
Vol.18,No.4
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA   
131-137
2009年8月
 收稿日期:20080731;改回日期:20081229
基金项目:华南农业大学高级人才引进基金,“十一五”国家科技支撑项目(2006BAD16B0308)和公益性行业(农业)科研专项经费项目(ny
hyzx07022)资助。
作者简介:刘秦华(1983),男,重庆璧山人,在读硕士。
通讯作者。Email:zhangjg@scau.edu.cn
后分别经过不同添加剂处理后再次混匀并装入30cm×20cm的聚乙烯青贮袋中,每袋200g,用真空打包机
(SINBOVacuumSealer)抽真空后密封,置于室温贮藏200d后开封。
1.3.2 材料成分及微生物分析 干物质(DM)含量采用70℃干燥法测定,粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定,粗
脂肪含量采用残余法测定,粗灰分含量采用灼烧法测定[9]。可溶性碳水化合物(watersolublecarbohydrates,
WSC)含量采用蒽酮-硫酸法测定[10],氨态氮(NH3-N)含量用凯氏定氮仪(杭州托普 QSYII)进行直接蒸馏测
定,缓冲能采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定[11],粗纤维(CF)含量采用滤袋法测定[9],乳酸菌、细菌、酵母菌和霉菌
数量分别采用 MRS(deManRogosaSharpe)琼脂培养基、营养琼脂培养基(nutrientagar)、马铃薯葡萄糖琼脂培
养基(potatodextroseaga)计数[12]。乳酸菌用厌氧箱(YQXⅡ型),37℃培养2d;细菌、酵母菌、霉菌在有氧条件
下37℃培养2~4d。
1.3.3 发酵品质分析 在青贮袋开封后取20g混匀的青贮饲料放入聚乙烯塑料封口袋中,加入80mL蒸馏水,
冰箱里4℃下浸泡18h后过滤,用pH计(PHS3C)测定浸提液pH值。有机酸含量采用Agilent1100型高效液
相色谱仪测定[13]:浸提液加入少量阳离子交换树脂,在12000r/mim下离心3min后,0.45μm微孔滤膜过滤后
测定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。色谱条件:色谱柱(RSpakKC811昭和电气),流动相为3mmol/L的高氯酸溶
液,流速1mL/mim,柱温为室温(22~27℃),检测波长210nm。NH3-N含量用凯氏定氮仪直接蒸馏测定。
1.3.4 VScore评分 VScore评分体系[14]是以青贮饲料中的NH3-N和挥发性脂肪酸(VFA)含量多少来评
定发酵品质的优劣,满分为100分。根据这个评分,将青贮饲料品质分为良好(>80分)、尚可(60~80分)、不良
(<60分)3个级别。
1.3.5 有氧稳定性分析 青贮袋开封后,混匀样品,然后取出一部分进行发酵品质分析,剩下的样品不封口放
置,进行有氧稳定性分析。分别于开封后72,144和216h取出袋中已混匀样品20g,测定pH值。pH值上升幅
度小,有氧稳定性则较好,反之则较差。
1.4 数据处理
试验数据采用Excel和SPSS10软件进行方差分析,并用Duncan法对均值进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 青贮原料化学成分
一般认为,在不使用添加剂青贮时,对于植物来说,鲜物质中 WSC含量为25~35g/kg是成功青贮的最小含
量[15]。本试验所用王草粗蛋白含量、WSC含量、缓冲能较低,粗纤维含量较高,乳酸菌、细菌、酵母菌较多(表1)。
因此,WSC含量低可能是限制王草成功青贮的主要因素。
2.2 王草青贮发酵品质
2.2.1 含水量对王草发酵品质的影响 一般来说,青贮饲料调制需要原料含水量适中(60%~70%)。原料水分
过低,不易压实,容易引起发霉变质,导致营养物质损失和过度产热。原料水分过高,可溶性营养物质容易随渗出
液流失并导致梭菌发酵[16,17]。含水量对pH值、NH3-N、乳酸、乙酸、丙酸、乳酸/乙酸和乳酸/总酸有极显著影
响(犘<0.01)(表2)。随着含水量的降低,CK组pH值、乙酸含量增加(犘<0.01),乳酸/乙酸、乳酸/总酸和乳酸
含量降低(犘<0.01),NH3-N含量降低(犘<0.05),说明随着水分含量的降低乳酸发酵转变为乙酸发酵。这与
Panditharatne等[18]报道的高水分条件下象草以乙酸发酵为主的结果不一致,与Yokota等[19]报道的象草高水分
条件下的乳酸发酵为主相一致,其可能原因是王草的缓冲能较低,WSC能够满足乳酸菌繁殖,在水分含量适宜时
以同型乳酸发酵为主,亏缺时以异型乳酸发酵为主。随水分含量降低,LA组pH值增加(犘<0.01),乳酸/乙酸、
乳酸/总酸和NH3-N含量降低(犘<0.05);LB和LA+LB组乳酸含量增加,pH值降低,并且中水分条件下的
NH3-N含量>高水分>低水分。从评分结果来看(图1),无论是无添加还是乳酸菌处理,高含水量和低含水量
王草的发酵品质都低于中含水量。其可能原因是高与低含水量王草青贮料乙酸、丙酸含量较高。
2.2.2 乳酸菌对王草发酵品质的影响 一般来说,成功调制青贮饲料的关键在于促进乳酸菌的大量繁殖。通常
情况下,材料上附着的乳酸菌远少于好气性微生物(好气细菌和真菌等)[20],在厌氧条件下,当材料水分、缓冲能、
231 ACTAPRATACULTURAESINICA(2009) Vol.18,No.4
  表1 青贮前王草化学成分
犜犪犫犾犲1 犅犲犳狅狉犲犲狀狊犻犾犻狀犵狋犺犲犮犺犲犿犻犮犪犾犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狅犳犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿×犘.犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿
项目Item 高水分 Highmoisture 中水分 Moderatemoisture 低水分Lowmoisture
干物质Drymatter(DM,%) 26.32 39.76 71.12
粗蛋白Crudeprotein(% DM) 3.71 3.39 4.34
粗脂肪Crudefat(% DM) 1.45 1.34 1.62
粗纤维Crudefiber(% DM) 31.44 34.24 30.53
粗灰分Crudeash(% DM) 5.19 5.20 6.34
无氮浸出物 Nitrogenfreeextract(% DM) 58.22 55.82 57.17
可溶性碳水化合物 Watersolublecarbohydrates(% DM) 6.99 5.98 6.59
NH3-N(% TN) 0.026 0.021 0.006
pH值pHvalue 5.30 5.03 5.30
缓冲能Bufferingcapacity(mE/kgDM) 97.83 76.63 92.10
乳酸菌Lacticacidbacteria(Logcfu/gFM) 7.59 7.43 7.16
好气细菌 Aerobicbacteria(Logcfu/gFM) 7.66 8.58 8.34
酵母菌 Yeast(Logcfu/gFM) 5.04 5.11 4.70
霉菌 Mold(Logcfu/gFM) 1.00 1.00 3.70
 TN:总氮含量Totalnitrogen;FM:鲜物质Freshmatter;Log:菌数取对数Denarylogarithmofthenumbersofbacteria.
表2 乳酸菌对不同含水量王草发酵品质的影响
犜犪犫犾犲2 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪狅狀狋犺犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狇狌犪犾犻狋狔狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿狅犻狊狋狌狉犲犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿×犘.犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿狊犻犾犪犵犲
水分
Moisture
添加剂
Additives
DM
(%)
pH值
pHvalue
NH3-N
(% TN)
乳酸
Lacticacid
(%FM)
乙酸
Aceticacid
(%FM)
丙酸
Propionicacid
(%FM)
丁酸
Butyricacid
(%FM)
乳酸/乙酸
Lacticacid/
aceticacid
乳酸/总酸
Lacticacid/
totalacid
低水分
Low
moisture
CK 67.81A 4.77A 4.61d 0.30E 1.16A 0.24AB 0.00 0.27B 0.18C
LA 66.15AB 4.74AB 4.73d 0.63BCDE0.71ABC 0.22AB 0.00 1.01B 0.39B
LB 64.55BC 4.32CD 4.85d 0.59CDE 0.59BCD 0.20AB 0.00 0.99B 0.42B
LA+LB 62.82C 4.41CD 4.98d 0.89ABCD0.83AB 0.32A 0.00 1.14B 0.44B
中水分
Moderate
moisture
CK 35.81D 4.20CDE15.34bc 1.09ABC 0.33CD 0.25AB 0.00 3.42A 0.66A
LA 35.30D 4.13DE 13.70bc 1.20AB 0.32D 0.25AB 0.00 3.77A 0.68A
LB 32.75D 4.41CD 20.36a 0.22E 0.51BCD 0.12B 0.00 0.43B 0.26BC
LA+LB 33.99D 4.43CD 19.60a 0.48DE 0.44BCD 0.13B 0.00 1.11B 0.45B
高水分
High
moisture
CK 24.10E 3.96E 12.85c 1.23A 0.33CD 0.19AB 0.00 3.97A 0.70A
LA 24.41E 3.95E 12.70c 0.95ABC 0.28D 0.14B 0.00 3.42A 0.68A
LB 23.01E 4.48BC 16.24b 0.40DE 0.69ABCD 0.17AB 0.11 0.61B 0.30BC
LA+LB 24.38E 4.46BC 15.15bc 0.14E 0.70ABCD 0.16AB 0.00 0.20B 0.14C
标准误SE 0.009 0.067 0.973 0.131 0.108 0.035 0.032 0.404 0.044
显著性
Signifi
cance
水分 Moisture    N   N  
乳酸菌Lacticacidbacteria     N N N  
交互Interaction   N   N N  
 同列大写字母不同者为差异极显著(犘<0.01),同列小写字母不同者为差异显著(犘<0.05);表示0.05水平作用显著;表示0.01水平作用
显著;N表示作用不显著。
 Valueswithinthesamecolumnwithdifferentlowercaseandcapitalletterdiffersignificantlyfromeachotherat犘<0.05and犘<0.01,respectively;
and:Significantat犘<0.05and0.01,respectively;N:Notsignificant.CK:Noadditive;LA:LacticacidbacteriaA;LB:LacticbacteriaB;
LA+LB:LacticacidbacteriaAandB.
331第18卷第4期 草业学报2009年
WSC含量适宜时,附着的乳酸菌大量繁殖,青贮环境
图1 王草青贮料犞犛狅狉犲得分
犉犻犵.1 犞犛狅狉犲狊狅犳狏犪狉犻狅狌狊犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿×
犘.犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿狊犻犾犪犵犲
CK:Noadditive;LA:LacticacidbacteriaA;LB:Lactic
bacteriaB;LA+LB:LacticacidbacteriaAandB
pH值迅速降低,有害菌(大肠杆菌、梭菌、牙孢杆
菌、酵母菌、霉菌等)受到抑制。然而,光靠材料上附
着的乳酸菌进行乳酸发酵来获得优质青贮饲料较为
困难,特别是 WSC含量较低的热带牧草[20]。近年
来,各国研究实践证明接种产酸能力强的乳酸菌提
高牧草发酵品质经济有效[21~23],然而这些研究多针
对温带牧草或作物而言。Uchida和Kitamura[24]指
出接种乳酸菌到 WSC含量低的热带牧草中对改善
发酵品质的效果不明显。然而从表2可知,乳酸菌
添加对pH值有显著影响(犘<0.05),对NH3-N、
乳酸、乳酸/乙酸和乳酸/总酸有极显著影响(犘<
0.01)。另外,在低含水量组中,添加乳酸菌有降低
pH值、乙酸、丙酸含量,增加乳酸/乙酸、乳酸/总
酸、乳酸含量的趋势,说明添加乳酸菌能够提高低含水量王草乳酸的转化效率;LB或LA+LB对降低pH值的效
果比LA好(犘<0.01),其原因可能是LA耐低水分的能力比LB差。在中水分含量组中,与CK相比,LA处理
对所有指标都无显著影响(犘>0.05);LB和LA+LB处理降低了乳酸/乙酸、乳酸/总酸和乳酸含量(犘<0.01),
增加了NH3-N含量(犘<0.05)。在高含水量王草中,与CK相比,LA处理对所有指标都无显著影响(犘>
0.05);LB处理增加了pH值(犘<0.01),降低了乳酸/乙酸、乳酸/总酸和乳酸含量(犘<0.01),增加了NH3-N
和乙酸含量(犘<0.05),并产生了丁酸;LA+LB增加了pH值(犘<0.01),降低了乳酸/乙酸、乳酸/总酸和乳酸
含量(犘<0.01),增加了乙酸含量(犘<0.05)。总体来看,在高、中含水量条件下,LA在促进乳酸发酵方面好于
LB与LA+LB。综上所述,添加LA可以改善高、中水分王草的发酵品质,但并不显著,LB显著地改善了低水分
王草的发酵品质。
2.2.3 乳酸菌与水分含量间交互作用对王草发酵品质的影响 一般来说,适当降低水分活性来抑制有害菌繁殖
或添加乳酸菌促进乳酸发酵是提高发酵品质的有效措施[25,26]。乳酸菌与含水量的交互作用对pH 值、乳酸、乙
酸、乳酸/乙酸和乳酸/总酸有极显著影响(犘<0.01)(表2)。另外,在低水分含量条件下,LA在降低pH值方面
差于LB(犘<0.01);在高、中含水量条件下,LA在降低pH值,增加乳酸/乙酸、乳酸/总酸和乳酸含量方面优于
LB(犘<0.01);不同含水量条件下,LB与LA+LB间无显著差异(犘>0.05)。从评分结果来看,所有处理得分都
高于85分,发酵品质良好,但王草高、中水分条件下添加LA得分最高,发酵品质最佳。
2.3 王草青贮料有氧稳定性
2.3.1 无添加王草青贮料有氧稳定性 青贮袋开封后,厌氧环境立即变成有氧环境,好气微生物开始活动。一
般来说,青贮饲料的好气变质主要是由酵母、霉菌等好气微生物的活动所引起[16]。当青贮饲料暴露于空气中时,
酵母和霉菌会利用青贮发酵产生的乳酸及牧草的氨基酸、蛋白质和糖类,使整个青贮饲料的pH值、CO2、水和氨
气逐渐增加,热量不断释放,好气变质不断加剧[27]。也有报道指出水分含量低、乳酸多的青贮饲料比水分含量
高、挥发性脂肪酸多的材料容易发生好气变质,其原因是由于低水分限制了微生物活动,有更多的糖可供酵母生
育利用,而挥发性脂肪酸(乙酸,丙酸等)比乳酸有更强的抗真菌力[28]。然而,开封后9d内,高、中、低水分含量无
添加王草青贮料pH值变化程度由大到小依次为高水分含量>中水分含量>低水分含量(图2)。这说明低水分
含量无添加王草青贮料的有氧稳定性较佳,原因可能是其乳酸含量(0.30% FM)较低,乙酸(1.4%FM)含量较
高。
2.3.2 乳酸菌对王草青贮饲料有氧稳定性的影响 Muck[29]最早报道了添加进行异型发酵的布氏乳杆菌(犔.
犫狌犮犺狀犲狉犻)可以抑制青贮饲料中酵母和霉菌的生育从而改善有氧稳定性。研究发现,布氏乳杆菌不仅可以直接发
酵果糖或葡萄糖与果糖混合物产生乳酸与乙酸,并且在厌氧条件下还能分解乳酸产生乙酸[30],而乙酸则被认为
431 ACTAPRATACULTURAESINICA(2009) Vol.18,No.4
图2 有氧条件下低、中、高水分含量不同乳酸菌处理的王草青贮料狆犎值变化
犉犻犵.2 狆犎狏犪犾狌犲犮犺犪狀犵犲狊狅犳犾狅狑,犿狅犱犲狉犪狋犲犪狀犱犺犻犵犺犿狅犻狊狋狌狉犲狅犳犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿×犘.犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿
狊犻犾犪犵犲狊犱狌狉犻狀犵狋犺犲犪犲狉狅犫犻犮狆犲狉犻狅犱
CK:Noadditive;LA:LacticacidbacteriaA;LB:LacticbacteriaB;LA+LB:LacticacidbacteriaAandB
可能是抑制好气变质的主要物质[31]。开封后9d内,与CK相比,添加LB或混合添加LA+LB抑制了不同含水
量王草青贮料pH值的变化,单独添加LA促进pH值增加(图2),其原因在于CK与LA处理的乳酸含量高,
NH3-N含量与乙酸、丙酸等挥发性脂肪酸含量较低,发酵品质好,使有氧稳定性变差[32]。添加LB或混合添加
LA+LB使高、中、低水分含量王草青贮料有氧稳定的时间分别为72,144和216h。因此,添加布氏乳杆菌抑制
王草青贮饲料好气变质具有显著效果。
3 结论
不论是否添加乳酸菌,各种含水量的王草都有良好的发酵品质,并以中含水量最佳。添加鼠李糖乳杆菌有改
善高、中、低含水量王草发酵品质的趋势,添加布氏乳杆菌或二者混合添加对高、中含水量王草发酵品质的改善差
于鼠李糖乳杆菌,但在低水分条件下却优于鼠李糖乳杆菌。青贮开封后,添加布氏乳杆菌或布氏乳杆菌与鼠李糖
乳杆菌混合物改善了王草青贮料的有氧稳定性。
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犜犺犲犲犳犳犲犮狋狊狅犳犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪犻狀狅犮狌犾犪狋犻狅狀狅狀狋犺犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狇狌犪犾犻狋狔犪狀犱
犪犲狉狅犫犻犮狊狋犪犫犻犾犻狋狔狅犳犽犻狀犵犵狉犪狊狊狊犻犾犪犵犲
LIUQinhua,ZHANGJianguo,LUXiaoliang
(DepartmentofGrasslandScience,ColegeofAgriculture,SouthChinaAgriculture
University,Guangzhou510642,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Theeffectsofmoisturecontents(high,moderate,andlow)andlacticacidbacteriainoculation(LA,
LB,andLA+LB)onthefermentationqualityandaerobicstabilityofkinggrasssilagewereinvestigated.Al
thesilageswerewelpreserved.Thefermentationqualityofkinggrasssilageswithmoderatemoisturecontent
werebetterthanthosewithhighandlowmoisturecontent.LAinoculationdidnotsignificantlyinfluencethe
fermentationqualityofkinggrasssilage,butthefermentationqualityofkinggrasssilageswithhighandmod
eratemoisturecontentswasincreased.LBorLA+LBinoculationincreasedthepHvalue(犘<0.05)andacetic
acidcontent,butdecreasedlacticacidcontent,theratesoflacticacidtoaceticacidandlacticacidtototalacid
(犘<0.01).Whenthesilagesofkinggrasswereexposedtoair,theaerobicstabilityofLBandLA+LBinocu
latedsilagewerebest.
犓犲狔狑狅狉犱狊:lacticacidbacteria;kinggrass;silage;fermentationquality;aerobicstability
731第18卷第4期 草业学报2009年