全 文 ：林业科学研究　２０１６，２９（３）：３８３ ３８８
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
　　文章编号：１００１１４９８（２０１６）０３０３８３０６
银杏种胚蛋白提取及双向电泳体系的优化
李　佳１，陆秀君１，梅　梅１，２，孙晓梅１，张晓林１
（１．沈阳农业大学林学院，辽宁 沈阳　１１０１６１；２．沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳　１１０１６１）
收稿日期：２０１５１２０７
基金项目：国家自然基金面上项目（Ｎｏ．３１５７０６２１）、辽宁省农业科技攻关项目（Ｎｏ．２０１４２０７００５）
作者简介：李　佳（１９９０—），女，满族，辽宁省本溪市人，在读硕士，主要从事种子蛋白质组学的研究
 通讯作者：陆秀君（１９６６—），沈阳农业大学林学院教授，博士生导师。Ｅｍａｉｌ：ｌｘｊｓｙａｕ＠１２６．ｃｏｍ
摘要：［目的］探索一套适用于银杏种胚蛋白的双向电泳体系，为研究银杏种胚在不同发育阶段的表达差异蛋白提
供基础。［方法］分别从蛋白的不同提取方法（直接提取法、酚提取法、ＴｒｉｓＨＣｌ法、Ｔｒｉｚｏｌ提取法和 ＴＣＡ丙酮 －酚
法）、裂解液中的尿素浓度（６ｍｏｌ·Ｌ－１、７ｍｏｌ·Ｌ－１、８ｍｏｌ·Ｌ－１、９ｍｏｌ·Ｌ－１）蛋白上样量（１５００μｇ、１６５０μｇ、１８００
μｇ）和分离胶浓度（１０％、１２．５％、１５％）四个方面对银杏种胚的蛋白图谱进行分析，筛选出适宜双向电泳的条件。
［结果］采用ＴＣＡ丙酮－酚法提取银杏种胚蛋白，在裂解液中尿素浓度为８ｍｏｌ·Ｌ－１、上样量为１６５０μｇ、分离胶浓
度为１２．５％的方法，可以获得分辨率较高、背景更加清晰、重复性更好的银杏种胚蛋白质双向电泳图谱。［结论］建
立了适合银杏种胚蛋白双向电泳的体系：ＴＣＡ丙酮－酚法制备样品，选取尿素浓度为８ｍｏｌ·Ｌ－１的裂解液提取样品
粉末全蛋白，蛋白上样量控制为１６５０μｇ，第二向分离胶浓度定为１２．５％。
关键词：银杏；种胚；蛋白质；双向电泳
中图分类号：Ｓ７９２．９５ 文献标识码：Ａ
ＥｍｂｒｙｏＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａａｎｄ
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｗｏＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ＬＩＪｉａ１，ＬＵＸｉｕｊｕｎ１，ＭＥＩＭｅｉ１，２，ＳＵＮＸｉａｏｍｅｉ１，ＺＨＡＮＧＸｉａｏｌｉｎ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０１６１，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０１６１，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ａｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ（２ＤＥ）ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍｗａｓｅｘｐｌｏｒｅｄｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
Ｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａｅｍｂｒｙｏ，ａｉｍｉｎｇａｔｌａｙｉｎｇａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｔｈｅ２ＤＥｇｅｌｓｗｅｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｗｉｔｈｄｉｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ（ｄｉｒｅｃｔｅｘｔｒａｃ
ｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｐｈｅｎｏｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ＴｒｉｓＨＣｌｍｅｔｈｏｄ，ＴｒｉｚｏｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＴＣＡａｃｅｔｏｎｅｐｈｅｎｏｌｍｅｔｈｏｄ），ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｕｒｅａｉｎｌｙｓｉｓｂｕｆｅｒ（６ｍｏｌ·Ｌ－１，７ｍｏｌ·Ｌ－１，８ｍｏｌ·Ｌ－１，ａｎｄ９ｍｏｌ·Ｌ－１），ｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎｌｏａｄｉｎｇｄｏｓａｇｅｓ（１５００μｇ，１６５０μｇ，ａｎｄ１８００μｇ）ａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｓｅｐａｒａｔｉｏｎｇｅｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（１０％，
１２．５％，ａｎｄ１５％），ｔｏｓｅｌｅｃｔｔｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｓｙｓｔｅｍｉｎｃｌｕｄｅｓｔｈｅｆｏｌｏｗｉｎｇｓｔｅｐｓ：
ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＧ．ｂｉｌｏｂａｅｍｂｒｙｏｂｙＴＣＡａｃｅｔｏｎｅｐｈｅｎｏｌｍｅｔｈｏｄ，ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｌｙｓｉｓｂｕｆｅｒ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ８ｍｏｌ·Ｌ－１ｕｒｅａ，１６５０μｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎｌｏａｄｉｎｇｄｏｓａｇｅａｎｄｒｕｎｎｉｎｇＳＤＳＰＡＧＥｗｉｔｈ１２．５％ ｇｅｌｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｆｉｌｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｃｌｅａｎｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｗｏｄｉｍｅｎ
ｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ２ＤＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓｕｉｔａｂｌｅ
ｆｏｒｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＧ．ｂｉｌｏｂａｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｗｈｉｃｈｉｓ：ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｂｙ
ＴＣＡａｃｅｔｏｎｅｐｈｅｎｏｌｍｅｔｈｏｄ，ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｌｙｓｉｓｂｕｆｅｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ８ｍｏｌ·Ｌ－１ｕｒｅａ，１６５０μｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｏａｄｉｎｇｄｏｓａｇｅａｎｄｒｕｎｎｉｎｇＳＤＳＰＡＧＥｗｉｔｈ１２．５％ ｇｅｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａ；ｅｍｂｒｙｏ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
林　业　科　学　研　究 第２９卷
　　银杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）是新生代第四纪冰川期
的孑遗植物，有“活化石”之美誉。它是世界著名的
观赏树种，同时具有极高的经济价值和药用价值。
关于银杏的研究报道非常多，主要集中在育种、园林
绿化和叶的药用价值等方面［１－４］。关于银杏种子的
研究主要集中在储藏与繁殖技术［５－６］和发育与萌发
过程中的生理变化［７－８］等方面。近年来，随着分子
生物学的发展，有关银杏分子生物学方面的报道逐
渐增多。王亚茹等对银杏小孢子的提取方法和上样
量双向电泳技术进行优化，发现采用 ＴＣＡ丙酮法和
１５００μｇ上样量可获得重叠少、质量最佳的图谱［９］。
在此基础上，杨妮娜进行了进一步进行优化，发现采
用ＴＣＡ丙酮 －酚提取、含有硫脲的裂解液Ⅱ、ｐＨ４
７线性１７ｃｍ的ＩＰＧ胶条和１２％的ＳＤＳＰＡＧＥ凝
胶获得的图谱更清晰［１０］。李生平对银杏种子胚和
胚乳蛋白的分布特点进行了研究，采用 ＴｒｉｓＨＣｌ方
法提取种胚蛋白，检测到３００种以上的蛋白斑点，其
分子量分布范围为９７ＫＤ １３ＫＤ、等电点的范围
为ｐＩ５．３ ｐＩ７．８［１１］。
银杏果实由种皮（外种皮、中种皮、内种皮）、胚
乳和胚组成。胚与胚乳相互作用共同控制种子生
长［１２］。胚乳中的蛋白质不仅参与细胞的代谢与贮
藏物质的合成，而且还能作为贮藏物质为发育或萌
发中的胚提供养分［１３］。在水稻种子萌发期间，种胚
控制胚乳中蛋白新的生物合成，胚乳中储存的营养
物质被种胚消耗，然后逐渐降解［１４］。然而，具有种
胚后熟的种子，其种胚后熟何时启动？胚与胚乳物
质如何转换？种胚后熟发育机制等问题一直是本项
目组感兴趣的问题。木本植物中种胚具有形态后熟
特性的树种很多，如天女木兰（ＭａｇｎｏｌｉａｓｉｅｂｏｌｄｉＫ．
Ｋｏｃｈ）［１５］、东北红豆杉 （ＴａｘｕｓｃｕｓｐｉｄａｔａＳｉｅｂ．ｅｔ
Ｚｕｃｃ．）［１６］、黄兰（Ｍｉｃｈｅｌｉａｃｈａｍｐａｃａ）［１７］、水曲柳
（ＦｒａｘｉｎｕｓｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａＲｕｐｒ．）［１８］等，但很多树种由
于种子和胚乳个体小，胚与胚乳难于分离，给种胚后
熟的深入研究带来一定困难。而银杏种子个体大，
胚与胚乳分离容易，同时银杏种子来源丰富，笔者认
为银杏是研究形态后熟种胚发育较好的材料。
因此，本研究采用银杏种胚为材料。银杏种胚
中蛋白含量较低，且胚中含有的糖类、核酸、脂类等
干扰物质会影响蛋白的提取和双向电泳的结果。目
前，还没有一个针对银杏种胚及胚乳的完善的蛋白
提取与双向电泳体系。因此，本试验将银杏种胚从
种子中分离，采用双向凝胶电泳技术（２ＤＥ）提取银
杏种胚蛋白质，为研究种胚后熟发育期间差异蛋白
质组学提供方法，为进一步揭示具有后熟特性的林
木种子种胚发育、种子解除休眠机制奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
银杏种子采自沈阳农业大学校园内３０ａ生的
银杏优良植株。将采集后的种子放在袋子中闷放９
１０ｄ，然后搓洗去除外种皮，放于阴凉处阴干４
５ｄ，用０．５％ＫＭｎＯ４消毒，随后和已用０．２％ＫＭｎＯ４
消毒的沙土混合，控制含水量为６０％，即沙土手握
成团，松手散开，放于４℃冰箱中储存。选取长势良
好，形态大小相似的种子，去掉中种皮，将种子纵向
切开，取出种胚于锡纸中，在液氮中速冻后放于 －
７０℃冰箱中保存。
１．２　仪器与试剂
表１　仪器及来源
仪器 购买公司
Ｍａｎｉｆｏｌｄ胶条槽、ＥｔａｎＩＰＧｐｈｏｒⅢ等点聚焦仪、
ＳＥ６００Ｒｕｂｙ垂直电泳仪、ＭｕｌｔｉＴｅｍｐⅢ温度控
制仪
ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司
ＵＭＡＸＰｏｗｅｒｌｏｏｋ２１００ＸＬ扫描仪 ＵＭＡＸ公司
表２　试剂及来源
试剂 购买公司
ｐＨ４－７胶条（１１ｃｍ）、ＩＰＧＢｕｆｅｒ ＧＥ公司
ＤＴＴ、ＣＨＡＰＳ、碘乙酰胺、ＰＭＳＦ、ＴＥＭＥＤ、ＥＤＴＡ、
Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｚｏｌ
Ｓｉｇｍａ公司
Ｕｒｅａ、Ｔｈｉｏｕｒｅａ、ＰＶＰＰ、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰
胺、ＳＤＳ、ＡＰ、β巯基乙醇、Ｔｒｉｓ饱和酚
Ａｍｒｅｓｃｏ公司
　　备注：试剂均为国产分析纯，所有溶液均用超纯水配制。
１．３　银杏种胚蛋白提取方法
１．３．１　直接提取法　取银杏种胚２ｇ在液氮中迅
速研磨成粉，加入足够量的提取液（８ｍｏｌ·Ｌ－１Ｕｒｅ
ａ，质量分数１％ＤＴＴ，质量分数４％ＣＨＡＰＳ，２ｍｏｌ·
Ｌ－１Ｔｈｉｏｕｒｅａ，２％ＩＰＧＢｕｆｅｒ），振荡３０ｓ，４℃１５０００×
ｇ离心１５ｍｉｎ，取上清－７０℃保存。
１．３．２　Ｔｒｉｚｏｌ提取法　参照郭广芳等［１９］方法并略
有改进。取银杏种胚２ｇ在液氮中充分研磨成粉，
加入２０ｍＬｔｒｉｚｏｌ试剂，迅速混匀，室温静置５ｍｉｎ，
加入４ｍＬ氯仿，剧烈震荡，室温静置５ｍｉｎ，４℃ １５
０００×ｇ离心１５ｍｉｎ，弃上层水相，加入６ｍＬ无水乙
醇混匀，室温静置２ ３ｍｉｎ，４℃ １５０００×ｇ离心１５
ｍｉｎ，取上清。加入３０ｍＬ异丙醇（沉淀蛋白），充分
混匀，室温静置至少２０ｍｉｎ，４℃ １５０００×ｇ离心１５
ｍｉｎ，弃上清用含０．３ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸胍的９５％乙醇
４８３
第３期 李　佳，等：银杏种胚蛋白提取及双向电泳体系的优化
２０ｍＬ洗涤蛋白沉淀，室温静置２０ｍｉｎ，４℃ １５０００
×ｇ离心１５ｍｉｎ弃上清，重复２次，然后用同样的方
法用２０ｍＬ丙酮洗涤 ２次。冷冻干燥放 －７０℃
保存。
１．３．３　酚提取法　参照张晓林等［２０］的方法操作并
略有改进。取银杏种胚 ２ｇ在液氮中迅速研磨成
粉，加入１０ｍＬ预冷的酚提取液（用前摇晃均匀），
充分混匀后４℃下静置３０ｍｉｎ，加入等体积的Ｔｒｉｓ饱
和酚，４℃下静置３０ｍｉｎ，４℃１５０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，
吸去上层酚相，剩余液体重新提取２次，将２次酚相
合并，加入５倍体积的０．１ｍｏｌ·Ｌ－１醋酸铵甲醇（－
２０℃预冷），在－２０℃下静置过夜，４℃ １５０００×ｇ离
心３０ｍｉｎ，弃上清，加入５倍体积的丙酮溶液（含体
积分数为０．０７％的β巯基乙醇）清洗，充分混匀，在
－２０℃静置 ３０ｍｉｎ，在 ４℃下 １５０００×ｇ离心 ３０
ｍｉｎ，弃上清，重复２次，冷冻干燥放－７０℃保存。
１．３．４　ＴｒｉｓＨＣｌ法　参照曾广娟等［２１］方法并略有
改进。取银杏种胚２ｇ在液氮中迅速研磨成粉，加
入０．２ｇＰＶＰＰ和 ２０ｍＬ蛋白质提取缓冲液（６２．５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ６．８，０．５％ＳＤＳ，１０％甘油，
５％巯基乙醇），涡旋３０ｓ混匀，４℃放置１ｈ，以充分
溶解蛋白，４℃ １５０００×ｇ离心１５ｍｉｎ，取上清，加入
４倍体积 －２０℃预冷丙酮，混匀，－２０℃静置１ｈ沉
降蛋白，４℃ １５０００×ｇ离心１５ｍｉｎ，弃上清，加冷丙
酮清洗沉淀，重复洗至沉淀无色，冷冻干燥放－７０℃
保存。
１．３．５　ＴＣＡ丙酮－酚法　参照张晓林等［２０］的方法
操作并略有改进。取银杏种胚２ｇ在液氮中迅速研
磨成粉，加入３０ｍＬ预冷的丙酮溶液（含质量分数为
１０％的三氯乙酸和体积分数为０．０７％的 β巯基乙
醇），充分混匀，在 －２０℃下静置过夜，在 ４℃下 １５
０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清，加入５倍体积的体积分
数８０％甲醇（含 ０．１ｍｏｌ·Ｌ－１醋酸铵），混匀，４℃
下，１５０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清，加入５倍体积预
冷的丙酮溶液（含体积分数为 ０．０７％的 β巯基乙
醇）清洗，４℃下，１５０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，干燥，室温
放置至少１０ｍｉｎ以去除丙酮，在干燥的蛋白质中加
入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚和 ＳＤＳ提取液（含质量分数
２％ＳＤＳ，质量分数１％ ＰＶＰＰ，０．７ｍｏｌ·Ｌ－１蔗糖，０．１
ｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ，０．５ｍｏｌ·Ｌ－１ｐＨ７．５ＴｒｉｓＨＣｌ，５０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ，１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＰＭＳＦ，体积分数２％
β巯基乙醇），混匀４℃静置５ｍｉｎ。４℃下，１５０００×
ｇ离心３０ｍｉｎ。移出酚相至新管，加入５倍体积的
０．１ｍｏｌ·Ｌ－１醋酸铵甲醇（－２０℃预冷），在 －２０℃
下贮藏过夜。４℃ １５０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清，
用甲醇清洗沉淀１次，充分混匀后于 －２０℃静置３０
ｍｉｎ，４℃ １５０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清，再用丙酮
（含体积分数０．０７％β巯基乙醇）清洗１次，充分混
匀后于－２０℃静置３０ｍｉｎ，４℃ １５０００×ｇ离心３０
ｍｉｎ，弃上清，冷冻干燥后于－７０℃保存备用。
１．４　裂解液浓度
分别用尿素浓度为６、７、８、９ｍｏｌ·Ｌ－１裂解液裂
解干燥好的蛋白，参照Ｂｒａｄｆｏｒｄ［２２］测量５９５ｎｍ下样
品的ＯＤ值，计算蛋白浓度。
１．５　蛋白上样量
设置四个梯度的上样蛋白量，即１５００μｇ、１６５０
μｇ、１８００μｇ分别进行双向电泳。
１．６　双向等点聚焦电泳
１．６．１　第一向等电聚焦　采用１１ｃｍ（ｐＨ４ ７）
ＩＰＧ胶条进行等电聚焦，上样体积为２００μＬ。设置
参数如表３所示。
表３　银杏种胚第一向等电聚焦参数
聚焦程序 电压／Ｖ 升压方式 时间／ｈ 作用
Ｓ１
Ｓ２
Ｓ３
Ｓ４
Ｓ５
Ｓ６
Ｓ７
Ｓ８
５０
１００
２５０
５００
１０００
６０００
６０００
５００
快速
快速
快速
快速
快速
线性
快速
快速
１２
３
３
３
１
３
４２０００ｖｈ
２４
水化
除盐
除盐
除盐
除盐
升压
聚焦
保持
１．６．２　第二向胶条平衡及 ＳＤＳＰＡＧＥ电泳　将平
衡后的胶条进行 ＳＤＳＰＡＧＥ电泳，先 ５ｍＡ（胶 ３０
ｍｉｎ）－１，然后５０ｍＡ（胶３ｈ）－１。采用分离胶浓度分
别为 １０％、１２．５％和 １５％来比较蛋白点的分离
效果。
１．７　染色
用考马斯亮蓝 Ｒ３５０进行染色，然后１０％冰醋
酸清洗。
１．８　图像扫描与数据分析
扫描后用ＰＤＱｕｅｓｔ７．３．１软件对图谱进行分析。
２　结果与分析
２．１　不同提取方法所得２ＤＥ图谱的比较
提取蛋白样品的质量对２ＤＥ图谱的分辨率和
可靠性有重要影响，因此，蛋白样品的制备是获得良
好２ＤＥ图谱的关键步骤。图１为５种不同的提取
方法获得的银杏种胚蛋白２ＤＥ图谱。采用直接提
５８３
林　业　科　学　研　究 第２９卷
取法提取蛋白后得到的图谱很竖条纹较多，蛋白点
没有有效的分开，且蛋白点较少为２２１个；Ｔｒｉｚｏｌ提
取法获得２５５个蛋白点，蛋白点数量虽有所提高，但
背景颜色较深，且靠近碱性端出现纵向的空白条带；
ＴｒｉｓＨＣｌ提取法获得２７５个蛋白点，与 Ｔｒｉｚｏｌ提取法
获得的蛋白数相近，虽然图谱效果较前两种背景清
晰，横纵条纹相对较少，但蛋白点分布不均匀；酚提
取法获得４６７个蛋白点，蛋白点数明显提高且分布
较均匀，但仍有较明显的横纵条纹；ＴＣＡ丙酮 －酚
获得的蛋白点数最多为４８２个，约为前三种方法的２
倍，且较酚提取法有了较大改进，背景清晰，横纵条
纹较少，把蛋白点有效的分布开。因此，ＴＣＡ丙酮
－酚是这五种方法中提取效果最好的。
尿素浓度８ｍｏｌ·Ｌ－１，上样量１６５０μｇ，１２．５％分离胶
图１　不同提取方法的２ＤＥ图谱
２．２　裂解液中不同尿素浓度所得 ２ＤＥ图谱的
比较
　　分别采取尿素浓度为６ｍｏｌ·Ｌ－１、７ｍｏｌ·Ｌ－１、
８ｍｏｌ·Ｌ－１、９ｍｏｌ·Ｌ－１的蛋白裂解液缓冲液，获得
的２－ＤＥ图谱见图２。四种不同尿素浓度的蛋白裂
解液均可获得清晰的图谱，其获得的蛋白点数依次
是４３８个、４４５个、４７４个、４２４个，虽然蛋白点数差异
不大，但８ｍｏｌ·Ｌ－１裂解液的蛋白点比其他三个更
分散更均匀，蛋白图谱更清晰。因此，最适合裂解银
杏种胚蛋白的尿素浓度为８ｍｏｌ·Ｌ－１。
ＴＣＡ丙酮－酚法提取，上样量１６５０μｇ，１２．５％分离胶
图２　裂解液中不同尿素浓度的２ＤＥ图谱
２．３　不同上样量所得２ＤＥ图谱的比较
分别取１５００μｇ、１６５０μｇ、１８００μｇ的蛋白上
样量进行双向电泳，上样体积皆为２００μＬ，如图３。
上样量为１５００μｇ所得的蛋白图谱，蛋白点数较少，
丰度较弱，可能会影响２ＤＥ的准确性与重复性；上
样量为１８００μｇ所得的蛋白图谱，横竖条纹严重，影
６８３
第３期 李　佳，等：银杏种胚蛋白提取及双向电泳体系的优化
响蛋白点的检测和分析；上样量为１６５０μｇ所得的
蛋白图谱，蛋白点较为清晰，相较另外上样量两个图
谱质量更好。
Ｔｒｉｚｏｌ法提取，尿素浓度８ｍｏｌ·Ｌ－１，１２．５％分离胶
图３　不同上样量的２ＤＥ图谱
２．４　不同分离胶浓度所得２ＤＥ图谱的比较
分别用质量分数为 １０％、１２．５％、１５％的分离
胶比较其对银杏种胚２ＤＥ图谱的影响，如图４。其
中，质量分数为１０％分离胶的图谱蛋白点主要分布
在下部，且有部分小分子蛋白点丢失；质量分数为
１５％分离胶的图谱蛋白点主要分布在上半部，且大
分子蛋白点紧凑且重叠；质量分数为１２．５％分离胶
的图谱均匀分布，背景清晰，小分子蛋白分散开，大
分子蛋白重叠现象减轻。因此，适合分离银杏种胚
蛋白的分离胶浓度为１２．５％。
ＴＣＡ丙酮－酚法提取，尿素浓度８ｍｏｌ·Ｌ－１，上样量１６５０μｇ
图４　不同分离胶浓度的２ＤＥ图谱
３　讨论
３．１　不同蛋白提取方法对２ＤＥ结果的影响
从理论上讲，裂解液直接提取法应获得大量的
蛋白，因为裂解液中有变性剂尿素、硫脲、ＣＨＡＰＳ和
增溶济ＩＥＦ缓冲液，通过一步来提取样品中的蛋白。
然而，本试验中用直接提取法获得的蛋白点很低，有
可能是因为样品中的可溶性淀粉在裂解液中溶胀，
导致蛋白质流失［２３］。但在番茄、豌豆、大豆的研究
中，也采用过此种提取方法。Ｔｒｉｚｏｌ抽提法提取的蛋
白量虽然较低，但蛋白浓度很高。郭广芳等用 Ｔｒｉｚｏｌ
抽提法改良小麦根蛋白的提取，获得分辨率高、重复
性好、无横条纹和拖尾现象的清晰图谱［２４］。而本试
验的图谱横纵条纹严重，碱性端有纵向空白条带，可
能是由于蛋白中的干扰物没能有效去除的原因。
ＴｒｉｓＨＣｌ法提取液中的 ＥＤＴＡ可抑制金属蛋白酶的
活性，可获得杂质较少、背景清晰的蛋白图谱［２０］。
但此种方法可使蛋白质大量丢失，因而获得的蛋白
点数并不高。酚提取法将样品中的蛋白质转移到酚
相，获得大量蛋白，而一些干扰物，如碳水化合物、核
酸和不溶性细胞碎片，被转移到水相，从而提高了蛋
白的质量。同时，该提取方法获得的蛋白点数量也
显著提高。ＴＣＡ丙酮 －酚是综合了 ＴＣＡ丙酮法和
酚提取法的优点，能有效的去除干扰物，获得高质量
的蛋白样品［１０］。虽然操作略显繁琐，但有效的改善
了图谱的横纵条纹和背景的清晰度，使蛋白点的可
辨性得到显著的提高，且获得蛋白点的数量比酚提
取法多。因此，对于银杏种胚来说，ＴＣＡ丙酮 －酚
是最适宜的蛋白提取方法。
３．２　裂解液中不同尿素浓度对２ＤＥ结果的影响
尿素作为一种常见的变性剂，通过改变或破坏
氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶
失活［２５］。尿素与硫脲的联用可以进一步地提高蛋
白溶解度。本试验裂解液中均还有等量的硫脲，采
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林　业　科　学　研　究 第２９卷
用不同梯度（６、７、８、９ｍｏｌ·Ｌ－１）的尿素浓度对样品
进行裂解，发现对于银杏种胚而言，２ＤＥ图谱效果
与对应裂解液中尿素的浓度没有相关性。在尿素浓
度为８ｍｏｌ·Ｌ－１时，其蛋白图谱蛋白点数最高，蛋白
分布更均匀。
３．３　不同上样量对２ＤＥ结果的影响
蛋白质的上样量直接影响２ＤＥ图谱的质量和
可靠性。上样量过大，影响聚焦效果，丰度较大的蛋
白点易于掩盖一些分子量差异不大的低丰度蛋白
点，且横条纹和拖尾较严重；上样量过低，低丰度蛋
白难以辨别，不易于后续分析蛋白质表达的上调与
下调［２４］。本试验选用１５００、１６５０、１８００μｇ三种蛋
白上样量进行对比，其中上样量为１６５０μｇ的２ＤＥ
图谱比较清晰，有利于低丰度蛋白的分析，可以满足
后续试验的要求。
３．４　不同分离胶浓度对２ＤＥ结果的影响
分离胶浓度与蛋白点的分布和清晰度有关，当
分离胶浓度升高，凝胶孔径变小，分离的蛋白点会更
清晰。质量分数为１０％的分离胶的孔隙较大，蛋白
运动过快，图谱上部产生空白，低分子蛋白不能较好
的分离；质量分数为１５％的分离胶，孔隙相对较小，
丰度较高的蛋白在中上部聚集，不利于蛋白有效的
分离。而质量分数为１２．５％分离胶的２ＤＥ图谱分
布均匀，蛋白点相对清晰，蛋白有效的得到了分离。
４　结论
优化的银杏种胚蛋白质双向电泳的体系：ＴＣＡ
丙酮－酚法制备样品，选取尿素浓度为８ｍｏｌ·Ｌ－１
的裂解液提取样品粉末全蛋白，蛋白上样量控制为
１６５０μｇ，第二向分离胶浓度定为１２．５％。如上条
件可获得分辨率高、重复性好、背景清晰的 ２ＤＥ
图谱。
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（责任编辑：张　研）
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