全 文 ：书西伯利亚白刺肌动蛋白基因的分离与特性分析
王丽１，黎妃凤１，张文波２，陈贵林１，林晓飞１
（１．内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特０１００２１；２．内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特０１００１９）
摘要：利用兼并ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术克隆了西伯利亚白刺的肌动蛋白基因（犖犻狋狉犪狉犻犪狊犻犫犻狉犻犮犪犃犮狋犻狀，犖狊犃犮狋），并对其
基因结构和表达特性进行了分析。所克隆的犖狊犃犮狋ｃＤＮＡ全长序列为１８３１ｂｐ，包含１１３４ｂｐ的开放阅读框，编码
３７７个氨基酸；基因组ＤＮＡ全长序列为２９１３ｂｐ，包含５个外显子和４个内含子。系统进化分析结果显示，犖狊犃犮狋
与其他植物的肌动蛋白基因具有较高的同源性，与芒果（无患子目）亲缘关系最为接近。基因表达特性分析的结果
显示，该基因在根、茎、叶中的表达量基本一致；在干旱、盐、低温及外源脱落酸胁迫下，表达量无明显变化，这些结
果验证了该基因作为分子内标的可靠性。
关键词：西伯利亚白刺；肌动蛋白；基因结构；表达特性
中图分类号：Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０１５１０８
　　肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）普遍存在于真核细胞中，是构成细胞骨架中微丝的重要成分［１］。肌动蛋白丝与肌球蛋白相
互作用为细胞运动提供动力，驱使细胞器运动、胞质流动等生命活动［１，２］。研究表明，肌动蛋白还参与植物细胞
顶端生长、细胞壁沉积、有丝分裂等生命活动［３］。肌动蛋白分子量为４２ｋＤ，由３７５～３７７个氨基酸残基组成，其
基因保守性很高，各种生物间同源性为７０％～１００％［４］。另一方面由于该基因的表达具有稳定性，尤其是β肌动
蛋白基因，作为细胞质肌动蛋白基因，在物种内各组织中保持相对恒定的表达水平，常在定量、半定量ＲＴＰＣＲ
（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交实验中被用作内参基因校正样本量［４，５］。相关
实验也证明了肌动蛋白基因作为内参基因的可靠性：蒙古冰草（犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿）不同组织的肌动蛋白基
因表达分析表明其表达不存在组织特异性［６］；柠条锦鸡儿（犆犪狉犪犵犪狀犪犽狅狉狊犺犻狀狊犽犻犻）肌动蛋白（ＧｅｎＢａｎｋ注册号
ＦＪ４８５７２７）在植物体的不同器官、不同发育时期及多种胁迫条件下均能稳定表达，且表达强度适中，满足作为内
参基因的条件［７］。
白刺（犖犻狋狉犪狉犻犪），蒺藜科的一个小属，是分布广泛的旱生、盐生及荒漠植物，受到盐、碱、旱的三重胁迫，自然
抗逆性突出，蕴含着丰富的抗逆基因资源［８］。田新民等［９］对民勤绿洲荒漠过渡带分布的４种优势植物进行了光
合生理特性研究，结果表明白刺在过渡带光合能力下降最小，水分利用效率最高，更能适应过渡带旱化生境。高
瞑等［１０］对３个种源的白刺进行干旱胁迫的生理响应研究，结果显示白刺耐旱性是受保护酶活性、渗透调节物质
等共同调节的。张建秋等［１１］研究发现，他们克隆到的白刺盐碱胁迫相关基因片段与目前已知的植物耐盐基因存
在较大差异，预示着白刺可能存在较特殊的耐盐碱机理。但目前有关白刺分子生物学的研究甚少，因此克隆白刺
肌动蛋白基因，分析确定该基因作为内参基因的可靠性，对于深入研究白刺耐受性基因的表达模式，调控机制具
有一定的意义。本研究以西伯利亚白刺（犖犻狋狉犪狉犻犪狊犻犫犻狉犻犮犪）为材料，分离了其肌动蛋白基因的ｃＤＮＡ和基因组
ＤＮＡ序列，并对其基因结构、系统进化关系及表达特性进行相关分析。
１　材料与方法
１．１　材料与试剂
本实验于２０１０年５月开始，选用西伯利亚白刺快繁试管苗为实验材料，培养条件为固体培养基［１／２ＭＳ
（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）＋０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ＋５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ］，温度２６℃，光照时间１４ｈ／ｄ，光照强度３６～４０
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１５１－１５８
２０１２年８月
收稿日期：２０１１０８２４；改回日期：２０１１０９３０
基金项目：国家自然科学基金（３０９６００３０），内蒙古自然科学基金（２００９ＭＳ０５０５）和内蒙古大学‘２１１工程’创新人才培养项目资助。
作者简介：王丽（１９８５），女，内蒙古商都人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｌｉｎｄ２０１０＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｎｘｉａｏｆｅｉ０４＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）［１２］。生长４０ｄ左右的试管苗用于提取总ＲＮＡ和基因组ＤＮＡ。
主要试剂：ＴａＫａＲａＲＮＡＰＣＲｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ３．０（ＴａＫａＲａ）、克隆载体ｐＭＤ１８Ｔ （ＴａＫａＲａ）、ＡｘｙＰｒｅｐ
ＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＡＸＹＧＥＮ）、ＴａｑＤＮＡ聚合酶 （ＴａＫａＲａ）、ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）和感受态大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α（ＴａＫａＲａ）。其他生化及分子生物学试剂均为国产分析
纯。本研究所有引物合成和测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完成。
１．２　实验方法
搜索ＧｅｎＢａｎｋ中高等植物的肌动蛋白氨基酸序列，利用ＣｌｕｓｔａｌＷ 软件进行多序列同源性比对，然后在高
度保守区域内设计一对兼并引物。引物序列为ＤｅｇＡｃｔＦ：５′ＡＴＧＧＴＩＡＡＲＧＣＩＧＧＩＴＴＹＧＣ３′；ＤｅｇＡｃｔＲ：５′
ＣＣＡＣＡＴＹＴＧＹＴＧＲＡＡＩＧＴＩＳ３′。
采用溴化十六烷基三甲铵（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法提取白刺组培苗总ＲＮＡ［１３］和基
因组ＤＮＡ。采用ＴａＫａＲａＲＮＡＰＣＲＫｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０，以白刺总ＲＮＡ为模板，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，在ＡＭＶ
逆转录酶的作用下合成ｃＤＮＡ第１链。以ｃＤＮＡ为模板，利用兼并引物扩增犖狊犃犮狋基因的中间片段。ＲＴＰＣＲ
反应体系为：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ、ｄＮＴＰｓ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ、ｄｅｇＡｃｔＦ（２０μｍｏｌ／Ｌ）２．５μＬ、ｄｅｇＡｃｔ
Ｒ（２０μｍｏｌ／Ｌ）２．５μＬ、ｃＤＮＡ２．０μＬ、ｒＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，加去离子水至２５μＬ。反应条
件为：９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，４５℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃５ｍｉｎ。扩增产物用１％琼脂糖凝胶检测，
目的片段用ＡｘｙＰｒｅｐＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒回收、纯化后与载体ｐＭＤ１８Ｔ连接；转化犈．犮狅犾犻ＤＨ５α感
受态细胞，选择阳性菌落测序。
根据所获得犖狊犃犮狋中间片段序列设计５′ＲＡＣＥ和３′ＲＡＣＥ反应用特异性引物（ＧＳＰＦ：５′ＡＧＴＧＴＣＴＧ
ＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡ３′和 ＧＳＰＲ：５′ＧＣＡＴＣＣＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣＣ３′）。参照 ＴａＫａＲａＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ
（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０试剂盒说明书，以白刺总ＲＮＡ为模板，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，在ＡＭＶ逆转录酶的作用下合成ｃＤ
ＮＡ第１链，然后以ＧＳＰＦ和下游试剂盒提供的 Ｍ１３Ｍ４为引物，进行３′ＲＡＣＥ反应分离犖狊犃犮狋的３′末端，反应
体系为：１０×ＥｘＴａｑＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ、ｄＮＴＰｓ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ、ＧＳＰＦ
（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ、Ｍ４（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，加去离子水至２５μＬ。反应
条件为：９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５３℃５０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃５ｍｉｎ。参照ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒说明书反转录成ｃＤＮＡ第１链，然后按照如下反应进行５′ＲＡＣＥ反应分离犖狊犃犮狋的５′末端，
反应体系：５′ＲＡＣＥＲＥＡＤＹｃＤＮＡ４．０μＬ、ＵＰＭ （１０×）５．０μＬ、ＧＳＰＲ（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ、５×ＥｘＴａｑＰＣＲ
Ｂｕｆｆｅｒ１０μＬ、ｄＮＴＰｓ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４．０μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ、ＥｘＴａｑＨＳ（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，加
去离子水至５０μＬ。反应条件，５个循环：９４°Ｃ，３０ｓ；７２°Ｃ，３ｍｉｎ；５个循环：９４°Ｃ，３０ｓ；７０°Ｃ，３０ｓ；７２°Ｃ，３
ｍｉｎ；２５个循环：９４°Ｃ，３０ｓ；６８°Ｃ，３０ｓ；７２°Ｃ，３ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物回收纯化后连接至ｐＭＤ１８Ｔ载体，测序。
根据ＲＡＣＥＰＣＲ扩增得到的犖狊犃犮狋末端序列，在其上下游分别设计克隆全长序列的正向引物ＦｕｌＦ：５′
ＴＣＣＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＴＴＴＧＴＴＣ３′（６３～８２ｂｐ）和反向引物 ＦｕｌＲ：５′ＴＡＣＴＧＡＴＡＧＴＴＴＴＴＧＡＣＣＧＣ３′
（１７０６～１７２５ｂｐ），分别以反转录ｃＤＮＡ第１链和基因组ＤＮＡ为模板克隆犖狊犃犮狋的ｍＲＮＡ和基因组ＤＮＡ全
长序列。ＰＣＲ反应体系为：基因组ＤＮＡ（１μｇ／μＬ）或ｃＤＮＡ１．０μＬ、１０×ＬＡｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ、ｄＮＴＰｓ（各２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ）４．０μＬ、ＦｕｌＦ（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ、ＦｕｌＲ（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ、ＬＡＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，加去离
子水至２５μＬ。反应条件为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，３５个循环；７２℃７ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产
物回收纯化后连接ｐＭＤ１８Ｔ载体，测序。
分别以西伯利亚白刺的根、茎、叶为材料提取ＲＮＡ，进行犖狊犃犮狋的组织特异性表达分析；取同一批次白刺快
繁试管苗进行低温、干旱、盐和脱落酸（ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ，ＡＢＡ）胁迫处理，研究犖狊犃犮狋的表达稳定性。低温处理将其
放在４℃培养箱中胁迫２４ｈ；盐胁迫、干旱胁迫和外源 ＡＢＡ胁迫时，将试管苗分别放入含２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、
１５％ 聚乙二醇（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）、１００μｍｏｌ／ＬＡＢＡ的１／２ＭＳ液体培养基中处理５ｈ后提取处理植
株的总ＲＮＡ。以等量的ＲＮＡ反转录ｃＤＮＡ，取等量ｃＤＮＡ进行ＲＴＰＣＲ反应，再取等量的ＰＣＲ产物进行琼脂
糖凝胶电泳，实验经过３次重复，通过比较目的条带的灰度判定基因表达的强弱。
２５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
所测定的ｍＲＮＡ序列经拼接后进行ＢｌａｓｔＸ同源性比较；利用 ＮＣＢＩ的 ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）识别ＯＲＦ（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）序列并推定其所对应的氨基酸序列。对推定的氨
基酸序列利用ＥｘＰＡＳｙ数据库ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件［１４］（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）在线分析
其基本性质。将犖狊犃犮狋基因的ｍＲＮＡ序列及基因组ＤＮＡ序列进行比较，分析基因结构特征。在ＧｅｎＢａｎｋ中
搜索不同植物的肌动蛋白基因核苷酸序列，与白刺犖狊犃犮狋基因的核苷酸序列进行ＣｌｕｓｔａｌＷ 多重序列比较，使用
ＭＥＧＡ３．１软件，邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ法）［１５］绘制系统进化树，自展法（ｂｏｏｔｓｔｒａｐｉｎｇ）进行评估，最后用
ＴｒｅｅＶｉｅｗ１．５软件观看、输出图形化的进化树。
２　结果与分析
２．１　白刺犖狊犃犮狋基因克隆
以白刺总ＲＮＡ反转录得到的ｃＤＮＡ第１链为模板，用在肌动蛋白基因保守区域设计的兼并引物ｄｅｇＡｃｔＦ
和ｄｅｇＡｃｔＲ，通过ＲＴＰＣＲ扩增得到１０１９ｂｐ的基因片段（图１Ａ）。所克隆序列通过ＢｌａｓｔＸ检索后发现与其
他物种的肌动蛋白基因高度同源，可初步确定为白刺肌动蛋白基因片段。根据获得的１０１９ｂｐ的犖狊犃犮狋序列设
计该基因的３′端特异性引物ＧＳＰＦ以及５′端特异性引物ＧＳＰＲ，采用ＲＡＣＥ方法获得该基因的３′末端序列６２９
ｂｐ（图１Ｂ），５′末端序列３６０ｂｐ（图１Ｃ）。测序后经ＢｌａｓｔＸ比对证实所克隆的片段为犖狊犃犮狋的５′和３′末端序列。
根据５′和３′ＲＡＣＥＰＣＲ扩增得到的犖狊犃犮狋末端序列，在其上下游分别设计正向引物（ＦｕｌＦ）和反向引物
（ＦｕｌＲ），分别以白刺总ＲＮＡ反转录得到的ｃＤＮＡ第１链和基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增得到１８３１ｂｐ
和２９１３ｂｐ的产物（图２）。经测序、同源性检索后证实它们是犖狊犃犮狋的ｃＤＮＡ和基因组ＤＮＡ全长序列。目前
这２条序列已登录在ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ数据库中，登录号为ＡＢ６１７８０５和ＡＢ６３６２８４。
图１　兼并犘犆犚及犚犃犆犈犘犆犚
产物凝胶电泳图
犉犻犵．１　犘狉狅犱狌犮狋狊狅犳犱犲犵犲狀犲狉犪狋犲犘犆犚
犪狀犱犚犃犆犈犘犆犚
图２　获取犖狊犃犮狋基因犮犇犖犃与基因组犇犖犃
全长序列的犘犆犚产物电泳图
犉犻犵．２　犘狉狅犱狌犮狋狊犳狅狉犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犳狌犾犾犲狀犵狋犺
犮犇犖犃犪狀犱犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃狅犳犖狊犃犮狋
　Ｍ１：１００ｂｐｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：兼并ＰＣＲ结果Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｏｆｄｅｇｅｎｅｒａｔｅＰＣＲ；２：３′ＲＡＣＥＰＣＲ结果Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ３′ＲＡＣＥＰＣＲ；３：
５′ＲＡＣＥＰＣＲ结果Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ５′ＲＡＣＥＰＣＲ．
　１：犖狊犃犮狋基因ｃＤＮＡ扩增产物Ｐｒｏｄｕｃｔｆｏｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｌｌｅｎｇｔｈ
ｃＤＮＡｏｆ犖狊犃犮狋；Ｍ：２００ｂｐｍａｒｋｅｒ；２：犖狊犃犮狋基因组 ＤＮＡ 扩增产物
ＰｒｏｄｕｃｔｆｏｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆ犖狊犃犮狋．
２．２　基因序列及其结构分析
犖狊犃犮狋基因ｃＤＮＡ序列全长１８３１ｂｐ，包含一个１１３４ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ），编码３７７个氨基酸，５′非编
码区１９９ｂｐ，３′非编码区４９８ｂｐ。利用ＥｘＰＡＳｙ数据库ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件在线分析的结果显示，其蛋白分子量
３５１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
图３　犖狊犃犮狋基因结构示意图
犉犻犵．３　犜犺犲狊犮犺犲犿犪狋犻犮犱犻犪犵狉犪犿狅犳犖狊犃犮狋犵犲狀犲狊狋狉狌犮狋狌狉犲
图４　犖狊犃犮狋的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
犉犻犵．４　犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犖狊犃犮狋
４５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
４１．７ｋＤ，理论等电点为５．３１。犖狊犃犮狋的基因组ＤＮＡ序列全长２９１３ｂｐ，基因结构分析显示该基因包含５个外
显子，４个内含子，第１个外显子１８９ｂｐ，第２个外显子７０ｂｐ，第３个外显子３９６ｂｐ，第４个外显子６１２ｂｐ，第５
个外显子５４９ｂｐ；第１个内含子７８８ｂｐ，第２个内含子１１５ｂｐ，第３个内含子８６ｂｐ，第４个内含子１０８ｂｐ（图３）。
图４显示犖狊犃犮狋核苷酸序列及推测的氨基酸序列，该基因的ｃＤＮＡ序列还包含一个１５个核苷酸的ｐｏｌｙＡ尾。
２．３　犖狊犃犮狋基因表达的组织特异性及稳定性分析
半定量ＲＴＰＣＲ分析结果显示，犖狊犃犮狋基因在植株根、茎、叶中均有表达，且表达量基本一致（图５）。冷、盐、
干旱和外源ＡＢＡ处理条件下，犖狊犃犮狋基因表达量基本一致，显示该基因的表达不受外界环境影响（图６）。
图５　犖狊犃犮狋在不同器官中的表达
犉犻犵．５　犜犺犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狅犳犖狊犃犮狋犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狅狉犵犪狀狊
图６　不同胁迫条件下犖狊犃犮狋的表达
犉犻犵．６　犜犺犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狅犳犖狊犃犮狋狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狉犲狊狊犮狅狀犱犻狋犻狅狀狊
２．４　基于肌动蛋白基因的系统进化树分析
基于１９种植物的２４个肌动蛋白基因序列，利用 ＭＥＧＡ３．１软件制作了肌动蛋白无根进化树（图７）。变异
位点（ｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｓ）１１９２个，信息位点（ＰａｒｓｉｍＩｎｆｏｓｉｔｅｓ）１００２个，单核苷酸变异位点（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓｉｔｅｓ）１７６个，
分别占全序列的６０．７８％，５１．０９％，１４．７７％，物种间总的遗传平均距离为０．４２７３。遗传距离最大值为１．８６４５
（发生在荔枝和大麦之间），最小值为０．００１７（发生在拟南芥犃犆犜１和犃犆犜２，犃犆犜２和犃犆犜７；以及白刺与蓖麻
之间）。系统进化树显示，白刺与芒果（无患子目）亲缘关系最为接近，遗传距离为０．０２８４，而与金尾虎目的蓖麻、
桑树在同一次级进化枝，遗传距离分别为０．００１７和０．０９２０，与蒺藜科霸王在一较远的进化枝中，遗传距离为
０．２０２３。
３　讨论
肌动蛋白基因非常古老，其家族在发展的早期已经开始分化，因此几乎所有动植物的肌动蛋白都存在数量不
等的异型体［１６］，以满足不同组织不同功能的需要，同时也有利于细胞对环境变化做出灵活的应答。已发现拟南
芥中共有１０个肌动蛋白基因家族，分散于４条染色体上；已获得豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）３个异型体的７个核苷酸
序列；已得到的大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）肌动蛋白基因拷贝数在６以上，玉米（犣犲犪犿犪狔狊）肌动蛋白基因至少有２个拷
贝，水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）肌动蛋白基因拷贝数在１０个以上，矮牵牛（犘犲狋狌狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪）肌动蛋白基因拷贝数则在
１００以上［４，１７］。这些异型体间的表达具有时空和数量上的差别：在大豆肌动蛋白基因的６个异型体中，犛犃犮６和
犛犃犮７高度表达，占了肌动蛋白基因总表达量的８０％，犛犃犮３和犛犃犮１低度表达，而犛犃犮２和犛犃犮４表达量极低，几
乎不被检测到［１８］；在甘草（犌犾狔犮狔狉狉犺犻狕犪狌狉犪犾犲狀狊犻狊）中，肌动蛋白基因在根、茎、叶中都有表达，但在根中，尤其在胚
根中的表达强于茎和叶中的表达［１９］。鉴于上述情况，为确保本实验克隆到的白刺肌动蛋白基因用作内参基因的
可靠性，有必要进一步鉴定白刺肌动蛋白基因的表达特性，并判定其是否满足作为内参基因的条件：１）高度或中
度表达；２）稳定表达于不同组织中，且表达量相近；３）不受任何内源性或外源性因素的影响［２０］。结果表明，本研
究所克隆的犖狊犃犮狋基因在根、茎、叶各器官中高度表达，且表达量基本一致（图５）；而且该基因的表达不受冷、盐、
干旱和外源ＡＢＡ胁迫的影响（图６），这一结果充分证明了犖狊犃犮狋作为内参基因的可靠性。
肌动蛋白基因高度保守，进化速率相对恒定，其氨基酸残基替换率约为每亿年１％［１６］，因此常被用作分子系
统学的研究。但由于肌动蛋白基因属于多基因家族基因，存在多个拷贝，种内与种间的基因差异范围几乎一致，
例如：玉米与大豆肌动蛋白基因之间只相差８％～１０％，而大豆肌动蛋白基因６个拷贝之间碱基序列也相差６％
５５１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
～９％，拟南芥肌动蛋白基因１０个拷贝之间非同义替换差异为０．４％～１８．５％，这些研究引出一个值得思考的问
题，即肌动蛋白多拷贝基因所转录翻译的异型肌动蛋白在植物细胞内有何特殊生理功能［２１，２２］。因此目前需要尽
可能丰富肌动蛋白基因库，为进一步利用肌动蛋白研究生物的起源与分子进化奠定基础。
图７　由邻位相接法（犖犑法）绘制的１９种植物２４个肌动蛋白系统进化树
犉犻犵．７　犖犲犻犵犺犫狅狉犼狅犻狀犻狀犵狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳２４犪犮狋犻狀狊犳狉狅犿１９狆犾犪狀狋狊
　犚犻犮犻狀狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊（蓖麻，ＡＹ３６０２２１）；犘狅狆狌犾狌狊狋狉犻犮犺狅犮犪狉狆犪 （毛果杨，ＸＭ＿００２２９８６７４）；犃犮狋犻狀犻犱犻犪犱犲犾犻犮犻狅狊犪 （美味猕猴桃，ＥＦ０６３５７２１）；犌狅狊
狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿 （陆地棉，ＡＹ３０５７２７．１）；犜犺犲犾犾狌狀犵犻犲犾犾犪犺犪犾狅狆犺犻犾犪 （盐芥，ＡＫ３５３４１２１）；犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 （拟南芥，犃犆犜１ＮＭ＿１７９９５３１；
犃犆犜２，Ｕ３７２８１１；犃犆犜３，ＮＭ＿１１５２３５１；犃犆犜７，ＮＭ＿１２１０１８１）；犆犲犾狅狊犻犪犪狉犵犲狀狋犲犪 （鸡冠花，ＨＱ８４４００２１）；犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪犲狋犲狀狊犲 （岷山红三叶，
ＡＹ３７２３６８１）；犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿 （豌豆，Ｘ６８６４９１）；犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪Ｊａｐｏｎｉｃａ（粳稻，ＮＭ＿００１０５７６２１）；犘犺犪犾犪犲狀狅狆狊犻狊犺狔犫狉犻犱（蝴蝶兰，ＡＹ１３４７５２１）；犣犲犪
犿犪狔狊（玉米，ＮＭ＿００１１５５１７９．１）；犕犪狀犵犻犳犲狉犪犻狀犱犻犮犪（芒果，犃犆犜７，ＨＱ５８６０００１；犃犆犜９，ＨＱ５８５９９９１）；犖犻狋狉犪狉犻犪狊犻犫犻狉犻犮犪（白刺，ＡＢ６１７８０５）；犕狅
狉狌狊犪犾犫犪（桑树，ＨＱ１６３７７６）；犜狌犾犻狆犪犵犲狊狀犲狉犻犪狀犪（郁金香，ＡＢ４５６６８４．１）；犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿 （霸王，ＥＵ０１９５５０）；犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲（大
麦，ＡＹ１４５４５１）；犔犻狋犮犺犻犮犺犻狀犲狀狊犻狊（荔枝，犃犆犜７，ＨＱ５８８８６６；犃犆犜４，ＨＱ５８８８６５）；图中数字表示物种间的遗传距离Ｔｈｅｂｒａｎｃｈｌｅｎｇｔｈｓｉｎｄｉｃａｔｅｅｖ
ｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｉｓｔａｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｓｐｅｃｉｅｓ．
　　白刺属在分类系统上是复杂、混乱且孤隔的一个类群，关于它的分类系统及其起源与演化，争议历来较
多［２３］。虽然传统上一般将其置于蒺藜科，但它与本科中的其他属之间的关系很疏远［２４］。Ｇａｄｅｋ等［２５］对无患子
目及芸香目相关的科进行了ｒｂｃＬ序列分析，其结果表明白刺属与骆驼蓬属结合为一支，并与无患子目的大多数
属互为姐妹群。张勇［２６］对包括白刺属在内的８科３８属４８种植物进行了分子生物学方面的系统研究，经ｔｒｎＬＦ
序列、ｒｂｃＬ序列及ｔｒｎＬＦ与ｒｂｃＬ联合序列分析，其结果支持将白刺属从蒺藜科中分出成立独立的白刺科，归入
无患子目。本研究基于不同植物肌动蛋白核苷酸序列进行系统分析的结果显示，高等植物肌动蛋白进化树至少
可分为３个分支：白刺肌动蛋白（犖狊犃犮狋）与拟南芥肌动蛋白犃犆犜７和单子叶植物纲的郁金香等聚类为一个次级
分化群；拟南芥肌动蛋白犃犆犜１和犃犆犜３则与单子叶植物纲的粳稻肌动蛋白、蝴蝶兰肌动蛋白等聚类；玉米和大
麦肌动蛋白基因则单独形成一个分支（图７）。可见，单子叶植物与双子叶植物的肌动蛋白在进化中相互交叉，被
６５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
子植物肌动蛋白基因家族起源于一个远早于单、双子叶植物分化前的共同祖先［２７］。拟南芥肌动蛋白４个异型体
及芒果２个异型体分别聚类到２个不同分化类群中，说明肌动蛋白异型体在进化过程中沿不同方向，以不同速率
分化，以适应不同环境的变化和满足多种生命活动的需要。同时，系统进化树表明白刺与芒果（无患子目）亲缘关
系最为接近，遗传距离为０．０２８４，而与金尾虎目的蓖麻、桑树在一次级进化枝，遗传距离分别为０．００１７和
０．０９２０，与蒺藜科霸王在一较远的分化枝中，遗传距离为０．２０２３。这一结果与Ｇａｄｅｋ等［２５］和张勇［２６］关于白刺
分类地位的结论相符，即将白刺从蒺藜科中分出，成立白刺科（Ｎｉｔｒａｒｉａｃｅａｅ），置于无患子目中。由于目前数据库
中仅收录了蒺藜科霸王的肌动蛋白基因片段（ＥＵ０１９５５０），还未见其他蒺藜科植物肌动蛋白基因序列的报道，今
后随着蒺藜科植物肌动蛋白基因的陆续分离，将会为利用肌动蛋白对白刺进行分子系统学研究提供更完善的依
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犐狊狅犾犪狋犻狅狀犪狀犱犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狕犪狋犻狅狀狅犳犖犻狋狉犪狉犻犪狊犻犫犻狉犻犮犪犪犮狋犻狀犵犲狀犲
ＷＡＮＧＬｉ１，ＬＩＦｅｉｆｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＷｅｎｂｏ２，ＣＨＥＮＧｕｉｌｉｎ１，ＬＩＮＸｉａｏｆｅｉ１
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犃犫狊狋狉犪犮狋：犖犻狋狉犪狉犻犪狊犻犫犻狉犻犮犪ａｃｔｉｎｇｅｎｅ（犖狊犃犮狋）ｗａｓｃｌｏｎｅｄｕｓｉｎｇｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＰＣＲａｎｄＲＡＣＥｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ａｎｄ
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ｂｐ，ｗｈｉｃｈｈａｓａ１１３４ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｅｎｃｏｄｉｎｇ３７７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆｔｈｅ犖狊犃犮狋
ｃｏｎｔａｉｎｓ２９１３ｂｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ５ｅｘｔｒｏｎｓａｎｄ４ｉｎｔｒｏｎｓ．Ｔｈｅ犖狊犃犮狋ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｈｏｗｓａｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｔｏ
ｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ，ａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｌａｎｔａｃｔｉｎｓｒｅｖｅａｌｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅ犖狊犃犮狋ｓｈｏｗｓｃｌｏｓｅｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈ犕犪狀犵犻犳犲狉犪犻狀犱犻犮犪（ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）．Ｔｈｅ犖狊犃犮狋ｅｑｕａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｉｎｒｏｏｔ，ｓｔｅｍ，ａｎｄｌｅａｆ，ａｎｄｎｏｏｂｖｉｏｕｓｃｈａｎｇｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆ
ｄｒｏｕｇｈｔ，ｓａｌｔ，ｃｏｌｄ，ａｎｄｅｘｏｇｅｎｏｕｓａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ（ＡＢＡ）．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犖犻狋狉犪狉犻犪狊犻犫犻狉犻犮犪；ａｃｔｉｎ；ｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ
８５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４