全 文 ：书马铃薯犠犚犓犢６基因的克隆、序列分析
与原核表达研究
李立芹，黄玉碧，王西瑶
（四川农业大学农学院，四川 雅安６２５０１４）
摘要：在高等植物中 ＷＲＫＹ转录因子家族成员众多，它广泛参与植物对生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和代谢过
程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得马铃薯犠犚犓犢６基因，序列分析表明该蛋白属于 ＷＲＫＹ家族第３
组成员，锌指结构为ＣＸ７ＣＸ２３ＨＸＣ。构建系统发育树结果表明它与拟南芥 ＷＲＫＹ７０亲缘关系较近，相似性达
５８％。然后将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体。在培养温度１８℃条件下添加０．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ（异丙基硫
代半乳糖苷），诱导培养８ｈ可获得高表达融合蛋白。进一步实验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白。本研究为
进一步确定该蛋白的体外活性及生物学功能奠定了坚实基础。
关键词：马铃薯；ＷＲＫＹ；克隆；序列分析；原核表达
中图分类号：Ｓ５３２．０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０２０１７７０７
ＷＲＫＹ转录因子是近年来发现植物特有的一类重要基因，ＷＲＫＹ蛋白最初是从甘薯中发现的一类转录因
子，当时命名为ＳＰＦ１［１］。后来相继从其他植物中也鉴定出了这种蛋白。迄今为止，已从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊
狋犺犪犾犻犪狀犪）、野生马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）、棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿ｓｐｐ．）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪
狋犪犫犪犮狌犿）、大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）、辣椒（犆犪狆狊犻犮狌犿犪狀狀狌狌犿）、遏蓝菜（犜犺犪犾犪狊狆犻犪狉狏犲狀狊犲）等植物分离出许多的
ＷＲＫＹ蛋白［２９］，这类蛋白共同特点是在其Ｎ端含有高度保守的具有６０个氨基酸的 ＷＲＫＹ结构域，其中包括１
个十分保守的七肽 ＷＲＫＹＧＱＫ，ＷＲＫＹ蛋白也由此得名。同时该结构域中还含有一类新的类似锌指的结构
域，因而 ＷＲＫＹ蛋白也可能是一类锌指蛋白。根据已有的一些研究表明 ＷＲＫＹ蛋白参与植物病菌信号转
导［１０］、衰老［２，１１］、生长发育［１２１３］、代谢调控［４］和非生物逆境等众多生理过程［１４１６］。
马铃薯是世界范围内重要粮菜兼用的经济植物，是位列于水稻、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）和玉米（犣犲犪
犿犪狔狊）之后的第四大粮食作物［１７］。马铃薯品种“米拉”是我国西南地区长期以来的主栽品种，１９５６年从德国引入
我国。它的优点是适应性极强，能够适应不同的气候和土壤环境，同时高抗晚疫病，因此推测其含有很多优异的
基因。利用基因工程等生物技术手段有目的寻找其抵御逆境胁迫的优良基因，以期将来应用于马铃薯遗传育种
研究，这将具有重要的研究意义。本研究从该品种中克隆出与抗逆性相关 ＷＲＫＹ家族成员犠犚犓犢６，通过生物
信息学分析，克隆的犠犚犓犢６基因属于 ＷＲＫＹ家族第３组成员，锌指结构为ＣＸ７ＣＸ２３ＨＸＣ。然后在大肠杆
菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）中成功表达该蛋白，纯化后获得了特异性高的融合蛋白，这对于下一步在体外研究其功能具
有重要意义。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试马铃薯品种米拉，由四川农业大学马铃薯研究中心提供；大肠杆菌ＤＨ５α和ＤＥ３、ＤＮＡ凝胶回收纯化
试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；ｐＭＤ１９Ｔ 克隆载体、ＥｘＴａｑＤＮＡ 聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ 连接酶购于
ＴａＫａＲａ公司（大连）。
１．２ 方法
１．２．１ 提取马铃薯米拉总ＲＮＡ和反转录 试验于２０１０年３月进行，以组培苗的幼嫩叶片为材料，采用Ｔｒｉｚｏｌ
第２０卷 第２期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１７７－１８３
２０１１年４月
收稿日期：２０１０１００８；改回日期：２０１０１２０１
作者简介：李立芹（１９７４），女，山东东阿人，博士，讲师。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｌｉｑｉｎ＠ｓｉｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗｘｙｒｔｌ＠１６３．ｃｏｍ
法提取总ＲＮＡ，然后反转录为ｃＤＮＡ。反转录的反应体系为２０μＬ，在ＤＥＰＣ（焦碳酸二乙酯）水处理过的小管中
依次加入下列组分：ＯｌｉｇｏｄＴ１μＬ；ｄＮＴＰｓ（４０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ；ＲＮＡ５μｇ；补水至１３μＬ。６５℃变性５ｍｉｎ，迅速
在冰上冷却至少１ｍｉｎ，稍微离心，然后加入：５×ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｂｕｆ４μＬ；０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ（二硫苏糖醇）１μＬ；Ｓｕｐｅｒ
ＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＲＴ（反转录酶）１μＬ。反应条件是４２℃反应６０ｍｉｎ，７０℃处理１５ｍｉｎ。反转录产物在－２０℃保存备用。
１．２．２ 扩增犠犚犓犢６基因 根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的马铃薯犠犚犓犢６基因编码序列（登陆号ＥＵ０５６９１８．１），利用
Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０设计同源引物，该引物分别对应位于该基因编码区上游起始密码子及Ｃ端终止密码区，可扩增该基
因的完整编码区。以ｃＤＮＡ模板，以犠犚犓犢６Ｆ（５′ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧ３′，下划线处表示
酶切位点，以下同）和 ＷＲＫＹ６Ｒ引物（５′ＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＡＡＴＴＣＣ３′），对犠犚犓犢６基因的编
码区进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系以１μＬｃＤＮＡ为模板，加入１０×ＥｘＴａｑ缓冲液５μＬ（含Ｍｇ
２＋），ＷＲＫＹ６Ｆ
和 ＷＲＫＹ６Ｒ各１μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ），４０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．５μＬ，ＥｘＴａｑＤＮＡ 聚合酶０．２５μＬ（５Ｕ／μＬ），加水至
５０μＬ。ＰＣＲ反应的条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３５个循环；最后
７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物于１％琼脂糖凝胶电泳检测。
１．２．３ 基因克隆及测序 扩增产物经电泳检测后，回收目的片段，然后与ｐＭＤ１９Ｔ载体１６℃连接过夜，连接产
物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态，然后在涂有氨苄青霉素及Ｘｇａｌ／ＩＰＴＧ（５溴４氯３吲哚βＤ半乳糖苷／异丙基
硫代半乳糖苷）的ＬＢ平板上进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆，进行菌落ＰＣＲ检测。然后随机选取３个独立的
阳性克隆进行测序（上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物工程技术服务有限公司）。
１．２．４ 序列分析 基因的编码框用 ＮＣＢＩ提供的在线 ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ寻找（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）；核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜索由 ＮＣＢＩ提供的在线ＢＬＡＳＴ进行（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）；ＤＮＡ序列的翻译、比对及系统演化树用ＤＮＡＭＡＮ（６．０ＤＥＭＯ）进行。
１．２．５ 原核表达载体的构建与鉴定 利用引物 ＷＲＫＹ６Ｆ和 ＷＲＫＹ６Ｒ对测序正确的质粒进行ＰＣＲ扩增并
回收目的基因。纯化的ＰＣＲ产物及ｐＧＥＸ４Ｔ２质粒分别用犅犪犿犎Ⅰ和犛犿犪Ⅰ进行双酶切，回收、纯化酶切片
段，并用Ｔ４ＤＮＡ连接酶１６℃连接过夜，转化宿主菌大肠杆菌ＤＨ５α，蓝白斑筛选阳性克隆，进行菌落ＰＣＲ检测；
用碱裂解法提取质粒，然后进行双酶切和测序鉴定。
１．２．６ 原核表达蛋白的诱导 经鉴定阅读框正确的阳性重组质粒转化ＢＬ２１感受态细胞，涂板挑菌，筛选出阳
性重组菌。在含氨苄青霉素的ＬＢ培养基中３７℃振摇培养过夜后，取重组菌按１∶１００体积比转接到含氨苄青霉
素的ＬＢ培养基中，３７℃振摇培养至ＯＤ值达到０．６～０．８时，菌液中加入终浓度为０．２和０．５ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ分
别在３７和１８℃条件下诱导表达，收集１ｍＬ菌液分装
图１ 马铃薯犠犚犓犢６基因扩增结果
犉犻犵．１ 犠犚犓犢６犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋
Ｍ：分子量标准２５０；１：ＰＣＲ产物；箭头示ＰＣＲ条带
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ２５０；１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；Ａｒｒｏｗｓｈｏｗｓｔｈｅｔａｒｇｅｔｂａｎｄ
于１．５ｍＬ的离心管中，离心５ｍｉｎ，沉淀用ＰＢＳ（磷酸
缓冲液ｐＨ７．４）悬浮，再加入５×聚丙烯酰胺凝胶电
泳 （ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上样缓冲液，水浴煮沸５ｍｉｎ，１２０００
ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳。聚
丙烯酰胺胶采用考马斯亮蓝法进行染色。
１．２．７ 融合蛋白纯化 将诱导成功的ＧＳＴＳｔＷＲＫＹ６
菌液按１∶１００体积比转接于５ｍＬＬＢ液体培养基
中，３７℃振摇培养过夜。将活化的菌液按１∶５０的接种
量转接到２００ｍＬ含氨苄青霉素的ＬＢ培养基中，３７℃
培养至ＯＤ值达到０．６～０．８时，加入诱导剂ＩＰＴＧ至
终浓度为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，１８℃诱导培养过夜。将诱导
的菌液离心收集于５０ｍＬ离心管中，弃上清，加入含
适量溶菌酶的裂解液，吹匀后转到５０ｍＬ离心管中。
超声破碎菌体，离心收集上清，然后加入适量已平衡好
的谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ珠子，４℃结合４ｈ以上，
８７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
离心收集结合有目的蛋白的谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ珠子。用不含溶菌酶的裂解液清洗非特异结合在谷胱甘肽
－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ珠子上的杂蛋白。还原型谷胱甘肽洗脱液洗脱 ＧＳＴ－ＳｔＷＲＫＹ６融合蛋白。最后用ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ分析ＧＳＴＳｔＷＲＫＹ６融合蛋白纯度。纯化后蛋白冷冻干燥保存于冰箱待用。
２ 结果与分析
２．１ 目的基因的ＰＣＲ扩增及克隆
用引物 ＷＲＫＹ６Ｆ和 ＷＲＫＹ６Ｒ对马铃薯米拉ｃＤＮＡ进行扩增，ＰＣＲ扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测
后，可见１条约为９９０ｂｐ的条带（图１）。该条带回收纯化后，与ｐＭＤ１９Ｔ载体连接，转化产物经过蓝白斑及菌
落ＰＣＲ筛选后，将获得阳性克隆随机挑选３个进行测序。
图２ 犛狋犠犚犓犢６蛋白与不同物种 犠犚犓犢蛋白保守结构域比较
犉犻犵．２ 犆狅狀狊犲狉狏犲犱狆狉狅狋犲犻狀犱狅犿犪犻狀犫犲狋狑犲犲狀犛狋犠犚犓犢６犪狀犱狅狋犺犲狉犠犚犓犢狆狉狅狋犲犻狀犳狉狅犿狅狋犺犲狉狊狆犲犮犻犲狊
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ表示一致性序列，并在序列下面列出，黑色阴影表示２０个序列中均保守的 ＷＲＫＹ结构域，其他根据保守程度高低依次使用深灰色和
浅灰色阴影标示，第１行代表 ＷＲＫＹ６蛋白Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｓａｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄａｒｅｌｉｓｔｅｄｂｅｌｏｗ，ｂｌａｃｋｓｈａｄｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓＷＲＫＹｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏ
ｍａｉｎ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｄａｒｋｇｒａｙａｎｄｌｉｇｈｔｇｒａｙａｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄ，ｔｈｅｆｉｒｓｔｌｉｎｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＳｔＷＲＫＹ６ｐｒｏｔｅｉｎ
９７１第２０卷第２期 草业学报２０１１年
２．２ 序列分析
图３ 马铃薯 犠犚犓犢６与不同物种
犠犚犓犢蛋白的系统演化分析
犉犻犵．３ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱
狊犲狇狌犲狀犮犲犫犲狋狑犲犲狀犘狋犠犚犓犢６犪狀犱狅狋犺犲狉犠犚犓犢狆狉狅狋犲犻狀
Ｓｔ：马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿；Ａｔ：拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪；Ｏｓ：水稻犗．狊犪狋犻
狏犪；Ｔａ：小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿；Ｂｎ：油菜犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊；Ｃｌ：西瓜犆犻狋狉狌犾
犾狌狊犾犪狀犪狋狌狊；Ｖａ：山葡萄犞犻狋犻狊犪犲狊狋犻狏犪犾犻狊；Ｎｔ：烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿；Ｈｖ：
大麦 犎．狏狌犾犵犪狉犲；Ｐｔ：三 倍 体 毛 白 杨 （犘狅狆狌犾狌狊狋狅犿犲狀狋狅狊犪 ×犘．
犫狅犾犾犲犪狀犪）×犘．狋狅犿犲狀狋狅狊犪
图４ 重组质粒的鉴定
犉犻犵．４ 犇狅狌犫犾犲犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋
Ｍ：分子量标准；１：酶切产物 Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ
核酸序列分析结果表明，该基因的开放阅读框为
９９０ｂｐ，编码３３０氨基酸。利用 ＮＣＢＩ数据库进行
Ｂｌａｓｔ分析发现，克隆序列与其他学者登录的马铃薯
犠犚犓犢６（ＥＵ０５６９１８．１）序列一致，说明在同种植物中
该基因的保守性程度非常高。用 ＷＲＫＹ６的氨基酸
序列在ＮＣＢＩ网站中的Ｂｌａｓｔ进行在线比对，从中选出
同源性较高的１９条氨基酸序列进行保守域分析，通过
比对从中选择同源性较高的 ＷＲＫＹ结构域进行作
图，结果表明克隆的 ＷＲＫＹ６含有１个保守 ＷＲＫＹ
结构域，其锌指结构模式为ＣＸ７ＣＸ２３ＨＸＣ，属于
ＷＲＫＹ家族的第３组（图２）。同时根据这２０个蛋白
的氨基酸序列（包括ＳｔＷＲＫＹ６）构建系统发育树（图
３）。分析发现，该蛋白与来自拟南芥的 ＷＲＫＹ７０（ＸＰ
＿００２８７８０８２．１）、油菜 ＷＲＫＹ７０（ＡＣＱ７６８１０．１）和西
瓜 ＷＲＫＹ７０（ＡＣＶ２９８７４．１）聚为紧密一支，说明它们
的亲缘关系较近，与来自大麦的 ＷＲＫＹ４（ＡＢＲ８７００２．１）
距离最远。
２．３ 原核表达载体的构建和重组子鉴定
利用犅犪犿犎Ⅰ和犛犿犪Ⅰ对犛狋犠犚犓犢６ｐＭＤ１９Ｔ
载体和原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２进行双酶切，然后纯
化酶切产物、连接，构建重组表达载体。单克隆经菌落
ＰＣＲ检测，可扩增出１条９９０ｂｐ左右插入片段，与目
的片段（９９０ｂｐ）分子量基本相符；通过双酶切鉴定可
将重组质粒酶切为９９０ｂｐ左右的片段和４９００ｂｐ左
右片段（图４）。载体ｐＧＥＸ４Ｔ２的分子量是４９００
ｂｐ。重组质粒经测序表明，与克隆序列完全一致，开
放阅读框正确。表明犛狋犠犚犓犢６的原核表达载体构
建成功。
２．４ 目的蛋白表达的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
在３７和１８℃的温度条件下分别添加０．２和０．５
ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ对含有重组质粒的大肠杆菌ＤＥ３进行
诱导目的蛋白的表达，结果表明在１８℃条件下诱导该
融合蛋白的表达量高于在３７℃条件下（结果未显示），
在１８℃条件下使用０．２和０．５ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导
时，目的蛋白没有显著差异。因此确定ＳｔＷＲＫＹ６蛋
白最佳诱导条件是在１８℃培养条件下添加０．２
ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ。ＳｔＷＲＫＹ６蛋白分子量３９．６ｋＤ，加
上ＧＳＴｔａｇ标签蛋白２６ｋＤ，融合蛋白分子量应为６６
ｋＤ左右，含有目的质粒的大肠杆菌经过诱导表达出蛋
白分子量约６６ｋＤ左右，与理论值相符，而含有空载体
０８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
菌株未见表达出目的蛋白（图５）。
图５ 犌犛犜犛狋犠犚犓犢６表达产物的犛犇犛－犘犃犌犈
犉犻犵．５ 犛犇犛－犘犃犌犈狅犳犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犌犛犜犛狋犠犚犓犢６犻狀犅犔２１
Ｍ：蛋白质分子量标准；１：未诱导的空载体；２：未诱导的重组质粒；
３：用０．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导的空载体；４：用０．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导
的重组质粒；箭头示表达的目的蛋白 Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１：ｐＧＥＸ４Ｔ
２ｐｌａｓｍｉｄｂｅｆｏｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；２：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｅｆｏｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；
３：ｐＧＥＸ４Ｔ２ｐｌａｓｍｉｄｉｎｄｕｃｅｄｂｙ０．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ；４：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄｉｎｄｕｃｅｄｂｙ０．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ；Ａｒｒｏｗｓｈｏｗｓｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎ
图６ 犌犛犜犛狋犠犚犓犢６纯化产物的犛犇犛犘犃犌犈
犉犻犵．６ 犛犇犛犘犃犌犈狅犳狆狌狉犻犳犻犲犱犌犛犜犛狋犠犚犓犢６
Ｍ：蛋白质分子量标准；１：纯化的 ＧＳＴＳｔＷＲＫＹ６蛋白 Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｍａｒｋｅｒ；１：ＰｕｒｉｆｉｅｄＧＳＴＳｔＷＲＫＹ６
２．５ 目的蛋白纯化的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
纯化的结果表明，ＧＳＴＳｔＷＲＫＹ６融合蛋白在大
肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得高效表达。试验表明在
１８℃条件下添加０．２ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导８ｈ后可得到
大量融合蛋白。纯化后融合蛋白约为６６ｋＤ（图６），
ＳＤＳＰＡＧＥ显示其条带特异性好，纯度高。
３ 讨论
植物中 ＷＲＫＹ蛋白结构的共同特点含有１～２
个 ＷＲＫＹ 结构域，结构域 Ｃ端具有一个 Ｃ２Ｈ２ 或
Ｃ２ＨＣ的锌指结构。根据 ＷＲＫＹ结构域的数目和锌
指结构的类型，ＷＲＫＹ蛋白可分成３组：第１组含２
个 ＷＲＫＹ结构域，锌指结构模式为ＣＸ４５ＣＸ２２２３Ｈ
ＸＨ，第２和３组均含１个 ＷＲＫＹ结构域，第２组锌
指结构模式与第１组相同；第３组仅在组成锌指的氨
基酸有变化，ＣＸ７ＣＸ２２２３ＨＸＣ［１８］。在高等植物中，
第３组 ＷＲＫＹ蛋白占该家族成员的２０％，在低等植
物例如苔藓（犅狉狔狅狆犺狔狋犪）植物中不存在［１９］。表明该类
ＷＲＫＹ蛋白可能处在陆生植物进化的较后位置，可能
与高等植物适应复杂多变的环境相关。应用生物信息
学的相关软件可以根据已知生物的基因组图谱和功能
信息，来预测未知基因和功能蛋白的相关信息和构建
物种遗传图谱；是当前研究生物基因组学的主要手段
之一［２０］。本研究以ＧｅｎＢａｎｋ中其他学者已公布序列
（ＥＵ０５６９１８．１）设计引物，利用 ＲＴ－ＰＣＲ 获得了
犛狋犠犚犓犢６的ｃＤＮＡ序列。分析比对后发现，其与已
公布ｃＤＮＡ序列一致，说明对于同种植物，该基因十
分保守，系统进化分析表明该蛋白与其他物种间的同
源性较低，为２１％～６３％，这与其他学者的研究一致，
即属内同源性高，属间相对低［２１，２２］。
目前关于 ＷＲＫＹ 蛋白二级结构研究不多，Ｙａ
ｍａｓａｋｉ等［２３］采用核磁共振技术对 ＡｔＷＲＫＹ４４蛋白
Ｃ末端 ＷＲＫＹ结构域进行分析，发现Ｃ末端由４条β
链折叠组成，ＷＲＫＹＧＱＫ位于β链的Ｎ端，其中甘氨酸残基处形成扭结使得色氨酸残基具有很强的疏水作用，
这有助于β链折叠。Ｄｕａｎ等
［２４］研究ＡｔＷＲＫＹ１蛋白Ｃ末端晶体结构域发现它由５个β链组成１个反向平行的
β折叠球形结构，在另一端存在１个新型锌离子结合位点。通过 ＡｎｔｈｅＰｒｏｔ３Ｄ 蛋白软件分析，本研究中
ＳｔＷＲＫＹ６蛋白的二级结构中螺旋占２７％，折叠占１８％，转角占２７％，蜷曲占２８％。这为进一步研究该蛋白的
结构提供一定的线索。通过氨基酸序列分析比对，ＳｔＷＲＫＹ６蛋白属于第３组，构建系统发育树的结果表明
ＳｔＷＲＫＹ６与拟南芥的 ＷＲＫＹ７０、油菜 ＷＲＫＹ７０ 和西瓜 ＷＲＫＹ７０聚为紧密一支。拟南芥第３组成员
ＷＲＫＹ７０敲除的突变体能降低ＳＡ（水杨酸）介导对二孢白粉菌抗性，而超表达植株能提高这种抗性，但会降低
ＪＡ（茉莉酸）介导的对甘蓝黑斑病抗性，因此ＡｔＷＲＫＹ７０在拟南芥ＳＡ和ＪＡ防御信号途径起到一个重要的平衡
作用［１９］。油菜ＢｎＷＲＫＹ７０也属于第３组成员，该蛋白能在转录水平上参与调节与真菌侵染和激素刺激相关的
１８１第２０卷第２期 草业学报２０１１年
基因［２５］，而西瓜ＣｌＷＲＫＹ７０的功能未见报道。由于 ＡｔＷＲＫＹ７０和 ＢｎＷＲＫＹ７０被报道与植物的病菌侵染相
关，因此推测ＳｔＷＲＫＹ６可能与马铃薯的抗病性相关，当然这还需要通过进一步实验证明。现在已报道的第３组
成员还包括在大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）中克隆的ＧｍＷＲＫＹ５７Ｂ，通过将该基因在烟草中的过量表达，可以提高转基因
烟草的抗旱性［２６］。因此到目前为止 ＷＲＫＹ家族第３组成员主要被发现与植物的生物和非生物胁迫相关。
目前，已经在公共数据库中发表了多个物种的 ＷＲＫＹ基因序列，其数目已经超过１０００个，目前 ＷＲＫＹ蛋
白的研究主要集中在拟南芥、水稻和玉米等已经测序完成的物种。马铃薯作为一种世界范围内重要的经济作物，
相比较而言，ＷＲＫＹ转录因子的研究较少，ＳｔＷＲＫＹ１是采用差减杂交的方法从马铃薯中分离到１个 ＷＲＫＹ基
因，该基因编码１７２个氨基酸，并包含１个 ＷＲＫＹ结构域。该基因是受到软腐病诱导表达，但是ＳＡ、ＭＪ（茉莉酸
甲酯）、乙烯和伤害对它的表达没有影响，推测它参与马铃薯软腐病的抵御过程［２７］。ＳｃＷＲＫＹ１转录因子是从野
生马铃薯胚珠中分离到的，它在受精后１６ｄ的鱼雷期胚胎中有瞬时高表达，但是在已完全发育的果实、根、茎和
花瓣中表达量很低，表明ＳｃＷＲＫＹ１可能参与胚胎形成过程［３］。本研究克隆了马铃薯中 ＷＲＫＹ６的完整编码
框，并成功在大肠杆菌中表达和纯化出特异性高的融合蛋白，进一步的工作可以采用凝胶电泳迁移改变实验来验
证其是否具有结合 Ｗ盒的能力，以及采用瞬时表达融合ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）的方法来研究其定位，这些对于确
定该 ＷＲＫＹ转录因子的功能是必需的。虽然马铃薯中 ＷＲＫＹ转录因子的研究起步较晚，但是该物种的基因组
序列框架图在２００９年９月已完成。相信以此为契机将来会有更多的 ＷＲＫＹ转录因子的信息被注释。ＷＲＫＹ
蛋白中保守的 ＷＲＫＹ结构域可以结合启动子区域的 Ｗ盒，因此所有启动子区域含有 Ｗ 盒的基因都有可能是其
靶基因。这其中包括 ＷＲＫＹ基因本身［１８］。随着马铃薯基因信息的日益完善，寻找 ＷＲＫＹ转录因子靶基因将成
为可能，这对于阐明 ＷＲＫＹ转录因子调控植物生理机制具有重要的意义。
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犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅｒｅａｒｅｍａｎｙＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎＷＲＫＹｆａｍｉｌｙ．Ｔｈｅｙａｒｅｗｉｄｅｌｙｉｎ
ｖｏｌｖｅｄｉｎｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ；ａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ；ｇｒｏｗｔｈ；ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｌｏｎｉｎｇ犠犚犓犢６ｆｒｏｍ
ｐｏｔａｔｏｂｙｈｏｍｏｌｏｇｙｃｌｏｎｉｎｇ．Ａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅ犠犚犓犢６ｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅｔｈｉｒｄｇｒｏｕｐｏｆＷＲＫＹｆａｍｉｌｙｍｅｍ
ｂｅｒｓ，ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｓＣＸ７ＣＸ２３ＨＸＣ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗ犠犚犓犢６ｉｓｔｈｅｍｏｓｔｃｌｏｓｅｓｔｔｏＡｔ
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ｈｏｓｔｂａｃｔｅｒｉａ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻（ＤＥ３）ｉｓｇｒｏｗｉｎｇｆｏｒ８ｈｏｕｒｓｕｎｄｅｒ１８℃ａｄｄｉｎｇ０．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ
Ｄｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ），ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｉｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｌａｙａｓｏｌｉｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｔｏｆｕｒ
ｔｈｅｒｓｔｕｄｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆ犠犚犓犢６．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｐｏｔａｔｏ（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）；ＷＲＫＹｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
３８１第２０卷第２期 草业学报２０１１年