全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（１）：６７ ７３
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０１００６７０７
苹果属无融合生殖 ＳＥＲＫ１基因的克隆与
生物信息学分析
张丽杰１，Ｍｏｈａｍｅｄｈａｍａｄ２，董文轩２，郭苏漫２，孟庆娇３
（１．沈阳农业大学林学院，沈阳 １１０８６６；２．沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳 １１０８６６；
３．辽宁省本溪市桓仁县林业局，辽宁 本溪 １１７２０１）
收稿日期：２０１５０６２６
基金项目：国家自然科学基金 “苹果属四倍性皱叶矮生株系的生殖特征及形成机理研究”（３０９７１９７５）
作者简介：张丽杰（１９７２—），博士，副教授。硕士生导师；主要研究方向：林木种质资源和生物技术。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｉｊｉｅ＿１０６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者：博士，教授。博士生导师；主要研究方向：果树种质资源与评价。Ｅｍａｉｌ：ｗｘｄｏｎｇ６３＠１２６．ｃｏｍ。
摘要：［目的］为探讨苹果属植物无融合生殖分子机制。［方法］以苹果属平邑甜茶及杂种后代３３＃为试材，以苹果基
因组ＣＤＳ序列设计引物，通过ＰＣＲ扩增技术克隆出 ＳＥＲＫ同源基因的 ｃＤＮＡ全长序列，命名为 ＭｈＳＥＲＫ１和 Ｍｈｄ
ＳＥＲＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＪＱ２３１２７３和ＪＱ２３１２７２），利用实时定量ＲＴｑＰＣＲ的方法检测了这两个基因在平邑甜茶和杂
种后代各组织和器官中的表达模式。［结果］序列分析显示ＭｈＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１编码区序列全长为１８９９ｂｐ和
１８８１ｂｐ，分别编码６３２和６２６个氨基酸，其氨基酸序列与其他植物的ＳＥＲＫ１同源基因所编码的氨基酸同源性都在
８０％以上，特别是与葡萄科龙眼品种同源性最高，高达９２．５６％，与模式植物拟南芥、烟草等植物的 ＳＥＲＫ同源基因
都具有很高的同源性。实时定量ＰＣＲ结果表明，在平邑甜茶和杂种后代不同组织、花器官中 ＳＥＲＫ１基因的表达量
存在差异，其中在子房中的表达量最高，在营养生长的组织中表达量很低，在平邑甜茶花蕾期的子房中表达量最高。
［结论］推测该基因在平邑甜茶和杂种后代的生殖发育过程中可能发挥重要作用。
关键词：苹果属；ＳＥＲＫ；同源基因；生物信息学分析
中图分类号：Ｓ６６１１ 文献标识码：Ａ
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＡｐｏｍｉｃｘｉｓＳＥＲＫ１ＧｅｎｅｓｉｎＭａｌｕｓ
ＺＨＡＮＧＬｉｊｉｅ１，ＭＯＨＡＭＥＤＨａｍａｄ２，ＤＯＮＧＷｅｎｘｕａｎ２，ＧＵＯＳｕｍａｎ２，ＭＥＮＧＱｉｎｇｊｉａｏ３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；３．ＦｏｒｅｓｔｒｙＢｕｒｅａｕｏｆＨｕａｎｒｅｎＣｏｕｎｔｙ，Ｂｅｎｘｉ １１７２０１，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐｌａｎｔｓＭａｌｕｓｈｕｐｅｈｅｎｓｉｓｖａｒ．ｐｉｎｇｙｉｅｎｓｉｓＪｉａｎｇ（ＰｉｎｇｙｉＴｉａｎｃｈａ）ａｎｄａｈｙｂｒｉｄｓｔｒａｉｎ３３＃ｗｅｒｅｅｍ
ｐｌｏｙｅｄａｓｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍａｔｅｒｉａｌｓ．ＢｙＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄｐｒｉｍｅｒｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅＣＤＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆａｐｐｌｅｇｅｎｏｍｅ，ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＳＥＲＫｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｎａｍｅｄａｓ
ＭｈＳＥＲＫ１ａｎｄＭｈｄＳＥＲＫ１（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＪＱ２３１２７３ａｎｄＪＱ２３１２７２），ａｎｄｔｈｅｎＳＥＲＫｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｏｒｇａｎｓｏｆＰｉｎｇｙｉＴｉａｎｃｈａａｎｄｔｈｅｈｙｂｒｉｄｓｔｒａｉｎｔｈｒｏｕｇｈＲｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ
ｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｂｏｕｔＭｈＳＥＲＫ１ａｎｄＭｈｄＳＥＲＫ１ｗｅｒｅ１８９９
ｂｐａｎｄ１８８１ｂｐ，ｗｈｉｃｈｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｅｎｃｏｄｅｄ６３２ａｎｄ６２６ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆＳＥＲＫ１ｗａｓ８０％ ｏｒｍｏｒｅ，ｅｓｐｅｃｉａｌｙｗｉｔｈＬｏｎｇａｎｇｒａｐｅ（Ｖｉｔａｃｅａｅ），ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｒｅａｃｈ
９２．５６％，ａｎｄｉｔａｌｓｏｈａｄａｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｐｌａｎｔＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄｔｏｂａｃｃｏ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅ
ａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＳＥＲＫ１ｇｅｎｅｗｅｒｅｄｉｆｅｒｅｎｔａｍｏｎｇｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓ
ａｎｄｏｒｇａｎｓｏｆＰｉｎｇｙｉＴｉａｎｃｈａａｎｄｈｙｂｒｉｄｓｔｒａｉｎ，ｗｈｉｃｈｗａｓｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｏｖａｒｙ，ｖｅｒｙｌｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｌｅｖｅｌｓｉｎｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｏｖａｒｙｏｆｔｈｅｆｌｏｗｅｒｂｕｄｏｆＰｉｎｇｙｉＴｉａｎｃｈａ，ｉｎｄｉ
林 业 科 学 研 究 第２９卷
ｃａｔｉｎｇｔｈａｔＳＥＲＫ１ｇｅｎｅｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆＰｉｎｇｙｉＴｉａｎｃｈａ
ａｎｄｈｙｂｒｉｄｓｔｒａｉｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍａｌｕｓ；ＳＥＲＫ；ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｇｅｎｅ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓ
平邑甜茶 （Ｍａｌｕｓｈｕｐｅｈｅｎｓｉｓｖａｒ．ｐｉｎｇｙｉｅｎｓｉｓ
Ｊｉａｎｇ）是蔷薇科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）苹果属（ＭａｌｕｓＭｉｌ）湖
北海棠（Ｍａｌｕｓｈｕｐｅｈｅｎｓｉｓ（Ｐａｍｐ．）Ｒｅｈｄ．）的一个变
种，是典型的无融合生殖型三倍体植物［１－３］。
平邑甜茶具有高度的无融合生殖能力，是无融
合生殖型矮化砧木育种的重要母本材料［４］。由于苹
果属无融合生殖植物多为兼性无融合生殖，利用这
一特点课题组以平邑甜茶为母本，山定子（Ｍａｌｕｓ
ｂａｃｃａｔａ（Ｌｉｎｎ．）Ｂｏｒｋｈ．）为父本进行有性杂交后获
得了四倍性皱叶矮生型杂种后代，而且四倍性的来
源应该是平邑甜茶的三倍性加上父本花粉的单倍性
构成［５－６］，这些杂种后代经鉴定无融合生殖能力显
著下降［７－８］。而关于无融合生殖能力下降的原因及
分子机理方面的国内外未见报道。林庆光等［９］研究
表明，ＳＥＲＫ基因参与孢子体的发育仅在拟南芥（Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）中有报到，通过对拟
南芥 ＳＥＲＫｓ基因的研究发现，ＳＥＲＫ基因参与雄蕊
发育，ＡｔＳＥＲＫ１和 ＡｔＳＥＲＫ２在拟南芥的营养组织和
生殖组织中都有表达；在生殖器官中，ＡｔＳＥＲＫ１和
ＡｔＳＥＲＫ２在花药发育前 ６个阶段 ＳＥＲＫ１和 ＳＥＲＫ２
广泛表达，之后在花药发育晚期，两基因集中在绒毡
层中表达［１０－１４］。因此，两基因不仅参与了孢子体的
发育，而且二者之间可能存在功能上的互补作用。
鉴于ＳＥＲＫ及其同源基因在高等植物小孢子发
育和生殖发育过程中的重要作用，对苹果属平邑甜
茶和杂种后代中ＳＥＲＫ同源基因进行克隆和表达情
况进行研究，通过分析 ＳＥＲＫ基因在植物无融合生
殖中的具体作用方式，探讨苹果属植物无融合生殖
分子机制与其他模式植物之间的差异，为进一步深
入研究无融合生殖的遗传机制，为利用无融合生殖
固定杂种优势开辟一条新的途径。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
试材取自沈阳农业大学园艺学院果树试验基
地，于２０１０—２０１３年５月中上旬选取苹果属三倍性
平邑甜茶（３ｎ）和四倍性杂种后代（４ｎ）皱叶矮生株
系萌发的幼嫩叶片、发育时期的子房、花各部分器
官，每份样品约１ ３ｇ，用锡箔纸包裹后液氮速冻
放入－７０℃冰箱冷冻保存备用。
１．２ 方法
１．２．１ 核酸提取 采用常规 ＣＴＡＢ法［１５］提取平邑
甜茶和杂种后代株系基因组 ＤＮＡ，利用 ＴＩＡＮＧＥＮ
多糖多酚试剂盒提取ＲＮＡ。利用１．０％琼脂糖凝胶
电泳检测核酸的完整性，用 ＤＵ８００核酸蛋白分析仪
（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）检测核酸的纯度。
１．２．２ 引物设计 依据 ＮＣＢＩ美国生物技术公司
（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）中注册的 Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ，ｃａｒｏｔ，ｃａｃａｏ，ＣｉｔｒｕｓａｎｄＭｅｄｉｃａｇｏ的 ＳＥＲＫ基
因ＣＤＳ序列，ＣｌｕｓｔａｌＷ多重序列比对，根据ＳＥＲＫ基
因的保守序列设计引物用于扩增 ＳＥＲＫ基因家族片
段；根据已获得的ＳＥＲＫ１基因片段，经过ＮＣＢＩ数据
库Ｂｌａｓｔ分析，确定该 ＳＥＲＫ基因家族片段在金冠苹
果基因组序列的位置，与 ＭＤＰ００００４３２４６编码的未
注释基因功能的序列同源性达到１００％，判断已分
离获得平邑甜茶和杂种后代的 ＳＥＲＫ基因片段；根
据查找到的与 ＳＥＲＫ基因同源的 ＣＤＳ序列，利用
ＰｒｉｍｅｒＰｒｉｍｅｒ５．０软件分别设计上下游引物，扩增
ｃＤＮＡ全长和 ＤＮＡ全长；引物由北京赛百盛生物技
术有限公司合成。其序列见表１。
表１ 用于扩增平邑甜茶和杂种后代 ＳＥＲＫ基因引物
引物 序列（５′→３′） 用途
ＳＥＲＫ１
Ｆ：ＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＣＡＧＣ
Ｒ：ＣＣＣＡＣＡＡＣＡＧＣＣＴＣＡＡＡＣ
ＳＥＲＫ１基因
片段的分离
ＳＥＲＫ１
Ｆ：ＡＴＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴＴＣ
Ｒ：ＴＣＡＴＣＴＡＧＧＡＣＣＧＧＡＣＡＡＣＴＣＡＴ
ＳＥＲＫ１ｃＤＮＡ、
ＤＮＡ全长
ＳＥＲＫ１Ｆ
ＳＥＲＫ１Ｒ
ＣＧＧＴＴＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＣＣＴＴ
ＧＧＴＧＡＡＴＡＡＴＣＴＴＣＧＧＧＴＣ
ＳＥＲＫ１实时
定量ＲＴＰＣＲ
１８ＳＦ
１８ＳＲ
ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴ
ＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＡＡＧＧ
１８Ｓ实时
定量ＲＴＰＣＲ
１．２．３ ＰＣＲ与 ＲＴＰＣＲ ＲＴＰＣＲ反转录 ｃＤＮＡ的
合成利用宝生物工程（大连）有限公司的 Ｐｒｉｍｅ
ＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈＤＮＡＥｒａｓｅｒ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌ
Ｔｉｍｅ）试剂盒将 ＲＮＡ反转录为 ｃＤＮＡ，作为 ＰＣＲ模
板备用。
ＤＮＡ基因片段克隆，所用 ＰＣＲ反应体系 ２０
μＬ：１μＬＤＮＡ加入ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶０．２５μＬ，１０
×Ｂｕｆｅｒ２μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ·μＬ－１）１．６μＬ，正
反向引物（１０μｍｏｌ）各１μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，最后用
８６
第１期 张丽杰，等：苹果属无融合生殖ＳＥＲＫ１基因的克隆与生物信息学分析
灭菌水补足到总体积２０μＬ。ＰＣＲ反应扩增程序为
９５℃ ５ｍｉｎ；９４℃ ３０ｓ，６０℃退火１ｍｉｎ，７２℃ １ｍｉｎ，
３５个循环；７２℃延伸 １０ｍｉｎ结束，４℃保存。
ｃＤＮＡ和 ＤＮＡ全长获得：ＰＣＲ反应体系（２５
μＬ）取 １μＬｃＤＮＡ（ＤＮＡ）加入 ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶
０．４μＬ，ＥｘＴａｑＢｕｆｅｒⅡ（ＴＩＡＮＧＥＮ）２．５μＬ，ｄＮＴＰｓ
（２．５ｍｍｏｌ·μＬ－１）２．０μＬ，引物（１０μｍｏｌ）各１μＬ，
最后用灭菌水补足到 ２５μＬ进行 ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ
反应扩增程序为 ９５℃ ５ｍｉｎ；９４℃ ４０ｓ，６０℃ １ｍｉｎ，
７２℃ １．５ｍｉｎ，３５个循环；７２℃ １０ｍｉｎ。用含 ＥＢ
（０５μｇ·ｍＬ－１）的 １．０％琼脂糖凝胶电泳检测扩
增产物。
１．２．４ 序列测定和分析 利用 ＡｘｙＰｒｅｐＤＮＡ凝胶
回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收 ＰＣＲ扩增片段，并
与ＴＡ克隆载体ＰＧＭＴ连接，转化 ＴＯＰ大肠杆菌感
受态细胞，通过蓝白斑筛选 ＰＣＲ鉴定阳性克隆，由
北京华大基因科技公司测序。将获得的序列在 ＮＣ
ＢＩ数据库（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）中进行
Ｂｌａｓｔ检索分析，利用ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８３、ＤＮＡＭＡＮ６．０软
件进行多序列比对，用 ＥｘＰＡＳｙ软件在线分析
ＳＥＲＫ１基因编码氨基酸的蛋白质结构。
１．２．５ 实时定量 ＲＴｑＰＣＲ 提取总 ＲＮＡ，利用
ＴＩＡＮＧＥＮ生化科技公司的实时荧光定量试剂盒２．５
×ｒｅａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｃａｔ＃ＦＰ２０２０２）进行反转录，根据
已获得的 ＳＥＲＫ基因片段，利用软件 ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ
５．０设计ＰＣＲ特异性引物（引物序列见表１）。实时
定量ＰＣＲ反应体积为２０μＬ，１μＬｃＤＮＡ（ＲＮＡ为 ２
μｇ），１０μＬ２．５×Ｍｉｘ，１０μｍｏｌ·Ｌ－１正反向引物各
１μＬ，剩余体积用超纯水补足，每个反应重复３次。
采用２步法反应程序：９５℃１０ｍｉｎ；９５℃１５ｓ，６０℃１
ｍｉｎ，７２℃ ３０ｓ，４０个循环，在 ＰＣＲ反应的第２步收
集荧光信号。以１８ＳｒＲＮＡ作为内参基因，超存水模
板为阴性对照，采用 ２－△△ＣＴ法计算相对表达量的高
低。荧光定量ＰＣＲ使用 ＴＩＡＮＧＥＮ生化有限公司的
ＲｅａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）试剂盒（ＦＰ２０２），Ｂｉｏ
ＲａｄｉＱ５（ａｄｍｉｎ）实时定量ＰＣＲ仪上完成。
２ 结果与分析
２．１ 苹果属ＳＥＲＫ１基因全长的获得
以苹果属平邑甜茶和杂种后代幼嫩叶片基因组
ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，分别得到一条长约７００
ｂｐ的特异条带（图１－Ａ，Ｂ），测序结果表明，该片段
长度 是 ７０５ｂｐ，与 蔷 薇 科 玫 瑰 （Ｒｏｓａｒｕｇｏｓａ
Ｔｈｕｎｂ．）、拟南芥及烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）等的
ＳＥＲＫ同源基因的同源性均在８０％以上，表明该片
段是ＳＥＲＫ的同源基因片段。
Ａ：Ｍ：１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；平邑甜茶ＳＥＲＫ基因片段扩增；泳道１：ＳＥＲＫ１；Ｂ：Ｍ：１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；杂种后代３３３ＳＥＲＫ基因家族片段扩
增；泳道１：ＳＥＲＫ１；Ｃ：Ｍ：ＤＬ２０００；ＳＥＲＫ１基因 ｃＤＮＡ全长序列；泳道１：平邑甜茶；２：杂种后代；Ｄ：Ｍ：ＤＬ２０００；平邑甜茶和杂种后代３３＃
ＳＥＲＫ１基因ＤＮＡ全长序列；泳道１：平邑甜茶；泳道２：杂种后代３３＃
图１ 平邑甜茶和杂种后代３３＃ＳＥＲＫ１基因的ＰＣＲ扩增结果
基于已获得的苹果属平邑甜茶和杂种后代的
ＳＥＲＫ１同源基因片段，经过 ＮＣＢＩ数据库 Ｂｌａｓｔ分
析，确定该ＳＥＲＫ基因家族片段在金冠苹果基因组
序列的位置，分别与 ＭＤＰ００００４３２４６６编码的未注释
基因功能的序列同源性达到１００％，根据苹果基因
组的ＳＥＲＫ基因同源 ＣＤＳ序列，利用 ＰｒｉｍｅｒＰｒｉｍｅｒ
５．０软件分别设计上下游引物，进行ＰＣＲ扩增，分别
得到平邑甜茶和杂种后代的一条大约２０００ｂｐ的特
异谱带（图１－Ｃ），克隆测序后结果表明该条带长度
分别为１８９９ｂｐ和１８８１ｂｐ，分别编码６３２和６２６个
氨基酸。该ＳＥＲＫ１同源基因在 ＣＤＳ长度上与其他
植物的核酸序列进行比对，结果表明：与金冠苹果的
核酸序列同源性达到９５．０１％，与甜橙（Ｃｉｔｒｕｓｓｉｎｅｎ
ｓｉｓ（Ｌ．）Ｏｓｂｅｃｋ）（ＦＪ８５１４２２．１）核苷酸序列同源性
９６
林 业 科 学 研 究 第２９卷
达到８６％，说明已经克隆获得了平邑甜茶和杂种后
代的ＳＥＲＫ１ｃＤＮＡ全长序列，于是将克隆出的平邑
甜茶和杂种后代的ＳＥＲＫ１同源基因分别命名为Ｍｈ
ＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１，并将序列全长提交到ＮＣＢＩ数
据库中（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号：ＪＱ２３１２７２和ＪＱ２３１２７３）。
为进一步分析 ＳＥＲＫ１基因的外显子和内含子，
以基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，得到了长约７
ｋｂ的两条带（图 １－Ｄ）；克隆测序结果分析表明，
ＭｈＳＥＲＫ１和 ＭｈｄＳＥＲＫ１的 ＤＮＡ序列全长分别为
６８８６ｂｐ、６７１９ｂｐ，均有１１个外显子，１０个内含子，
ＭｈＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１各内含子长短相近，其中内
含子３最长１６９５ｂｐ，内含子１次之，有８２５ｂｐ，内含
子１０为７０８ｂｐ，内含子４长度为５０４ｂｐ，内含子７
长度为５４５ｂｐ，其余内含子较短；ＭｈＳＥＲＫ１和 Ｍｈｄ
ＳＥＲＫ１的内含子分布与龙眼（Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎ
Ｌｏｕｒ．）（登录号：ＨＭ７７３３９１）和番木瓜（Ｃａｒｉｃａｐａｐａ
ｙａＬｉｎｎ．）（ＥＦ６６１０２５）等同源基因类似。
２．２ ＭｈＳＥＲＫ１和 ＭｈｄＳＥＲＫ１基因的生物信息学
分析
２．２．１ ＭｈＳＥＲＫ１和 ＭｈｄＳＥＲＫ１编码蛋白聚类分析
及其序列特征 将克隆到的 ＭｈＳＥＲＫ１、ＭｈｄＳＥＲＫ１
ｃＤＮＡ序列利用 ＤＮＡＭＡＮ软件进行核苷酸序列同
源性分析，结果显示 ＭｈＳＥＲＫ１、ＭｈｄＳＥＲＫ１编码
６３２、６２６个氨基酸，该类基因编码蛋白的激酶结构
域高度保守，而且，这些 ＳＥＲＫ基因都具有 １个 ＳＰ
信号肽，１个亮氨酸拉链结构域，５个富亮氨酸重复
序列结构域 ＬＲＲ，１个 ＳＰＰ丝氨酸 －脯氨酸 －脯氨
酸模序，１个ＴＭ跨膜结构域以及３个胞内激酶活性
结构域和Ｃ末端结构域的特征（图２），属于典型的
ＳＥＲＫ／ＬＲＲＲＬＫｓ类基因，这一结果与前人研究的相
一致［１６］。
为探明该基因与其他物种的进化关系，利用
ＣＬＵＸＴＡＬ１．８、ＭＥＧＡ４方法对上述包括 ＭｈＳＥＲＫ１、
ＭｈｄＳＥＲＫ１在内的８个物种的 ＳＥＲＫ基因的氨基酸
序列聚类分析，绘制进化树（图３），聚类分析可以发
现平邑甜茶和杂种后代的 ＭｈＳＥＲＫ１、ＭｈｄＳＥＲＫ１首
先分别与棕榈科植物椰子 ＣｉｔＳＥＲＫ１和蔷薇科的蔷
薇ＲｃＳＥＲＫ１聚在一起，然后与其它物种的 ＳＥＲＫ／
ＬＲＲＲＬＫ类基因聚在一个大的分支上；分析结果表
明ＭｈＳＥＲＫ１、ＭｈｄＳＥＲＫ１在进化上属于 ＳＥＲＫ同源
基因中ＳＥＲＫ／ＬＲＲＲＬＫ类基因。
２．２．２ ＭｈＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１蛋白质结构分析
在获得ＭｈＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１核苷酸序列的基础
上，用 ＤＮＡＭＡＮ软件和 ＤＮＡＣｌｕｂ软件对其预测的
蛋白质氨基酸序列进行分析，结果表明，ＭｈＳＥＲＫ１、
ＭｈｄＳＥＲＫ１基因共编码６３２、６２６个氨基酸；用 Ｐｒｏｔ
Ｐａｒａｍ软件在线分析 ＭｈＳＥＲＫ１、ＭｈｄＳＥＲＫ１的氨基
酸序列理化参数，包括分子质量、理论等电点、氨基
酸组成、半衰期、不稳定系数和总平均疏水性等，分
析显示：推测平邑甜茶无融合生殖相关 ＭｈＳＥＲＫ１、
ＭｈｄＳＥＲＫ１基因的蛋白分子量分别是 ６９．５８ｋＤａ、
６８．８６ｋＤａ，理论推导半衰期均为３０ｈ，不稳定参数
是４１．２６、４１．０４，属于不稳定蛋白；理论等电点
５２２、５．４５。
２．２．３ ＭｈＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１氨基酸组成及理化
性质分析 ＰｒｏｔＰａｒａｍ在线软件对平邑甜茶和杂种
后代的 ＭｈＳＥＲＫ１和 ＭｈｄＳＥＲＫ１氨基酸组成进行分
析；结果表明 ＭｈＳＥＲＫ１和 ＭｈｄＳＥＲＫ１氨基酸组成
中含有亮氨酸 Ｌｅｕ（Ｌ）最多，为 １３．６％；Ｇｌｙ（Ｇ）和
Ｐｒｏ（Ｐ）次之，为７．８％、７．５％；不含吡咯赖氨酸 Ｐｙｌ
（Ｏ）和半胱氨酸Ｓｅｃ（Ｕ）。ＰｒｏｔＰａｒａｍ程序分析表明，
该蛋白带负电荷残基总数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）数为 ７１个，
带正电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）总数为 ５８个和５７个。总
的亲水性平均系数为 －０．１０４和 －０．１１８，预测该蛋
白属于亲水性蛋白。
２．３ ＭｈＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１基因表达模式分析
荧光实时定量 ＲＴＰＣＲ检测结果表明：Ｍｈ
ＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１无论是在三倍体平邑甜茶的子
房中，还是在杂种后代的子房中表达量都是最高的，
其次是在三倍体平邑甜茶的叶片、雄蕊和雌蕊中，而
在四倍体杂种后代的叶片、花瓣、雌蕊中表达量很
低，甚至不表达（图４）。作者还对 ＳＥＲＫ１基因在不
同花发育时期的表达量进行了检测分析，结果可以
看出（图５）：ＳＥＲＫ１在平邑甜茶花蕾期的子房中表
达量最高，其次是盛花期，花期后的子房中表达量最
低；而在杂种后代中花期后子房的表达量最高，其次
是花蕾期，在盛花期子房中的表达量最低；从而分析
ＳＥＲＫ１基因在平邑甜茶配子形成阶段起到调控作
用，而在四倍体杂种后代配子形成后期胚胎发育阶
段才开始表达，导致杂种后代的无融合生殖能力下
降，可能是主要原因。
０７
第１期 张丽杰，等：苹果属无融合生殖ＳＥＲＫ１基因的克隆与生物信息学分析
图２ ＭｈＳＥＲＫ１、ＭｈｄＳＥＲＫ１与其它ＳＥＲＫ同源基因编码的氨基酸序列比对
３ 结论和讨论
众多研究表明，ＳＥＲＫ同源基因广泛存在于双子
叶植物、单子叶植物和裸子植物中，组成了一个新的
基因家族［１７］。关于 ＳＥＲＫ基因的结构，研究得最清
楚和最彻底的是ＡｔＳＥＲＫ１，不同物种来源的ＳＥＲＫ基
因在结构上大多含有相似的内含子和外显子结构，
一般来说，ＳＥＲＫ基因由１１个外显子和１０个内含子
组成；这些区域中有５个 ＬＲＲ富亮氨酸重复序列结
构域和３个蛋白激酶结构域。因此，组成了植物受
体类蛋白激酶家族中最大的亚家族ＬＲＲＲＬＫ［１９］；富
亮氨酸重复类受体蛋白激酶在植物的生殖过程中参
与了 体 细 胞 胚 胎 发 生［２０，１０］、小 孢 子 分 化 发
育［２１，１１－１２］、细胞死亡调控［２２－２３］以及无融合生殖［２４］
１７
林 业 科 学 研 究 第２９卷
图３ ＭｈＳＥＲＫ１、ＭｈｄＳＥＲＫ１与其他ＳＥＲＫ同源基因
编码氨基酸的聚类分析
图４ ＳＥＲＫ１基因在平邑甜茶和杂种后代
不同器官组织中的表达
图５ ＭｈＳＥＲＫ１和ＭｈｄＳＥＲＫ１基因在花期的表达
过程，并发挥了重要的调控功能。本研究表明，从平
邑甜茶和杂种后代中分离得到的 ＭｈＳＥＲＫ１和 Ｍｈｄ
ＳＥＲＫ１基因在核酸和蛋白质水平上都与其他 ＳＥＲＫ
同源基因类似，都具有１个ＳＰ信号肽；１个ＺＩＰ亮氨
酸拉链；１个ＬＲＲ富亮氨酸重复序列；１个 ＳＰＰ富脯
氨酸结构域，１个 ＴＭ跨膜结构域；１个 Ｋｉｎａｓｅ激酶
活性结构域和 Ｃ端结构域；这一序列特征表明该
ＭｈＳＥＲＫ１和 ＭｈｄＳＥＲＫ１基因可能与其他物种中的
ＳＥＲＫ同源基因类似，在平邑甜茶和杂种后代生殖发
育过程中发挥着重要的调控作用。
实时定量结果表明，ＭｈＳＥＲＫ１和 ＭｈｄＳＥＲＫ１基
因主要是在生殖器官的子房中表达量最高，说明其
在植物生殖过程中发挥着重要作用；在本研究中，根
据ＳＥＲＫ基因在子房发育不同时期的表达情况，可
以推测在平邑甜茶和杂种后代中 ＳＥＲＫ１基因起到
了一定的调控作用：ＳＥＲＫ１基因在平邑甜茶胚胎发
育早期开始启动，在有性生殖过程中大孢子母细胞
未进入减数分裂前，也就是在花蕾期时 ＳＥＲＫ基因
的表达量是最高的；随着大孢子母细胞的发育在进
入四分体时期前由于ＳＥＲＫ基因的调控而终止了减
数分裂进程，而这个时期正好是盛花期，相对的
ＳＥＲＫ基因表达量也有所降低；此时，控制无融合生
殖的基因开始发挥作用，行无融合生殖方式，在花期
后的子房中ＳＥＲＫ基因的表达量继续降低，因此，说
明平邑甜茶具有较高的无融合生殖能力。而在杂种
后代株系中控制有性生殖的 ＳＥＲＫ基因在大孢子母
细胞发育时期也就是花蕾期时没有启动，使得有性
生殖过程得以正常进行，表现为有性生殖过程占绝
对优势，ＳＥＲＫ基因的表达量相对较低，在杂种后代
株系中随着大孢子母细胞的发育进入减数分裂（盛
花期），完成了双受精过程，所以 ＳＥＲＫ基因在花期
后子房的表达量达到最高，这可能就是后代无融合
生殖能力降低的主要原因。
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（责任编辑：彭南轩）
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