全 文 ：书马铃薯块茎犌犅犛犛Ⅰ基因的犮犇犖犃克隆
及其序列特征分析
沈宝云１，２，刘玉汇１，张俊莲１，２，王蒂１，２
（１．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：以马铃薯普通栽培种“甘农薯２号”块茎为材料，利用ＲＮＡ提取试剂盒提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ技术和
ＤＮＡ序列测定分析，证实获得了马铃薯颗粒结合淀粉合成酶（ＧＢＳＳＩ）基因的ｃＤＮＡ序列。该ｃＤＮＡ全长１８２４
ｂｐ，包括６０７个氨基酸和１个终止密码子序列，且与原序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＸ５８４５３）同源性为９９．７８％，但与其他
科植物ＧＢＳＳ基因的同源性较低，注册该基因到ＧｅｎＢａｎｋ中，注册号为ＥＵ４０３４２６。利用生物信息学相关软件分析
预测ＧＢＳＳＩ基因ｃＤＮＡ序列编码的蛋白质功能和结构，结果发现，该蛋白与其他１５种植物ＧＢＳＳ蛋白一样，具有
３个完全保守区域，并具许多重要功能位点，且与农杆菌淀粉合成酶具有相似三级结构模型，表明该蛋白具淀粉合
成功能。
关键词：马铃薯；颗粒结合淀粉合成酶基因；ＲＴ－ＰＣＲ技术；ＤＮＡ序列分析；蛋白质功能预测
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５３２．０３２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１０）０５０００８０８
 　 淀粉是高等植物光合产物主要储存形式。淀粉合成酶是调控淀粉生物合成的关键酶，它催化形成α１，４糖
苷键，将ＡＤＰ葡萄糖连接在α１，４葡聚糖的非还原端，延长α１，４葡聚糖链［１］。淀粉合成酶以２种形式存在，即
颗粒结合淀粉合成酶（ｇｒａｎｕｌｅｂｏｕｎｄｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅ，ＧＢＳＳ）和可溶性淀粉合成酶（ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅ，
ＳＳＳ），并具多种同工型。根据其编码基因的ｃＤＮＡ序列和以此推定的氨基酸序列的同源性差异将其分为：ＧＢＳＳ
Ⅰ、ＧＢＳＳⅡ、ＳＳＳⅠ、ＳＳＳⅡ、ＳＳＳⅢ等，其中ＧＢＳＳⅠ又称 Ｗａｘｙ蛋白，在淀粉贮存组织中对直链淀粉的合成起关
键作用［２］。
马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）是营养丰富、用途广泛的作物，除粮菜兼用外，其在食品加工、淀粉加工等方面
的作用更为重要。目前，马铃薯淀粉的生产量和商品量仅次于玉米淀粉，是位居第２的植物淀粉［３］。马铃薯淀粉
中，直链淀粉约占２０％～２５％，支链淀粉约占７５％～８０％，其淀粉含量及其直／支链淀粉比例是影响马铃薯加工
淀粉的产量及其在食品加工、造纸、化工等工业中的用途［４］。直链淀粉含量越高，分子间易结合，易发生凝沉，糊
化越难［５，６］，可用于胶片和胶条的制造，且该类胶片（条）具有突出的透明度、弹性、抗拉强度和抗水性。高直链淀
粉也是生产光解塑料的最佳原料，是解决“白色污染”的有效途径。高支链淀粉则具有较好的稳定性、溶解性、粘
滞性和透明性，适于作增稠预制剂、乳化剂、粘着剂等，被广泛用于香肠、汤羹类罐头、冷冻食品、膨化食品等食品
添加剂，也在造纸、纺织、建筑、石油化工等方面具有广泛用途［７，８］。因此，利用基因工程技术进行马铃薯ＧＢＳＳＩ
基因的过量表达或抑制表达，是改变马铃薯淀粉结构、获得高直链淀粉或高支链淀粉新品种、开拓马铃薯淀粉应
用新领域的最有效途径。本研究利用ＲＴ－ＰＣＲ技术（方法逆转录－聚合酶链反应，ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）从马铃薯块茎中克隆到ＧＢＳＳⅠ基因的ｃＤＮＡ序列，同时利用基因和蛋白数据库资料对
该序列及其推导的氨基酸序列进行功能分析，为其进一步利用奠定良好基础。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　植物材料　马铃薯四倍体栽培种“甘农薯２号”的微型薯，由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室
（以下简称重点实验室）提供。整个试验于２００７年５月至２００８年１２月在重点实验室进行。
第１９卷　第５期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１－８
２０１０年１０月
 收稿日期：２００９０９１４；改回日期：２００９１０２２
基金项目：国家８６３计划（２００６ＡＡ１００１０７）资助。
作者简介：沈宝云（１９６５），男，甘肃景泰人，在读博士。
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｕｎｌｉａｎ９９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ，ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１．１．２　菌株和载体　大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）菌株ＤＨ５α感受态细胞、ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ［抗性标记为
氨苄青霉素（Ａｍｐｒ）］，购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。
１．１．３　酶和试剂　各种限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭＰｌａｎｔ
ＲＮＡＲｅａｇｅｎｔ、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭⅢ逆转录试剂盒购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（英杰）生命技术有限公司（以下简称Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ公司）；ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自北京天为时代公司；其他生化试剂为国产分析纯。
１．１．４　引物设计　根据ＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＸ５８４５３）中马铃薯ＧＢＳＳⅠ基因序列，设计１对引物，即上
游引物ｐ１：５′ＣＧＣＴＣＧＡＧ （ＸｈｏＩ）ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＣ３′，下游引物ｐ２：５′ＣＧＧＧＡＴＣＣ
（ＢａｍＨＩ）ＧＧＧＡＧＴＧＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣ３′，由北京赛百盛公司合成。
１．２　ＧＢＳＳＩ基因的ｃＤＮＡ克隆
１．２．１　逆转录合成ｃＤＮＡ第１链　１）总ＲＮＡ提取。利用ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭＰｌａｎｔＲＮＡＲｅａｇｅｎｔ试剂盒抽提马铃薯
块茎总ＲＮＡ，重复５次。提取方法见试剂盒说明书。整个实验操作严格按文献［９］的有关要求进行，防止ＲＮａｓｅ
污染。提取的总ＲＮＡ在经焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）处理的ｌ％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭（ＥＢ）染色后检查ＲＮＡ
的完整性；２）ｃＤＮＡ第１链合成。利用ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭⅢ逆转录试剂盒，其中以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０为引物，在 Ｍ－ＭＬＶ
反转录酶作用下合成ｃＤＮＡ第１链，具体操作过程见试剂盒说明书。３）保存。－２０℃下保存ｃＤＮＡ第１链。
１．２．２　ＰＣＲ扩增　以ｐ１和ｐ２为引物，在ＴａｑＤＮＡ聚合酶作用下，克隆ＧＢＳＳⅠ基因的ｃＤＮＡ序列，重复５次。
扩增反应体系为２５μＬ，由２μＬｃＤＮＡ摸板、２．５μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ、１μＬｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、１μＬ引物ｐ１（１０
ｍｍｏｌ／Ｌ）、１μＬ引物ｐ２（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．５μＬＴａｑＤＮＡ聚合酶、１７μＬｄｄＨ２Ｏ组成。扩增条件为：９４℃预变性１
ｍｉｎ后，进行９４℃５０ｓ、５３℃５０ｓ、７２℃２ｍｉｎ的３５个循环，再在７２℃下延伸１０ｍｉｎ。扩增产物ＥＢ染色后在
１％琼脂糖凝胶上电泳检测。
１．２．３　ｃＤＮＡ序列与Ｔ载体连接　扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳分离后回收，回收方法见试剂盒说明书。回
收产物与ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ载体连接，然后转化感受态细胞，连接和转化方法见试剂盒说明，重复１０次。
１．２．４　重组质粒的获得　将转化细胞涂布在含５０μｇ／ｍＬＡｍｐ
ｒ、ｌ００μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）５溴４氯３吲哚βＤ半乳
糖苷（Ｘｇａｌ）和１２μＬ（０．８ｍｏｌ／Ｌ）异丙基βＤ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）的ＬＢ平板上进行蓝白斑筛选，对所获得的
白斑通过滞后质粒、ＰＣＲ扩增、ＸｈｏＩ和ＢａｍＨＩ双酶切鉴定，重复１０次，－８０℃下保存。
１．３　序列测定及分析
送白斑菌株到上海生工公司测序，重复１０次。所测序列用Ｌｙｎｎｏｎｂｉｏｓｏｆｔ公司的ＤＮＡＭＡＮｖｅｒｓｉｏｎ６．０
软件进行分析。然后通过ＮＣＢＩ网站的ＢｌａｓｔＸ和ＢｌａｓｔＰ程序进行序列相似性分析和氨基酸保守性预测；用
ＣｌｕｓｔａｌＷ２网站的软件进行氨基酸序列比对和相似序列进化树分析；链接至ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ网站
进行蛋白质结构域分析；用ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎＳｅｒｖｅｒ网站的软件分析蛋白质二级结构；将ＧＢＳＳⅠ氨基酸序列提交
至Ｐｈｙｒｅ网站，进行ＧＢＳＳⅠ蛋白质三级结构预测及比
图１　马铃薯总犚犖犃
犉犻犵．１　犜狅狋犪犾犚犖犃狅犳犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿
对分析，并用Ｒａｓｍｏｌ２．６软件查看 ＧＢＳＳⅠ三级结
构。
２　结果与分析
２．１　马铃薯块茎ＧＢＳＳⅠ基因的ｃＤＮＡ克隆
马铃薯块茎由于富含多糖和酚类物质，其 ＲＮＡ
提取难度较大。本研究用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的 Ｐｕｒｅ
ＬｉｎｋＴＭＰｌａｎｔＲＮＡＲｅａｇｅｎｔ提取试剂盒进行块茎总
ＲＮＡ的提取，琼脂糖凝胶电泳结果显示，总ＲＮＡ的５
Ｓ，１８Ｓ和２８Ｓ三条带清晰、完整（图１），表明ＲＮＡ的
完整性良好，说明该试剂盒适合马铃薯块茎的总ＲＮＡ
提取。利用ｃＤＮＡ第１链合成试剂盒，在反转录酶 Ｍ
２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５
－ＭＬＶ的作用下，获得了马铃薯块茎的ｃＤＮＡ第１链。根据已发表的马铃薯ＧＢＳＳⅠ基因序列，利用设计的１
对特异性引物，以ｃＤＮＡ第１链为模板，在ＴａｑＤＮＡ聚合酶的作用下进行ＰＣＲ扩增，期望获得约１８２４ｂｐ大小
的ＤＮＡ片段。对扩增产物电泳检查结果表明，其大小与预期片段基本一致（图２），说明可能获得了ＧＢＳＳⅠ基
因的ｃＤＮＡ克隆。
２．２　重组质粒的获得
将扩增获得的ＧＢＳＳⅠ基因片段与Ｔ载体连接。蓝白斑筛选后，进行滞后质粒筛选（图３），然后利用ＰＣＲ及
ＸｈｏＩ和ＢａｍＨＩ双酶切鉴定。结果显示，扩增到或切下约１８２４ｂｐ大小的ＤＮＡ片段（图４ａ，ｂ），将其定义为
ｐＧＢＳＳＴ。
图２　马铃薯犌犅犛犛犐基因的犘犆犚扩增
犉犻犵．２　犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犌犅犛犛Ⅰ犵犲狀犲
Ｍ：ＭａｒｋｅｒＩＩＩ分子量标记 ＤＮＡｍａｒｋｅｒＩＩＩ；
１，２：ＰＣＲ扩增产物 ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｂｙＰＣＲ
图３　犜载体上滞后质粒的筛选
犉犻犵．３　犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犱犲犾犪狔犲犱狆犾犪狊犿犻犱狅犳犜狏犲犮狋狅狉
１－３：蓝斑Ｂｌｕｅｃｏｌｏｒｐｌａｓｍｉｄ；
４：白斑 Ｗｈｉｔｅｃｏｌｏｒｐｌａｓｍｉｄ
图４　白斑滞后质粒的犘犆犚及犅犪犿犎犐和犡犺狅犐酶切鉴定
犉犻犵．４　犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狑犺犻狋犲犮狅犾狅狉狆犾犪狊犿犻犱犫狔犘犆犚，犅犪犿犎犐犪狀犱犡犺狅犐
　１：滞后白斑质粒 Ｗｈｉｔｅｃｏｌｏｒｐｌａｓｍｉｄ；Ｍ：ＭａｒｋｅｒＩＩＩ分子量标记 ＤＮＡｍａｒｋｅｒＩＩＩ；ａ：白斑滞后质粒的ＰＣＲ酶切鉴定Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｃｏｌｏｒ
ｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＰＣＲ；ｂ：白斑滞后质粒的ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ酶切鉴定ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｃｏｌｏｒｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨＩａｎｄＸｈｏＩ
２．３　ＧＢＳＳⅠ基因的ｃＤＮＡ序列及蛋白序列分析
２．３．１　ＧＢＳＳⅠ基因的ｃＤＮＡ序列分析　将ｐＧＢＳＳＴ质粒交上海生工公司测序。测序结果与原序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒＸ５８４５３）比较后发现，二者同源性达９９．７８％，其开放阅读框架为１８２４ｂｐ，编码６０７个氨基酸和１个终
止密码子（ＴＡＡ）（图５）。将该基因登记在ＧｅｎＢａｎｋ中，登录号为ＥＵ４０３４２６。
３第１９卷第５期 草业学报２０１０年
图５　马铃薯犌犅犛犛Ⅰ基因的犮犇犖犃序列及其推测的氨基酸序列
犉犻犵．５　犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犌犅犛犛Ⅰ犮犇犖犃狅犳犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿
　□：蛋白保守区；———：蛋白激酶Ｃ磷酸化酶位点；【】：酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点；｛｝：酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点；：Ｎ端糖基化位点；：酰胺化
位点；■：Ｎ端酰基化位点 □：Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎ；———：ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；【】：Ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；｛｝：
ＣａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅＩＩｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；：Ｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；：Ａｍｉｄａｔｉｏｎｓｉｔｅ；■：Ｎｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ
用ＤＮＡＭＡＮ软件对该序列与ＧｅｎＢａｎｋ中登记的部分物种的ＧＢＳＳⅠ基因的ｃＤＮＡ序列进行同源性比较。
结果发现，该序列与其他学者登录的马铃薯ＧＢＳＳⅠ基因的同源性很高，达９９．２０％以上，但与其他科植物同源性
较低，为５９％～７７％。其中，与旋花科甘薯和大戟科木薯的同源性较高，其次为豆科类作物，而与禾本科作物的
４ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５
同源性较低（表１），说明同科植物特别是同种植物，该基因的保守性强，而不同科植物的ＧＢＳＳⅠ基因间差异较
大。
２．３．２　ＧＢＳＳⅠ基因的蛋白质序列特征分析　利用ＢｌａｓｔＰ软件在蛋白保守区数据库（ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＤａｔａ
ｂａｓｅ，ＣＤＤ）对包括该基因在内的１６种植物（１０种双子叶植物和６种单子叶植物）的蛋白保守区进行分析，结果
发现了３个完全保守区，即Ｇｌｙｃｏｓ＿ｔｒａｎｓｆ＿１（糖基转移酶，ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｇｌｇＡ（糖原／淀粉合成酶，ｇｌｙｃｏ
ｇｅｎ／ｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅｓ，ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅｔｙｐｅ）和Ｇｌｙｃｏ＿ｔｒａｎｓｆ＿５（淀粉合成酶催化区，ｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅｃａｔａｌｙｔｉｃｒｅ
ｇｉｏｎ），分别在９７－１０１（ＧＧＬＧＤ）、４８０－４９０（ＳＲＦＥＰＣＧＬＸＱＬ）和５０３－５１０（ＳＴＧＧＬＶＤＴ）氨基酸残基处（图５，
６），表明这些区域具有十分重要的功能，如ｇｌｇＡ为ＡＤＰ＿葡萄糖结合位点［１０１３］。
表１　马铃薯犌犅犛犛基因犮犇犖犃与其他植物犌犅犛犛基因犮犇犖犃序列同源性比较
犜犪犫犾犲１　犃犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犌犅犛犛犵犲狀犲狑犻狋犺狅狋犺犲狉犺狅犿狅犾狅犵狌犲狊
ＧＢＳＳ基因的ｃＤＮＡ来源
ｃＤＮＡｓｏｕｒｃｅｓｏｆＧＢＳＳｇｅｎｅ
所属科属
Ｆａｍｉｌｙｇｅｎｕｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登记号
ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｉｎＧｅｎＢａｎｋ
同源性
Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ（％）
马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 茄科茄属Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ，犛狅犾犪狀狌犿 Ｘ５８４５３ ９９．７８
马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 茄科茄属Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ，犛狅犾犪狀狌犿 Ｘ８３２２０ ９９．５１
马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 茄科茄属Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ，犛狅犾犪狀狌犿 Ａ２３７４１ ９９．２３
甘薯犐．犫犪狋犪狋犪狊 旋花科番薯属Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ，犐狆狅犿狅犲犪 ＡＢ０７１６０４ ７６．６１
木薯犕．犲狊犮狌犾犲狀狋犪 大戟科木薯属Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ，犕犪狀犻犺狅狋 Ｘ７４１６０ ７３．８８
黄芪犃．犕犲犿犫狉犪狀犪犮犲狌狊 豆科黄芪属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ，犃狊狋狉犪犵犪犾狌狊 ＡＦ０９７９２２ ７１．８８
菜豆犘．狏狌犾犵犪狉犻狊 豆科菜豆属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ，犘犺犪狊犲狅犾狌狊 ＡＢ０２９５４６ ７０．６６
拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪 十字花科拟南芥属Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ，犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 ＮＭ＿１０３０２３ ７０．２６
豌豆犘．狊犪狋犻狏狌犿 豆科豌豆属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ，犘犻狊狌犿 Ｘ８８７８９ ７０．１３
大豆犌．犿犪狓 豆科大豆属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ，犘犺犪狊犲狅犾狌狊 ＥＦ１５３１０１ ６９．５３
豇豆犞．狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪 豆科豇豆属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ，犌犾狔犮犻狀犲 ＥＦ４７２２５３ ６９．０５
玉米犣．犿犪狔狊 禾本科玉蜀黍属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犣犲犪 ＥＦ４７１３１２ ６６．２３
水稻犗．狊犪狋犻狏犪 禾本科稻属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犗狉狔狕犪 ＮＭ＿００１０６５９８５ ６５．９９
粟犛．犻狋犪犾犻犮犪 禾本科粟属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犛犲狋犪狉犻犪 ＡＢ０８９１４１ ６２．２２
高粱犛．犫犻犮狅犾狅狉 禾本科蜀黍属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犛狅狉犵犺狌犿 ＥＦ０８９８５８ ６０．８９
大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 禾本科大麦属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犎狅狉犱犲狌犿 ＡＢ１５４３５８ ６０．４８
小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 禾本科小麦属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犜狉犻狋犻犮狌犿 Ｙ１６３４０ ５９．８２
另外，该蛋白在第５７－５９，６６－６８，１２１－１２３，３１３－３１５，３６２－３６４，４３５－４３７，５１０－５１２和５６７－５６９处具有
蛋白激酶Ｃ功能（图５，用“———”表示），能将靶蛋白的Ｓｅｒ／ｔｈｒ磷酸化，从而激活细胞质中某些酶的活性，参与生
化反应调控；还可与核中转录因子相互作用，参与基因表达调控。在第３６４－３７０氨基酸处（图５，用“【】”表示），
该蛋白具有１个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点，可将自身的酪氨酸磷酸化或将各种不同靶蛋白的酪氨酸磷酸化来
实现信号传递，其转导的信号通常与细胞生长、繁殖、分化、生存有关。此外，该蛋白分别在第１６－１９，２７１－２７４，
３２９－３３２，３７４－３７７，４８０－４８３，５１０－５１３，５８５－５８８个氨基酸残基处还具有７个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（图５，
用“｛｝”表示）；这是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶，在细胞生存、生长、增殖及凋
亡过程中具有重要的功能；位于第３１－３４和第２１３－２１６个氨基酸处具有２个Ｎ端糖基化位点（图５，用“”表
示），使蛋白质能够抵抗消化酶的作用、赋予蛋白质传导信号的功能、或某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折
叠；２个酰胺化位点，位于第２９９－３０２和第４３５－４３８个氨基酸处（图５，用“”表示）；７个Ｎ端酰基化位点，分别
在第７０－７５，１０５－１１０，２５０－２５５，３０９－３１４，３４８－３５３，５０６－５１１，５８１－５８６个氨基酸处（图５，用“■”表示）。
２．３．３　蛋白质二级结构和三级结构预测　通过ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎＳｅｒｖｅｒ网站的相关软件分析发现，组成ＧＢＳＳⅠ
５第１９卷第５期 草业学报２０１０年
图６　马铃薯犌犅犛犛Ⅰ与其他植物犌犅犛犛Ⅰ基因氨基酸序列比较
犉犻犵．６　犃犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犌犅犛犛Ⅰ犵犲狀犲狑犻狋犺狅狋犺犲狉犺狅犿狅犾狅犵狌犲狊
横线以上为双子叶植物，以下为单子叶植物。方框内为同源盒序列 Ａｂｏｖｅｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｌｉｎｅｉｓｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ
ｐｌａｎｔｓ，ｕｎｄｅｒｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｌｉｎｅｉｓｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅｈｏｍｅｏｂｏｘｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓｉｎｔｈｅｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ
蛋白的６０７个氨基酸中，１６９个氨基酸可能形成α螺旋结构，１１５个氨基酸可能形成β折叠片，３２３个氨基酸可能
形成无规则卷曲。进一步登录Ｐｈｙｒｅ网站，将ＧＢＳＳⅠ氨基酸序列提交给ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ和Ｐｈｙｒｅ，用ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ
（位点特性反复ＢＬＡＳＴ）标准方法通过多序列比对建模，结果发现有１０个推荐模型。对其进行比对分析后选取
６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５
ｄ１ｒｚｕａ（糖原合成酶，ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅ１）ＧｌｇＡｆｒｏｍ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊［３１％ｉ．ｄ．，Ｅｖａｌｕｅ（Ｅ期望值）
＝０，ｅｓｔｉｍａｔｅｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（估计精度）＝１００％］作为模板进行ＧＢＳＳⅠ蛋白三级结构预测分析，将Ｐｈｙｒｅ网站返回
的ｄ１ｒｚｕａ模板和ＧＢＳＳⅠ模型用Ｒａｓｍｏｌ软件查看，结果发现两者单体结构十分相似（图７，８），表明马铃薯ＧＢＳＳ
Ⅰ蛋白与原核生物农杆菌的淀粉合成酶可能具有相同的功能（图６）。
图７　犱１狉狌狕犪单体三级结构
犉犻犵．７　犜犺犲犿狅狀狅犿犲狉３犇狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犱１狉狌狕犪
图８　犌犅犛犛Ⅰ预测单体三级结构
犉犻犵．８　犜犺犲狆狉犲犱犻犮狋犲犱犿狅狀狅犿犲狉３犇狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犌犅犛犛Ⅰ
３　讨论
多项研究结果表明，反义ＧＢＳＳⅠ基因或ＲＮＡｉ沉默ＧＢＳＳⅠ基因，可显著降低被干扰植株的直链淀粉含量，
培育糯质型作物新品种［１４，１５］；而增加ＧＢＳＳⅠ基因的过量表达，则有望创制高直链淀粉含量的转基因植株，培育
膜用型作物新品种［１６，１７］，表明ＧＢＳＳⅠ基因的过量表达或抑制表达是改变作物淀粉结构、创制新型淀粉类型、培
育专用型作物新品种的有效途径。马铃薯ＧＢＳＳ基因有２种同工型，ＧＢＳＳⅠ基因主要在贮藏器官块茎中表达，
负责直链淀粉合成，ＧＢＳＳⅡ主要在茎叶等非贮藏器官中表达［１８］，因此，分离并克隆控制马铃薯块茎直链淀粉含
量的ＧＢＳＳⅠ基因的ｃＤＮＡ序列，是利用基因工程技术改良马铃薯淀粉结构首先且必要的条件。
马铃薯ＧＢＳＳⅠ基因为单拷贝，有１３个内含子［１９］，其ｃＤＮＡ序列提取方法与无内含子基因的ＤＮＡ提取方
法不同［２０］。本研究以ＧｅｎＢａｎｋ中已公布序列（Ｘ５８４５３）设计特异引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ和序列测定技术获得了
该基因的ｃＤＮＡ序列。分析比对后发现，其与已公布的马铃薯该基因的ｃＤＮＡ序列同源性很高，达９９．２０％以
上，但与其他物种间的同源性较低，为５９％～７７％，说明同科植物特别是同种植物，该基因的保守性很强，这与其
他研究者对不同基因或不同物种同源性分析时的结论是一致的，即属内同源性高，属间相对低［２１２３］。
生物信息学是一门发展迅速的新兴科学，利用相关软件可分析基因组或目的基因的序列特征、功能蛋白的结
构和功能、分子遗传图谱的构建等［２３，２４］，为利用功能基因改良作物遗传特性奠定基础。本研究对克隆到的ＧＢＳＳ
Ⅰ基因的ｃＤＮＡ片段利用相关软件进行了分析，发现其编码６０７个氨基酸和１个终止密码子，具３个与其他１５
种植物完全一样的保守功能区域，存在着蛋白激酶Ｃ、酪氨酸蛋白激酶磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、糖基化、酰
胺化和酰基化等功能位点。三级结构预测表明，其与农杆菌淀粉合成酶具有十分相似的三级结构模型，表明该蛋
白具有淀粉合成功能。本研究为利用基因工程创制马铃薯新型淀粉结构奠定了基础。
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（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿Ｌ．）ａｎｄｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｓｉｎｇｌｅｐｏｉｎｔｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎｔｈｅａｍｆａｌｅｌｅ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９１，
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ｓｈｏｗｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｔｏｒａｇｅｏｒｇａｎｓｏｆｐｅａａｎｄｐｏｔａｔｏ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，１９９２，２（２）：１９３２０２．
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犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犮犾狅狀犻狀犵犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犮犇犖犃犲狀犮狅犱犻狀犵
狋犺犲犌犅犛犛犐犵犲狀犲犳狉狅犿狋狌犫犲狉狊狅犳犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿
ＳＨＥＮＢａｏｙｕｎ１，２，ＬＩＵＹｕｈｕｉ１，ＺＨＡＮＧＪｕｎｌｉａｎ１，２，ＷＡＮＧＤｉ１，２
（１．ＧａｎｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃ＆ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＡｇｒｏｎｏｍｉｃＣｏｌｅｇｅｏｆＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅｃＤＮＡｃｌｏｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇＧＢＳＳⅠｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｔｕｂｅｒｓｏｆ犛狅犾犪狀狌犿狋狌
犫犲狉狅狊狌犿ＣＶ．ＧａｎｎｏｎｇｓｈｕＮＯ．２ｕｓｉｎｇａｎＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ），ｔｈｅｎｍｅａｓｕｒｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｏｆｃＤＮＡｗａｓ１８２４ｂｐ，
ｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｅｄ６０７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｎｄａｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｄｏｎ：ｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｗａｓ９９．７８％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｒｉｇｉ
ｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＸ５８４５３），ｂｕｔｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓｗｅｒｅｖｅｒｙｌｏｗｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒｆａｍｉｌｉｅｓ．
ＴｈｅｇｅｎｅｈａｓｔｈｅｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒＥＵ４０３４２６ｉｎＧｅｎＢａｎｋ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＧＢＳＳ
ⅠｇｅｎｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｒｅｌａｔｅｄｓｏｆｔｗａｒｅｏｆｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｈａｄ
ｔｈｒｅｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｓａｓｉｎｏｔｈｅｒＧＢＳＳｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ１５ｐｌａｎｔｓａｎｄｉｔｈａｄａｎｕｍｂｅｒｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｓ．Ｉｔａｌｓｏｈａｄａｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅｏｆ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿，ｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔｓ
ｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎｅｄｉｎｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿；ｇｒａｎｕｌｅｂｏｕｎｄｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅ（ＧＢＳＳＩ）ｇｅｎｅ；ＲＴ－ＰＣＲ；ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ；ｐｒｏｔｅｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５