全 文 :林业科学研究 2014,27(3):388 392
ForestResearch
文章编号:10011498(2014)03038805
白蜡虫多糖免疫调节与抑制肿瘤活性
冯 颖,何 钊,李 娴,陈智勇,孙 龙
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所;国家林业局资源昆虫培育与利用实验室,云南 昆明 650224)
收稿日期:20131221
基金项目:中央公益性科研院所基本科研业务费(riricaf2011002M);国家林业局科研项目[林规批字(2011)236]
作者简介:冯 颖(1960—),女,云南昆明人,研究员,博士,研究方向为食用药用昆虫.Email:yingf@hotmail.com
致谢:动物实验由云南中医学院林青教授协助完成.
摘要:采用环磷酰胺诱导免疫低下小鼠模型,通过测定模型小鼠的炭粒廓清指数、吞噬指数、胸腺指数和脾指数考察
白蜡虫多糖的免疫调节能力;对接种S180瘤细胞的小鼠采用口服和注射方式提供白蜡虫多糖,以抑瘤率考察白蜡
虫多糖体内抑瘤活性;以生长率为指标考察白蜡虫多糖对人白血病细胞株、人肺癌细胞株、人胃癌细胞株及人肝癌
细胞株等4种肿瘤细胞的抑制作用。结果显示:白蜡虫粗多糖(Cwps)和纯化多糖(Pwps)均能明显增加免疫低下小
鼠碳粒廓清指数及吞噬指数,但对胸腺指数和脾指数无改善作用;体内抑瘤试验发现,白蜡虫多糖对小鼠体内S180
有明显的抑瘤效果,但对离体肿瘤细胞生长却无明显抑制作用。研究结果表明:白蜡虫多糖能增加免疫低下小鼠的
非特性免疫能力,具有体内抑制肿瘤作用,但对肿瘤细胞无细胞毒作用,揭示白蜡虫多糖通过提高小鼠免疫能力达
到体内抑制肿瘤的功效。
关键词:白蜡虫;多糖;免疫调节;肿瘤抑制
中图分类号:S899.1 文献标识码:A
ImmunomodulatoryandAntitumorActivitiesofPolysaccharide
fromChineseWhiteWaxScale
FENGYing,HEZhao,LIXian,CHENGZhiyong,SUNLong
(ResearchInstituteofResourcesInsects,ChineseAcademyofForestry;LaboratoryofCultivationandUtilizationofResourceInsects,
StateForestryAdministration,Kunming 650224,Yunnan,China)
Abstract:Theimmunomodulatoryandantitumoractivitiesofcrudepolysaccharide(Cwps)andpurifiedpolysaccha
ride(Pwps)extractedfromChinesewhitewaxscalewereinvestigatedinvivoandinvitro.Theimmunomodulatory
efectofCwpsandPwpswereevaluatedbycarbonparticleclearanceindex,thymusindexandspleenindexincyclo
phosphamideinducedimmunosuppressedmice.TheinhibitionratesofChinesewhitewaxscalepolysaccharideon
sarcoma180tumorinvivoandhumanleukemia,lungcancer,gastriccancerandhepatomacellinesinvitrowere
observed.TheresultsshowedthatboththeCwpsandPwpscouldincreasephagocyticindexsignificantly,buthadno
influenceonthymusindexandspleenindex.ThegrowthofS180celwassignificantlyinhibitedbyCwpsinvivo,
butbothCwpsandPwpsdidn’texhibiteddirectcytotoxicactivitiesforfourkindstestedtumorcelsinvitro.There
sultindicatedthatantitumorpropertiesofChinesewhitewaxscalepolysaccharidemightbeachievedbyimproving
immuneresponseinvivo.
Keywords:Chinesewhitewaxscale;polysaccharide;immunomodulatory;antitumor
糖是地球上数量最多的有机物,和核酸、蛋白一
起构成生物体的3种重要生物分子,具有重要的生
物学功能,按其来源可分为植物多糖、动物多糖和真
菌多糖等[1],其中,真菌多糖研究较深入,具有降血
第3期 冯 颖等:白蜡虫多糖免疫调节与抑制肿瘤活性
糖、降血压、降脂、消炎、抗辐射、抗肿瘤和增强肌体
免疫能力等作用[2]。植物多糖的研究涉及芦荟多
糖[3]、茶叶多糖[4]以及我国的传统中药白术[5]、当
归[6]、枸杞多糖[7]等,研究表明植物多糖同样具有
调节免疫能力、抑制肿瘤等多种生物活性[8]。动物
来源的多糖主要为粘多糖,如肝素、硫酸软骨素等具
有抗凝血、降血脂、调节机体免疫力等很强的生理作
用和治疗效果[9]。相对其它生物多糖,昆虫水溶性
多糖的研究很少,现有的研究有蚕蛹多糖[10-12]、美
洲大蠊[13]多糖的提取及免疫活性,黄粉虫多糖提取
及抗氧化活性[14],虻虫多糖类物质延长凝血时间、
增加纤溶系统活力等[15],这与昆虫丰富的种类和种
群数量极不相符。
白蜡虫(EriceruspelaChavanness)属同翅目(Ho
moptera)蜡蚧科(Coccidale),是一种资源昆虫,其2
龄雄虫分泌的白蜡是我国的传统非木质林特产品,
由长链脂肪酸和醇构成的酯类化合物,在机械、化
工、医药、食品、农林等领域得到广泛应用,白蜡虫主
要分布于我国的南方山区,寄生于女贞(Ligustrum
lucidumAit.)等寄主植物上,发展白蜡生产需要大
量的寄主植物,可推动绿化造林,具有很好的经济、
生态和社会效益。在传统白蜡生产中,雄虫生产白
蜡,大量怀卵的雌虫除用于繁殖后代外,未得到充分
利用[16]。近年来,笔者研究发现,白蜡虫成熟雌成
虫含有丰富的蛋白质等成分,营养丰富、食用安全,
动物试验表明具有明显的免疫调节和抗突变功
能[17-18]。对从白蜡虫雌成虫中提取的多糖分析发
现,其为葡萄糖、甘露糖、半乳糖组成的杂多糖[19]。
为了解和评价白蜡虫多糖的活性,本文对其免疫调
节功能和抑制肿瘤功能进行了研究,为白蜡虫及其
他昆虫多糖的科学利用奠定科学基础,同时为森林
资源昆虫白蜡虫的综合利用提供依据。
1 材料和方法
1.1 白蜡虫多糖
提取多糖的白蜡虫样品采于4月下旬雌成虫产
卵后、幼虫还未孵化前。去杂、水洗净、55℃烘干后
粉碎过20目筛,存冰箱低温保存备用。采用水提醇
沉法提取粗多糖(Cwps)[19]。粗多糖采用离子交换
及凝胶层析纯化后得到的纯化多糖(Pwps)。
1.2 供试动物与肿瘤细胞株
供试动物:免疫功能的调节试验用小鼠为健康
昆明种小鼠(四川省医学科学院实验动物研究所、川
SCXK200416),雌雄各半,体质量(20±2)g,清洁
级;体内抑制肿瘤试验小鼠为健康雌性昆明种小鼠
(昆明医学院实验动物中心,滇实动证第 2004010
号),体质量18 22g,清洁级。
供试瘤株:小鼠移植性肉瘤 S180、人白血病细
胞株(HL60)、人肺癌细胞株(A549)、人胃癌细胞株
(SGC7901)、人肝癌细胞株(Bel7402)。
1.3 多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠免疫功能
调节试验
供试小鼠随机分8组,每组16只,分为正常组、
模型组、阳性对照组(1040mg·kg-1(体质量)匹多
莫德,太阳石药业,批号 070703)、白蜡虫粗多糖
(Cwps)高低剂量组(3000、1000mg·kg-1(体质
量))、白蜡虫纯化多糖(Pwps)高中低剂量组(219、
73及24.3mg·kg-1(体质量))。阳性对照组连续
口服给药7d,各剂量组连续口服多糖 7d,每天 1
次,正常组和模型组给予等体积去离子水,第5天除
正常组外,其余各组每只小鼠腹腔注射环磷酰胺(江
苏恒瑞医药股份有限公司,批号07033021)50mg·
kg-1(体质量),诱导免疫低下小鼠模型,连续3d。
第8天每只鼠尾静脉注入经稀释的印度墨汁(0.10
mL·(10g)-1),2min(t1)和10min(t2)后分别从
眼底静脉丛取血40μL,加到4mL经离心的0.1%
Na2CO3溶液中,用分光光度计(752N)在600nm波
长处分别测定其吸光度值OD1(2min取血所测吸光
度值)和OD2(10min取血所测吸光度值),以0.1%
Na2CO3溶液作空白调零。第2次采血后脱颈椎法
处死小鼠,称体质量,解剖测量胸腺、肝及脾质量。
按下式计算胸腺指数、脾指数、碳粒廓清指数K和吞
噬指数α:
胸腺指数=胸腺质量/体质量
脾指数=脾脏质量/体质量
碳粒廓清指数(K)=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)
吞噬指数(α)=k1/3×体质量/(肝质量+脾质量)
1.4 多糖小鼠体内抑制肿瘤试验
白蜡虫粗多糖(Cwps)研磨成细粉状,用0.8%
的NaCl溶解稀释,按灌胃和腹腔注射2种方式分别
给药,灌胃给药设50、100和200mg·kg-1(体质量)
3个剂量组,按0.2mL·(10g)-1(体质量)的给药
体积配制为相应浓度。腹腔注射设25、50和100mg
·kg-1(体质量)3个剂量组,按0.01mL·(10g)-1
的给药体积配制为相应浓度。取接种7d后生长良
好的肿瘤细胞,用生理盐水调成4.0×106·mL-1浓
983
林 业 科 学 研 究 第27卷
度的细胞悬液接种于小鼠右侧腋部皮下,0.2mL·
只 -1。接种 24h后随机分为阴性对照(0.8%
NaCl)、阳性对照(1mg·kg-1(体质量)剂量顺铂,
云南个旧生物制药厂,批号 030601,按 0.2mL·
只 -1小鼠的给药体积腹腔注射给药)和 Cwps剂量
组,连续9d给药,每天1次。停药1天后处死动物,
分别称体质量、瘤质量,计算肿瘤生长的抑制率(抑
瘤率):
抑瘤率=(对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)对照组平均瘤质量 ×100%
1.5 多糖体外抑制肿瘤试验
白蜡虫多糖用0.8%的NaCl配成10mg·mL-1
浓度的溶液,0.22μm滤膜过滤并稀释成5个浓度
(Cwps为 0.0243、0.2430、2.4300、24.3000和
243.0000μg·mL-1;Pwps为 0.0232、0.2320、
2.3200、23.2000及 232.0000μg·mL-1)备用。
将对数生长期各肿瘤细胞调整为适当浓度后加入
96孔培养板(90μL·孔 -1)。阴性对照(等体积培
养液)、阳性对照(顺铂)及5个浓度样品各设3个
平行孔(10μL·孔 -1)。悬浮细胞(HL60)接种后即
加药,贴壁细胞(A549,SGC7901,Bel7402)培养
24h待其贴壁后加药。加药后置37℃、5%CO2培
养箱培养48h(悬浮细胞)或72h(贴壁细胞)后,加
入MTT(5mg·mL-1、20μL·孔 -1),继续培养4h
后各孔加入 100μL三联液(10%SDS5%异丁醇
-0.012mol·L-1HCl(W/V/V)),静置过夜后,
570nm下(VarioskanFlash美国Thermoscientific)测
定各孔的吸光值(OD值)。计算细胞的生长抑
制率:
生长抑制率=(阴性对照 OD-样品 OD)/阴性
对照OD×100%
LOGIT法计算受试药对细胞生长的半数抑制浓
度IC50。
1.6 数据处理
MicrosoftExcel计算结果,以均数±标准差(珋x±
s)表示,用 Spss11.0统计软件进行单因素方差分
析,对组间方差齐者进行t检验,方差不齐者进行t′,
检验。
2 结果与分析
2.1 白蜡虫多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠免
疫功能的调节
由表1、2可知:模型组动物碳粒廓清指数(K)(P
<0.05)、吞噬指数(α)(P<0.01),胸腺指数和脾指
数(P<0.01)均明显低于正常组,表明环磷酰胺造成
了小鼠免疫低下模型;阳性对照匹多莫德组能明显提
高模型小鼠碳粒廓清指数(K)(P<0.05)及吞噬指数
(α)(P<0.01);各剂量组粗多糖及纯化多糖均能不
同程度提高免疫低下模型小鼠碳粒廓清指数(K)及
吞噬指数(α),但阳性对照与各剂量粗多糖及纯化多
糖均不能提高小鼠胸腺指数和脾指数,对小鼠体液免
疫和细胞免疫没有影响。试验结果表明:白蜡虫多糖
可不同程度地提高小鼠非特异免疫功能,但对小鼠免
疫器官胸腺、脾脏指数无明显改善作用。纯化后多糖
在低剂量时就能显著提高免疫低下小鼠的非特异性
免疫能力,保留了粗多糖的活性作用。
表1 白蜡虫粗多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能、胸腺及脾指数的影响
组别 剂量/(mg·kg-1) 碳粒廓清指数(K) 吞噬指数(α) 胸腺指数/(mg·g-1) 脾指数/(mg·g-1)
正常组 - 0.0230±0.0072 4.558±0.478 4.88±0.89 4.25±1.20
模型组 - 0.0172±0.0067△ 3.708±0.708△△ 1.56±0.37△△△ 2.01±0.44△△△
匹多莫德 1040 0.0263±0.0071 4.667±0.644 1.51±0.57 2.43±1.08
Cwps(低) 1000 0.0267±0.0077 5.138±0.588 1.56±0.52 1.89±0.43
Cwps(高) 3000 0.0302±0.0063 5.642±0.743 1.52±0.30 1.92±0.42
注:表中数据为均数±标准差(珋x±s);与正常组相比:△P<0.05,△△P<0.01;与模型组相比:P<0.05,P<0.01,P<0.001;下同。
表2 白蜡虫纯化多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能、胸腺及脾指数的影响
组别 剂量/(mg·kg-1) 碳粒廓清指数(K) 吞噬指数(α) 胸腺指数/(mg·g-1) 脾指数/(mg·g-1)
正常组 - 0.0311±0.0075 5.843±0.507 4.71±0.89 4.43±0.88
模型组 - 0.0249±0.0080△ 5.036±0.593△△△ 1.35±0.32△△△ 1.69±0.21△△△
匹多莫德 1040 0.0359±0.0058 5.737±0.669 1.38±0.36 1.79±0.24
Pwps(低) 24.3 0.0328±0.0051 5.741±0.670 1.42±0.33 1.68±0.28
Pwps(中) 73.0 0.0375±0.0071 6.103±0.920 1.42±0.36 1.72±0.35
Pwps(高) 219.0 0.0382±0.0085 5.820±0.901 1.40±0.28 1.70±0.29
093
第3期 冯 颖等:白蜡虫多糖免疫调节与抑制肿瘤活性
2.2 白蜡虫多糖体内抑制肿瘤试验结果
白蜡虫粗多糖动物体内抑制 S180肿瘤试验结
果(表3)显示:除灌胃给药的中剂量组外,其它各剂
量组S180的平均瘤质量比对照组均明显减轻,抑瘤
率大于30%,差异显著(p<0.01)。2种给药方式在
高剂量组条件下,对S180的抑瘤率都达到了50%以
上,腹腔注射给药抑制肿瘤效果与剂量呈明显的正
相关,抑瘤率高于灌胃给药途径,2种给药方式均未
观察到明显的毒性反应。表明在本试验条件下,白
蜡虫粗多糖对小鼠移植性肉瘤 S180的生长有明显
的抑制作用。
表3 白蜡虫粗多糖对小鼠体内S180生长的影响
组别 剂量/(mg·kg-1)
体质量/g(珋x±s)
给药前 给药后
瘤质量/g(珋x±s) 抑瘤率/% P值
顺铂 1 20.12±1.91 21.71±3.05 0.62±0.06 69.61 <0.01
0.8%氯化钠 21.93±2.75 28.24±4.28 2.04±0.60 - -
Cwps灌胃 50 21.09±1.53 25.83±2.22 1.17±0.67 42.65 <0.01
100 19.25±2.33 25.43±4.16 1.97±0.66 3.43 >0.05
200 19.64±2.09 25.69±2.87 0.97±0.23 52.45 <0.01
0.8%氯化钠 21.21±3.80 26.60±4.19 2.07±0.47 - -
Cwps腹腔注射 25 19.58±2.33 25.82±3.19 1.28±0.20 38.16 <0.01
50 19.40±1.33 23.01±0.97 1.14±0.21 44.93 <0.01
100 20.42±1.76 23.42±2.53 0.94±0.40 54.59 <0.01
注:与0.8%氯化钠对照组比较。体质量与瘤质量为均数±标准差(珋x±s)。
2.3 白蜡虫多糖体外抗肿瘤试验
白蜡虫多糖对4种人体肿瘤细胞体外抑制试验
结果(表4)显示:在供试剂量条件下,对肿瘤细胞生
长的半数抑制浓度分别超过了 243μg·mL-1和
232μg·mL-1,表明白蜡虫多糖对4种体外培养人
体肿瘤细胞生长无抑制作用。
表4 白蜡虫多糖对4种肿瘤细胞的IC50/(μg·mL
-1)
样品
人白血病细胞
(HL60)
人肺癌细胞
(A549)
人胃癌细胞
(SGC7901)
人肝癌细胞
(Bel7402)
Cwps >243 >243 >243 >243
Pwps >232 >232 >232 >232
顺铂 0.095 1.60 0.89 2.31
3 结论与讨论
白蜡虫粗多糖和纯化多糖均可显著增强免疫低
下小鼠炭粒廓清指数(K)及吞噬指数(α),具有提
高小鼠非特异免疫的功能。白蜡虫粗多糖对荷瘤小
鼠体内 S180有明显的抑瘤效果,高剂量组(灌胃
200mg·kg-1和腹腔注射100mg·kg-1)的抑瘤率
均大于50%,腹腔注射方式给药的抑瘤率与剂量成
正相关;但白蜡虫粗多糖和纯化多糖在体外对4种
肿瘤细胞均无生长抑制作用。研究结果表明,白蜡
虫多糖对体外肿瘤细胞无细胞毒作用,多糖通过提
高小鼠免疫能力达到体内抑制肿瘤的功效。
多糖对肿瘤细胞抑制主要通过对免疫功能的影
响和直接的细胞毒作用等2种方式来实现,其中大
部分多糖均是通过增强机体免疫活性间接抑制肿瘤
细胞途径发挥作用[1,20]。对免疫功能的影响主要有
增强网状内皮系统、对补体影响、对淋巴细胞和吞噬
细胞的作用等方面,细胞诱导性免疫在多糖和多糖
蛋白的抗肿瘤活性功能中扮演了重要的作用[1]。不
同多糖和多糖蛋白通过调节免疫力来抗肿瘤的机制
也有不同,如香菇多糖[21]由巨噬细胞和淋巴细胞相
互作用而产生的细胞诱导免疫应答、抗体诱导的细
胞毒2种作用导致产生抗肿瘤效果;云芝多糖[22]在
正常动物体内无直接的免疫应答效果,但可以使移
植肿瘤后小鼠下降的免疫力恢复正常;人参多
糖[23]、虫草多糖[24]、香菇多糖[21]具有增强网状内皮
系统功能;柴胡多糖[25]、人参多糖[23]、茯苓多糖[26]
等通过对补体的影响来达到抑制肿瘤作用;枸杞多
糖[7]、当归多糖[27]、白术多糖[28]等能促进淋巴细胞
的分裂、增值和转化;白术多糖[29]、当归多糖[30]等
具有对吞噬细胞的作用。在细胞毒作用方面,活性
多糖主要通过改变肿瘤细胞膜的生长特性、抗自由
基、影响肿瘤细胞的蛋白质和核酸的合成等方面来
实现只对癌细胞作用[1],而不杀伤正常细胞。白蜡
虫多糖在体外对癌细胞无抑制作用,但在体内具有
明显的抑瘤作用,且能增强免疫低下小鼠的非特异
性免疫功能,说明白蜡虫多糖无直接的细胞毒作用,
其抑制肿瘤的作用可能与大多数其它来源多糖一
样,主要通过影响免疫功能而达到抑瘤效果,但具体
的作用机制尚待进一步研究。
193
林 业 科 学 研 究 第27卷
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