全 文 ：林业科学研究!"#$"!"%"%#$*$* *$(
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!!文章编号!$##$$&()""#$"##%#*$*#&
舞毒蛾核型多角体病毒 R69检测技术的建立
陶!婧$! 韩崇选$#! 张永安"#! 王玉珠"! 曲良建"! 王青华"
"$P西北农林科技大学林学院!陕西 杨凌!/$"$##*
"P中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所!国家林业局森林保护学重点实验室!北京!$###($#
收稿日期$ "#$"#$$"
基金项目$ 林业公益性行业科研专项""##/#&#$"!"##(#&#"(#
作者简介$ 陶!婧"$()/(#!女!河北石家庄人!硕士PYE8?L$DA9A>;H>8A))h$"*P:AE
#
通讯作者$ 韩崇选!男!教授PYE8?L$76=D8Q?=J:8>hH8;AAP:AEP:=*张永安!男!研究员PYE8?L$];8=JH8Nh:8BP8:P:=
摘要!根据舞毒蛾核型多角体病毒"eD1Z_d#的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因"$1&#设计一对特异性引
物!成功建立了eD1Z_d的_G5检测技术体系!其对eD1Z_d基因组的灵敏度可达到 $ BJ/EeU$) 应用该技术体
系从舞毒蛾带毒幼虫卵蛹的基因组中扩增出目的片段!证明了这一技术的可行性) 对不同浓度的多角体悬液的
扩增结果显示$其检测最低量为 % b+7/EeU$) 形态学研究表明$从内蒙舞毒蛾体内分离到的 eD1Z_d中!少数表
面有凹陷的孔洞!病毒粒子从这些孔洞中游离出来!这也阐明了此技术能够从多角体悬液中扩增出目的片段的原
因) 在将来eD1Z_d的检测中!可用虫体进行研磨过滤离心得到的组织液作为模板进行扩增)
关键词!舞毒蛾核型多角体病毒*_G5*微量检测*$1&基因
中图分类号!i(** 文献标识码!,
E2%#<5&2-G($%,3R69;22#+ 3,/.(%(1%&$7 ,39.%"+)#" :-4"#
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AKALH;6D9AO?9@7M8776>@KP+876D A= $1&J6=6ABeD1Z_d!8K8?9ABK9?E697M87D67?J=6D M?>; >;676=7?>?O?>HAB$BJ
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=(+ >,/*2$ 5HC(0&#=( B=%@(#E@L>?KL66EN6DD6D =@:L6AKALH;6D9AO?9@7"eD1Z_d#* _G5* E?:9AD6>69E?=8>?A=*
$1&J6=6
舞毒蛾在我国分布于东北华北西北华东和
中国台湾!其幼虫取食危害 %## 余种植物+$, !对我国
林业发展造成极大损失) 微生物防治是当今农林业
害虫防治中最有价值的方法之一!其中!昆虫病毒防
治以其专一性强高效安全的优点在森林保护中发
挥了很大的作用+", ) 舞毒蛾核型多角体病毒" 5H2
C(0&#=( B=%@(#E@L>?KL66EN6DD6D =@:L6AKALH;6D9AO?9
@7!eD1Z_d#于 $($% 年首次报道+., !但直至 $(&) 年
其病原性才被证实+&, ) 国外对 eD1Z_d的应用研
究开始于 "# 世纪 *# 年代! 我国于 "# 世纪 /# 年代
第 % 期 陶!婧等$舞毒蛾核型多角体病毒_G5检测技术的建立
末也开始了对eD1Z_d的研究+%, )
目前!对其防治效果仍采用肉眼观察调查统计
的方式) 曾有学者应用免疫金颗粒标记鉴定eD1Z
_d的抗原!对eD1Z_d进行鉴定和细胞定位) 该标
记系统具有容易制备高的电子致密度和分辨力与
大分子结合的稳定性不同的粒子大小以及很强的
二次电子反射能力等优点!被广泛用于病毒与寄主
间关系病毒在寄主细胞内复制机制病毒表面抗原
和结构蛋白定位等研究+*, *但同一目寄主的核型多
角体病毒同源性较近!抗体易和这些同源性相近的
抗原产生亲和反应!使得免疫方法在鉴定病毒方面
还存在一定的局限性*所以!建立一种以病毒基因组
为基础的检测技术对我国林业舞毒蛾的防治具有很
好的实际应用价值+/, ) 本实验针对 eD1Z_d内蒙
株设计了一对特异性引物!建立了以 _G5技术为基
础的昆虫病毒核酸快速检测技术体系)
$!材料与方法
@P@A试验材料
舞毒蛾核型多角体病毒"eD1Z_d#思茅松毛
虫核型多角体病毒"U$0B#"F=C4%L=L4)*==@:L6AKALH
;6D9AO?9@7!-QZ_d#美国白蛾核型多角体病毒
",H@*(0&#=( )40$( =@:L6AKALH;6D9AO?9@7!\:Z_d#春
尺蠖核型多角体病毒 ";@")*$=C( )=0$#(#=4%=@:L6
AKALH;6D9AO?9@7!,:?Z_d#茶尺蠖核型多角体病毒
"-)&#"@=%"EF=>4( =@:L6AKALH;6D9AO?9@7!YAZ_d#甜菜
夜蛾核型多角体病毒"?@"B"@&$#( $G=14( E@L>?KL66E
N6DD6D =@:L6AKALH;6D9AO?9@7! 461Z_d#斜纹贪夜蛾
核型多角体病毒 " ?SF=&4#( =@:L6AKALH;6D9AO?9@7!
4KL?Z_d#和油桐尺蠖核型多角体病毒"]4I4#( %4@2
@#$%(#=( =@:L6AKALH;6D9AO?9@7!+7Z_d#均为中国林业
科学研究院森林生态环境与保护研究所提供)
舞毒蛾采自内蒙古自治区乌兰察布市苏木山林
场!在实验室人工饲养并连续传代)
@P?A实验方法
$P"P$!病毒的增殖与多角体的纯化!取冰箱保存
的eD1Z_d感染健康舞毒蛾 & 龄幼虫!收集具有典
型病毒症状的死虫尸!加入少量的磷酸缓冲液"K值 /2&#研磨虫尸!. 层纱布过滤) 滤液经多次离
心+/,得到纯净的eD1Z_d多角体悬液!将此悬液浓
度调整为 %P# l$#( _<+/EeU$!采用十倍梯度稀释
法!逐级稀释为 %P# l$#)%P# l$#/%P# l$#*%P#
l$#
%
%P# l$#
&
%P# l$#
.
%P# l$#
"
%P# l$#
$
_<+
/Ee
U$
! & V保存备用)
$P"P"!电镜观察!扫描电镜样品的制备$将干净的
载玻片弄碎!选取大小约 #P$* :E" 见方的碎片!将
纯化的eD1Z_d多角体悬液均匀涂于上述载玻片碎
片上!自然干燥!喷金 $)# 7*扫描电镜观察多角体形
态特征)
透射电镜样品的制备采用仲国立等+),的方法)
$P"P.!带毒幼虫卵和蛹的获取!以 " l$#&_<+/
Ee
U$的浓度感染健康舞毒蛾 " 龄幼虫!幼虫化蛹后
单独收集!待其羽化产卵) 卵不经消毒处理!随机
取 % 个卵块置于U"# V冰箱中保存备用!剩余卵块
在 & V放置 &# D!待其滞育解除后置于 "% V环境下
孵化!幼虫孵化后单头饲养至化蛹!随机取 "# 头蛹
置于U"# V冰箱保存备用)
$P"P&!病毒 -Z,的提取和病虫总 -Z,的提取!
用碱裂解法+) U(,提取病毒-Z,)
病虫总-Z,的提取$取待检测的舞毒蛾幼虫
卵蛹加入适量液氮研磨!采用平衡酚法+$# U$$,提取
舞毒蛾总-Z,)
$P"P%!引物设计!eD1Z_d的全基因组序列已被
测定+$", !根据 J6=6N8=Q 公布的序列!进行比对发现
其蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因"$1&#
特异性很高!根据 eD1Z_d的 $1&基因设计了一对
引物!命名为 eY+!eY+C$ %X,0[,[,0G,G[G0
0G[,0G[G[.X!eY+5$ %XG[0G[,0G[0[G,[,0
[G,[,G.X!其扩增的目的片段长 ()& NK)
$P"P*!扩增条件!_G5反应体系$" l08F _G5
187>691?S$#
!
e! 上下游引物各 $
!
e"$#
!
EAL/
e
U$
#!模板加入量因实验材料而异!其中病毒和病虫
总-Z,为 $
!
e!eD1Z_d多角体悬液为 #P%
!
e!最
后加无5Z,水至 "#
!
e)
反应条件$(& V预变性 % E?=*(& V变性 .# 7!
-Z,模板 %) V"其中以 eD1Z_d多角体为模板的
退火温度 %% V#复性 &% 7!/" V延伸 $ E?=!共 .# 个
循环*/" V再延伸 $# E?=)
反应结束后!取 %
!
e反应液经 $3琼脂糖凝胶
电泳检测) _G5反应液送北京三博远志生物技术有
限公司测序)
"!结果与分析
?P@AeD1Z_d的形态特征
由图 $ 的eD1Z_d扫描电镜照片观察到!eD1
Z_d多角体形态呈不规则球形!有的表面光滑!有的
/$*
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
有突起!有的有棒状凹陷!其直径为 #P) "P)
!
E)
图 $!eD1Z_d扫描电镜照片"% ### l#
从图 " eD1Z_d透射电镜照片可以看出$eD1
Z_d为多粒包埋型核型多角体病毒!其病毒束在多
角体中无规则排列!并有囊膜包被*病毒粒子呈杆
状!大小约为 "% =El")# =E!. / 个杆状病毒粒
子平行排列成束*左图中多角体边缘的病毒束已经
游离出来!留下一些环状孔洞)
$P边缘有凹陷的多角体"$## ### l#*
"P边缘平滑的多角体"%# ### l#
图 "!eD1Z_d透射电镜照片
?P?A引物特异性分析
分别以eD1Z_d-QZ_d\:Z_d,:?Z_dYAZ
_d461Z_d4KL?Z_d+7Z_d的基因组 -Z,为模
板!以eY+为引物进行 _G5扩增!扩增产物进行琼
脂糖凝胶电泳检测) 结果"图 .#表明$只有以 eD1
Z_d的基因组-Z,为模板对引物 eY+的扩增得到
了一条清晰特异的条带!此条带与目的片段大小一
致) 测序结果显示扩增出的产物即 eD1Z_d的 $1&
基因片段!其大小为 ()& NK)
?PBAeD1Z_d基因组-Z,灵敏度的检测
以浓度为 $
!
J/Ee
U$
$ =J/Ee
U$
$ KJ/
Ee
U$
$## BJ/Ee
U$
$# BJ/Ee
U$
!$ BJ/Ee
U$的
eD1Z_d基因组-Z,为模板!以eY+为引物进行扩
增) 扩增结果"图 &#表明$这种模板的检测灵敏度
1$189Q69*$$eD1Z_d* "$-QZ_d*.$\:Z_d* &$,:?Z_d*
%$YAZ_d**$461Z_d* /$ 4KL?Z_d* )$+7Z_d*
($阴性对照*$#$阳性对照
图 .!以eY+为引物扩增不同病毒的$1&基因
均已达到 $ BJ/EeU$)
1$189Q69*$$$
!
J/Ee
U$
*"$$ =J/Ee
U$
*.$$ KJ/Ee
U$
*
&$$## BJ/Ee
U$
*%$$# BJ/Ee
U$
**$$ BJ/Ee
U$
*
/$阴性对照*)$阳性对照
图 &!以eY+为引物扩增eD1Z_d基因组-Z,$1&基因
?PCAeD1Z_d的_G5检测技术的可行性验证
分别以均感染eD1Z_d的舞毒蛾带毒卵幼虫
蛹的 -Z,$1&基因组为模板!以 eY+为引物进行
_G5扩增!扩增产物的电泳结果"图 %#显示$其均扩
增出特异条带!而健康虫和双蒸水的对照没有扩增
出任何条带) 这验证了用此方法进行 eD1Z_d的
微量快速检测是切实可行的!可以应用到 eD1Z_d
的实际检测中)
1$189Q69*$$卵-Z,* "$幼虫-Z,*.$蛹-Z,*
&$阴性对照*%$阳性对照**$双蒸水
图 %!以eY+为引物扩增舞毒蛾卵幼虫蛹的-Z,$1&基因
?PSAeD1Z_d模板的多样性
分别以不同浓度的多角体悬液作为模板!以
eY+为引物进行_G5扩增!阴性对照为健康虫经研
磨过滤离心+/, 得到的悬液!阳性对照为提纯的
eD1Z_d-Z,) 结果"图 *#显示$检测灵敏度可达
)$*
第 % 期 陶!婧等$舞毒蛾核型多角体病毒_G5检测技术的建立
到 % 个多角体的模板检测量)
1$189Q69*$ $# 分别为$%P# l$#(%P# l$#)%P# l$#/%P# l$#*
%P# l$#
%
%P# l$#
&
%P# l$#
.
%P# l$#
"
%P# l$#
$
%P# l$#
#
_<+/Ee
U$
*$$$阴性对照*$"$阳性对照
图 *!以eY+为引物扩增多角体悬液
.!结论与讨论
由图 "可以看出$eD1Z_d多角体中包被的病毒
束数量病毒束中包被的病毒粒子数量并不固定!所
以!多角体包含时选择病毒粒子可能是随机的!包含
病毒粒子束多的多角体其直径也大+$., ) 有学者认
为!多角体的大小和形态取决于蛋白质的一级结构!
多角体蛋白的构象调节其包埋过程) 此外!eD1Z_d
的多角体易溶于 Z8b\fb\"
4b
&
和 \,G的水溶
液中!碱解也相对容易) 图 $ 中多角体表面的棒状凹
陷以及图 ""$#中多角体边缘的环状孔洞可能是在电
镜样品处理过程中多角体溶解) 也有学者认为!多角
体表面孔洞形成的原因是多角体囊膜蛋白基因"@$@
基因#失活导致多角体囊膜蛋白缺失!同时病毒粒子
束释放了出来+$&, ) 这为以多角体悬液作为模板可以
扩增出目的条带提供了理论依据)
$1&基因编码一种叫作蜕皮甾体尿苷二磷酸葡
萄糖转移酶"Y[0#的多肽!受病毒感染的幼虫!其
$1&基因表达产生的 Y[0蛋白分泌到血淋巴中!使
受感染幼虫在死亡前一直保持活跃的取食和生长状
态!有利于病毒进行最大限度地增殖+$%, ) 作者通过
序列分析!设计后筛选出一对特异性引物eY+!该对
引物只有以 eD1Z_d-Z,为模板才能扩增出与预
期大小相符的目的片段!而其它病毒 -Z,未扩增出
条带) 此外!以 eD1Z_d多角体悬液作为模板同样
扩增出了目的片段!而从健康虫体内提取的悬液并
未扩增出目的条带!说明多角体悬液即可用于 _G5
检测) 在林间应用中!取虫体进行研磨过滤离心等
步骤得到的悬液作为模板!无需提取 -Z,!使得昆
虫病毒的检测方法呈现多样化并且简单易行) 因此
技术具有快速特异准确性高的优点!已广泛应用
于病毒的检测+$* U$/, ) 此外!此技术还可用于实验室
种群病毒感染检测和林间舞毒蛾病毒流行病检测
研究等!同时也可以用于林间舞毒蛾核型多角体病
毒在环境中存留跟踪研究)
参考文献!
+$, 萧刚柔P中国森林昆虫"第二版# +1,P北京$中国林业出版社!
$().$ ).&
+", ,9?B+1P,N9?6BIA@9=6HM?>; ?=76:>O?9@767M?>; 6EK;87?7A= N8:@
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的抗原+R,P昆虫学报!$(($!.&"$#$/ U$"
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+), 张永安!仲国立!侯玉霞!等P茶尺蠖核型多角体病毒"YAZ_d#的
_G5检测方法及其生物活性研究+R,P林业科学研究!"##)!"$
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7?7O?9@7?= PSE#(%=)($?=76:>+R,Pd?9ALAJH! $((.! $(&$*#) U*$%
+$$, 曲良建!张永安!王玉珠!等P_G5法证文棉铃虫核型多角体病
毒对棉铃虫经卵和蛹的垂直传播+R,P中国生物防治!"##%!"L
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+$", f@]?AR! _6897A= 1Z! \89MAAD 4 \! $&(FS46F@6=:68=D 8=8LH7?7
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+$%, 沈兴家!张志芳!李奕仁P昆虫杆状病毒$1&基因研究进展+R,P
中国蚕业!"##&! "%""#$ & U/
+$*, 王文欢!张永安!王玉珠!等P基于 _G5方法的美国白蛾核型多
角体病毒早期检测+R,P昆虫学报! "##(! %""*#$ /#/ U/$"
+$/, 陈!川!张永安!王玉珠!等P油桐尺蠖核型多角体病毒
"+7Z_d#生物学与检测技术研究+R,P林业科学研究!"#$$! "&
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