全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 6) : 877 882
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 06-0877-06
落叶松胚性细胞系分化能力及染色体变异的研究
张清国1, 2 , 梁国鲁1 , 韩素英2, 胡钠梅1, 2, 齐力旺2*
( 1. 西南大学园艺园林学院 , 重庆 400716; 2. 中国林业科学研究院林业研究所 , 国家林业局林木培育重点实验室 , 北京 100091 )
摘要: 以落叶松未成熟合子胚诱导的 16 个胚性细胞系为材料, 对继代培养的细胞系间及不同世代间染色体数目和
体细胞胚胎发生率进行对比研究, 结果表明: 落叶松胚性细胞系随继代培养时间的增加, 总体体细胞胚分化能力逐
渐下降, 平均体细胞胚分化率从继代培养第 7 次后的 335. 6 个· g - 1 降低到第 22 次后的 268. 2 个·g - 1 , 细胞染色
体数目变异率逐步增加, 从 5. 4% 上升到 40. 0% ; 不同细胞系间体细胞胚分化能力及稳定性差异明显, 分化能力较
高的细胞系染色体数目变异几率相应较小, 在继代培养第 25 次后, 细胞系 a214 染色体数目变异率为 0% , 体细胞胚
分化率为 416. 1 个·g - 1。
关键词: 落叶松; 细胞系; 染色体; 体细胞胚胎发生; 遗传稳定性
中图分类号: S791. 22 文献标识码: A
收稿日期 : 2009-03-19
基金项目 : 国 家 863 项 目 ( 2006AA100109 与 2008AA10Z126 ) ; 国 家 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 ( 30830086 ) 和 国 家 973 项 目
( 2009CB119100) 以及国家林业局“948”项目 ( 2007-04-03 )
作者简介 : 张清国 ( 1984— ) , 男 , 硕士 , 研究方向 : 细胞遗传学及生物技术 . E-mail: zhangqg2005@ 126. com
* 通讯作者 : 男 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 树木遗传学 . Tel: 010-62888445; E-mail: lwqi@ caf. ac. cn
Somatic Embryogenesis and Multiplicity of Chromosome Number
in Embryogenic Cell Lines of Larix ssp.
ZHANG Qing-guo
1, 2
, LIANG Guo-lu
1
, HAN Su-ying
2
, HU Na-mei
1, 2
, QI Li-wang
2
( 1. College of Horticulture and Landscape, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 . Research Institute of Forestry,
Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Beijing 100091 , China)
Abstract: The embryogenesis ratios and the chromosome numbers during subculture among sixteen embryogenic cell lines
derived from immature zygote of Larix spp. were compared. The results showed a negative correlation between the ability of
somatic embryogenesis and the times of subculture, with embryogenesis ratios of 335. 6 per gram in the 7th and 268. 2 per
gram in the 22nd subculture time; and a positive correlation between the embryogenesis ratios and the genetic stability,
with chromosome variation ratio of 5. 4% in the 7th and 40. 0% in the 22nd subculture time. The ability and highly quality
of somatic embryogenesis were different among cell lines, however, the most efficient embryogenic cell lines contain the
most stability chromosome numbers, with embryogenesis ratio of 416. 1 per gram and chromosome variation ratio of 0% in
the cell line a214 after subculturing for 25times.
Key word: Larix; cell lines; chromosome; somatic embryogenesis; genetic stability
早在 1993 年的统计, 木本植物有 24 科 80 余种
成功获得体细胞胚, 其中超过一半为针叶树, 经过
10 多年的发展, 植物体细胞胚胎发生的研究日趋完
善, 体细胞胚胎发生及优化调控关键因素逐渐明
确 [ 1 - 3 ] , 但长期继代培养的植物胚性细胞系普遍存
在遗传变异及体细胞胚分化效率减弱的现象, 限制
了优良株系的保存和规模化推广应用 [ 4 - 5 ] 。如何保
持胚性细胞系持续、稳定和高效的胚分化能力是体
细胞胚胎发生技术应用于生产实践的重要问题, 也
是目前仍未完全解决的难题之一。落叶松作为温带
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
和寒带高山地区重要的速生造林用材树种, 具生长
快、产量高、材质优良、用途广等特点, 在商品材的生
产及研究中一直处于优先地位。我国现已成为世界
上落叶松人工林经营第一大国, 并且在落叶松遗传
改良及体细胞胚胎发生领域的研究逐渐成为世界落
叶松研究的前沿 [ 6 - 8] , 但生根极难限制了普通组织
培养和扦插在落叶松快速扩繁中的应用, 目前仍以
种子繁殖为主。因此, 体细胞胚胎发生已成为优良
落叶松株系快速扩繁、人工种子研究及应用的主要
途径和遗传转化的重要载体。同时, 体细胞胚胎发
生是个体发育等基础研究的重要方面 [ 3 ] , 在遗传改
良、良种推广以及基础研究中具有极大的生产应用
价值和理论研究意义。本课题组相继研究了胚性细
胞系与非胚性细胞系的生理生化差异及体细胞胚发
生过程中生理生化及分子生物学方面的变化规律,
在稳定高效细胞系建立及规模化生产应用研究上有
较大的突破 [ 7 - 12 ] ; 但是, 同样存在长期培养使胚性
细胞系胚分化能力减弱的现象, 因此, 探索如何保持
胚分化能力有极大的利用价值。植物胚性细胞系长
期继代培养后, 同时存在遗传变异率增加和胚分化
能力下降, 这二者之间是否存在联系仍无定论。
Aderkas 等 [ 13] 进行了相关研究 , 发现长期培养的落
叶松雌配子体胚性细胞系染色体数目极不稳定 , 二
倍化细胞占绝大多数, 仅有少部分细胞系具有分化
能力。细胞系分化能力与基因型相关 [ 13 ] , 体细胞
胚性细胞系是否存在类似现象还不得而知 ; 因而,
从细胞学水平进一步分析落叶松胚性细胞系在长
期继代培养中的变异规律, 探索落叶松胚性细胞系
生长的细胞学特点 , 全面掌握体细胞胚胎发生规
律, 对稳定持续高效的体细胞胚发生体系的建立、
筛选和生产利用具有极为重要的应用价值和理论
研究意义。
1 材料和方法
1. 1 试验材料
中国林科院林业研究所细胞生物学实验室继代
培养的落叶松胚性细胞系, 由未成熟的合子胚诱导
而来, 采集地点为黑龙江青山林场和辽宁大孤家林
场, 细胞系编号及其亲本如下:
( 1) 日本落叶松( Larix kaempferi ( Lambert) Car-
riere) 母株自由授粉: a211、a214、a214-④、a24-11。
( 2) 日本落叶松 ×长白落叶松 ( L. lolgensis var.
koreana) : n1、n1-1、n1-2、n1-5、n1-7、n166、n166-6
和 n26。
( 3) 日本落叶松 ×日本落叶松: n105
( 4) 日本落叶松 ×华北落叶松 ( L. principis-rup-
prechtii Mayr. ) : y16、y16-6 和 y68
1.2 培养条件
胚性细胞系继代培养基采用 S培养基添加 2, 4-
D( 2, 4-二氯苯氧乙酸 ) 0. 4 mg·L- 1 + BA( 苄氨基
?呤) 0. 4 mg·L - 1 , 22 25 ℃暗培养, 约 20 d 继代
1 次。
体细胞胚分化培养基为 S 培养基添加 ABA( 脱
落酸) 18. 9 mg· L - 1 + PEG4000 ( 聚乙二醇 ) 88. 8
g·L - 1 , 22 25 ℃暗培养, 分化培养 35 d 时, 进行
体细胞胚分化率统计及体细胞胚染色数目观察。
1.3 细胞系染色体数目观察
取生长旺盛的胚性细胞, 通过去壁低渗法—火
焰干燥法 [ 1 4] 略加改进制取细胞标本: 取胚性细胞约
0. 5 g, 0. 002 mol 8-羟基?啉预处理 5 h, 卡诺固定液
固定 3 h 以上, 去离子水洗净固定液, 3% 纤维素果
胶混合酶酶解 2 h, 1 000 r·min - 1离心 10 min 收集
细胞, 去离子水洗去残留酶液, 卡诺固定液固定, 重
悬细胞, 滴片火焰干燥, Giemsa 染色。显微观察, 随
机选择 3 个以上视野, 拍照、统计。
1.4 体细胞胚染色体数目变异观察
对胚性细胞系进行体细胞胚分化培养, 每个细
胞系分化培养第 35 天 , 随机抽取 30 个以上的体细
胞胚, 用改良去壁低渗涂片法制取染色体标本, 对
每个体细胞胚染色体数目进行确定、统计。每个体
细胞胚观察细胞数目 30 个以上, 其中 85% 的细胞
稳定含有的染色体数目为该体细胞胚的染色体
数目。
1.5 染色体诱变处理
取生长旺盛 的胚性细 胞系 a211、y68、n1 和
a214, 在终浓度分别为 500 mg·L- 1的秋水仙素水溶
液中分别培养处理 12、24、36、48 h。取部分处理后
的细胞进行体细胞胚分化, 剩余的细胞进行继代培
养。每组处理分化得到的体细胞胚随机抽取 30 个,
进行染色体数目的测定统计。
多倍体诱导率 ( % ) 为多倍体体细胞胚占抽查
体细胞胚的百分比。
体细胞胚分化率( 个·g - 1 ) 为每 g 愈伤组织分
化的体细胞胚数目。
878
第 6 期 张清国等: 落叶松胚性细胞系分化能力及染色体变异的研究
2 结果与分析
2. 1 长期继代培养对落叶松胚性细胞系的影响
对 16 个细胞系进行体胚分化能力的检测 , 结
果发现落叶松胚性细胞系培养时间越长体细胞
胚发生能力越弱。在继代第 7 次、第 15 次以及第
22 次之后 , 分别对所有细胞系进行体细胞胚分化
能力和细胞染色体的检测 , 结果见表 1。随着继
代次数的增加总体细胞系平均体细胞胚分化能
力逐渐 减弱 , 发 现部分细胞 出现染色 体数目变
异 , 并且变异细 胞占有率随 继代次数 的增加而
增加。
表 1 落叶松胚性细胞系染色体数目变异情况及分化能力
继代次数
/次
检测的细胞数
/个
相应染色体数目的体细胞胚数 /个
2n = 2x = 24 2 n = 4x = 48 2 n = 24 48 2n > 48
平均体胚分化率
/ ( 个· g - 1 )
7 720 681 55 45 39 335. 56
15 685 443 77 103 62 297. 78
22 698 419 84 124 71 268. 28
注 : 平均体胚分化率是指所有细胞系分化率的平均值 , 染色体数目变异细胞数目是指观察到所有细胞系染色体变异的细胞数目的总和。
2.2 不同细胞系长期继代培养下胚分化能力的
比较
对 16 个细胞系进行跟踪检测发现, 落叶松胚性
细胞系之间体细胞胚分化能力差 异显著, a214、
a211、n1 和 y68 细胞系体胚分化率一直保持较高的
水平, 其中 a214 在继代第 12 代, 单次最高体胚分化
率达到 632. 2 个· g - 1 , y68 在继代培养超过 2 年后
仍有较高的体胚分化率 ( 303. 7 个·g - 1 ) , 而 a24-
11、n26 和 y16 系列细胞系则胚分化率较低, 并随继
代次数增加分化能力迅速下降。通过染色体数目检
测, 所有细胞系长期培养后部分细胞染色体数目发
生了变异, 但在 a214 和 a211 中并没有发现染色体
数目变异的体细胞胚( 表 2) 。具高效分化体细胞胚
能力的细胞系, 得到的体胚染色体数目较为稳定, 体
胚分化率最低的 y16 系列, 得到的体胚的染色体数
目变异率最高( 图 1) , 平均达到 40. 4% 。
表 2 长期继代培养后的高效稳定细胞系与不稳定细胞系体细胞胚染色体变异率对比
细胞系
检测时间
继代次数
体细胞胚
总数 /个
相应染色体数目的体细胞胚数 /个
2n = 2 x = 24 2n = 4x = 48 2n = 24 48 2n > 48
变异率
/%
体胚分化率
/ ( 个·g - 1 )
a214 25 86 86 0 0 0 0. 0 416 . 1
a211 25 72 72 0 0 0 0. 0 401 . 5
n1 系列 22 172 170 2 0 0 1. 2 346 . 2
y68 > 40 96 92 1 2 1 4. 2 303 . 7
a24-11 22 78 69 1 5 3 11. 5 223 . 1
n26 22 85 74 3 3 4 11. 8 239 . 2
y16 系列 22 114 68 11 19 16 40. 4 181 . 9
2n = 46 2n =52
图 1 染色体数目变异
978
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
2. 3 稳定高效胚性细胞系经秋水仙素诱导后的体
细胞胚胎发生
图 2、3 表明: 胚性细胞系在不同处理时间后, 能
分化出一定比例的多倍体体细胞胚, 多倍体发生率
为 23. 17% 85. 18% , 但在继代后分化多倍体体细
胞胚的能力迅速降低, 同时, 体细胞胚分化率则明显
回升, 诱导后直接分化率平均为 358. 3 个·g - 1 , 继
代 2 次后平均为 493. 6 个·g - 1 , 对比组为无菌水浸
泡处理 24 h 加倍率为 0. 0% , 三个世代体细胞胚分
化率分别为 342. 1、533. 9、595. 0 个·g - 1 , 继代培养
后体细胞胚分化能力明显高于同世代的诱导组细
胞系。
图 2 继代培养对 500 mg·L - 1秋水仙素水溶液诱导后的
胚性细胞系多倍体发生率的影响
图 3 继代培养对 500 mg· L - 1秋水仙素水溶液诱导后的
胚性细胞系体细胞胚胎分化率的影响
2.4 四倍体细胞系 a214-④在继代培养过程中体胚
分化率及染色体变异率检测
通过秋水仙素诱导落叶松体细胞胚发生, 再诱
导细胞系分化, 获得一个四倍体细胞系 a214-④。
在继代过程中 , 对其体胚分化率及染色体变异的观
察发现 , 该细胞系体胚分化率较低并且在培养过程
中逐渐减弱, 染色体数目十分不稳定 , 随继代次数
增加二倍体体细胞胚及非整倍体体细胞胚发生率
逐渐上升, 四倍体体细胞胚的分化能力逐渐散失
( 表 3) 。在继代培养第 28 代时 , 体胚发生率只有
21. 82 个· g - 1, 约为第 7 代分化率的 1 /5, 而获得
的体细胞胚之中二倍体比例成倍增加, 四倍体比例
急剧下降。
表 3 四倍体细胞系 a214-④继代中体胚发生及染色体观察
继代次数 / 次
相应染色体数目的体细胞胚数 /个
2n = 2x = 24 2n = 4x = 48 2n = 24 48
检测体细胞胚数 体胚发生率 / ( 个· g - 1 )
7 2 38 1 41 104. 86
15 12 16 2 40 82. 64
22 16 8 6 30 51. 43
28 21 6 7 34 21. 82
3 结论与讨论
至今已获得试管苗的 1 000 多种植物中, 大部
分都可以通过体细胞胚胎发生获得再生植株 [ 15] 。
近年来, 体细胞胚胎发生的研究热点, 已从胚性细胞
系的构建转移到如何提高胚性细胞系分化能力的高
效性和稳定性以及规模化培养上, 包括基本培养基
的筛选、激素的选择以及聚乙二醇等添加剂对高效
分化的影响等 [ 16] ; 但是, 持续、稳定、高效的植物体
细胞胚胎发生机理仍不透彻, 长期继代培养后, 体胚
的分化能力急剧降低或散失是制约其应用的关
键 [ 5 ] 。相关研究发现, 长期继代的植物细胞系普遍
存在染色体数目变异 [ 4 , 15 ] , 目前, 国内外在白杄( Pi-
cea meyeri Rehd. Et Wils. )
[ 17] 、荔枝 ( Litchi chinensis
Sonn) [ 18] 、番木 瓜 ( Carica papaya Linn) [ 19] 、刺梨
( Rosa roxburghii Tratt)
[ 20] 、柑橘 ( Citrus) [ 2 1] 、银鹊树
( Tapiscia sinensis Oli. ) [ 22 ] 、栓 皮栎 ( Quercus suber
L. )
[ 23 ] 等很多树种中均发现体细胞胚胎发生中染色
体数目变异的现象。研究同时也显示, 某些细胞系
088
第 6 期 张清国等: 落叶松胚性细胞系分化能力及染色体变异的研究
比较稳定, 能在数年的继代培养中一直保持体胚的
分化, 即使细胞系中存在染色体数目变异, 但体细胞
胚的染色体数目相对稳定 [ 13 , 22 - 23] 。胚性细胞系染
色体数目的稳定性和变异性与植物的基因型密切相
关 [ 24] , 杂种胚性细胞系则母本的影响比父本要显著
一些 [ 25 ] , 胚性细胞系诱导培养的基本培养基 [ 16 , 26] 、
继代培养中添加的激素 种类和浓度 大小 [ 27 ] 、光
照 [ 28] 都影响到胚性细胞系的形成以及分化效率。
此外, 外植体种类和预处理方式对染色体稳定性也
有很大的影响, 特别是花药培养中存在比其他任何
组织更广泛的染色体变异, 有些无法形成胚性细胞
系的单倍体培养物, 在染色体被加倍后, 形成的二倍
体却具有体细胞胚胎的发生能力 [ 29 ] , 而四倍体细胞
系会不断地通过细胞凋亡的方式恢复二倍体状
态 [ 30] 。由此可见, 植物体细胞胚胎发生, 特别是高
效稳定持续的体系受多因素的影响, 是待解决的
难题。
本实验对落叶松及杂种落叶松的 16 个细胞系
进行体细胞胚分化能力及染色体数目变异的研究显
示, 长期继代培养后也存在总体体细胞胚分化能力
逐渐降低, 染色体数目变异等现象。细胞系间染色
体数目变异和体细胞胚分化能力差异较明显, 据此
把细胞系分为 3 类: 在继代培养中迅速失去体细胞
胚分化能力的极不稳定细胞系、在继代培养中分化
能力逐步降低的不稳定细胞系和一直保持较高分化
能力的稳定细胞系, 其中, a214、a211 和 n1 系列细胞
系在一年半的继代培养之后, 保持着较高的体胚分
化率, y68 细胞系继代培养超过 2 年半, 仍保持高频
率的体细胞胚分化能力 ( 303. 7 个·g - 1 ) , 而 a24-
11、n26 和 y16 系列在继代培养开始就呈现出分化能
力下降的趋势。通过细胞系间染色体数目的对比观
察, 体细胞胚分化能力较低的细胞系, 染色体数目存
在较大的变异现象, 染色体数目非整倍体的变异几
率越大, 并且分化率越低。人工诱导获得的 a214 四
倍体细胞系是一个极不稳定的细胞系, 在继代培养
过程中细胞系迅速二倍化, 其中, 在继代培养 28 代
时, 二倍体细胞已占绝大部分。通过秋水仙素对稳
定高效细胞系进行多倍体诱导, 其体胚发生随着继
代次数的增加, 多倍体体细胞胚分化率逐渐降低, 同
时整体体细胞胚分化率则逐步提高。
长期继代培养不利于落叶松胚性细胞系的遗传
稳定和高效体细胞胚分化能力的保持, 人工诱导的
多倍体细胞系不稳定, 容易低倍化。本文的研究结
果还表明, 即使是亲本相同的 2 个细胞系间分化率
及稳 定 性 之 间的 差 异 也 较 为显 著, 这 与 Alicja
等 [ 2 4] 、Niskanen 等 [ 25] 研究认为的体细胞胚胎发生及
稳定性与基因型相关的结论不尽相同, Alicja 等 [ 24] 、
Niskanen 等 [ 25 ] 研究仅以是否具备体细胞胚分化能
力为参数研究胚性细胞系的稳定性, 无法确定细胞
系的具体分化能力大小, 故有不足之处。本文的研
究以体细胞胚分化率为指数, 研究了胚性细胞系分
化能力与染色体数目变异间的关系, 明确了落叶松
分化能力大小与染色体数目稳定性的关系, 从细胞
学水平为具有高效稳定持续体细胞胚分化能力的细
胞系的初期筛选提供了试验依据, 同时也为植物胚
性细胞系研究提供了新的参考。
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