全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (4) : 586～590
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0420586205
适于杨树功能基因组研究的 T2DNA激活标签构建
王曙光 1, 2 , 栾维江 23 , 乔桂荣 23 , 孙宗修 3 , 卓仁英 23 3
(1. 西北农林科技大学 ,陕西 杨凌　712100; 2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400;
3. 中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室 ,浙江 杭州 310006)
关键词 :杨树 ; T2DNA激活标签 ;功能基因组学 ; bar基因
中图分类号 : Q78 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006209204
基金项目 : 国家林业局“948”项目“安全选择标记基因及林木转基因新技术引进”(200524258)部分内容
作者简介 : 王曙光 (1978—) ,男 ,河南焦作人 ,硕士研究生.3 与第一作者对本文贡献相同.3 3 通讯作者 :卓仁英 ,副研究员 ,博士 :研究方向 ;林木分子生物学. E2mail: zhuory@gmail. com
Con struction of T2D NA Activa tion Tagg ing for Popu lus Functiona l Genom ics
WANG Shu2guang1 , LUAN W ei2jiang2 , Q IAO Gui2rong2 , SUN Zong2xiu3 , ZHUO Ren2ying 2
(1. Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi, China; 2. Research Institute of Subtrop ical Forestry, CAF, Fuyang　
311400, Zhejiang, China; 3. State Key Laboratory of R ice B iology, China National R ice Research Institute, Hangzhou　310006, Zhejiang, China)
Abstract:W ith the comp letion of the Populus genome sequence in 2006, the study on functional genom ics in Popu2
lus has become a major task. Establishment of Populus mutant population is an essential app roach for forestry func2
tional genom ics study. The activation tagging is a p rom ising and powerful method to constructmutant library of Pop2
u lus and to further discover new gene and elucidate its function now. A novel T2DNA activation tagging pCAS05
was constructed for forest functional genom ics in this study. W e could select conveniently and easily transgenic
p lants by sp raying Basta because bar gene is constructed in this vector as a selection marker. Moreover, we could
also construct a large scale mutant library in Populus by this activation tagging because of effectively selection of bar
gene.
Key words: Populus; T2DNA activation tagging; functional genom ics; ba r gene
杨树 ( Populus spp. )分布遍及北半球 ,具有广泛
的经济价值和生态价值。由于杨树具有相对较小的
基因组 (约 500 Mb)、紧凑的基因组结构 ( n = 19)及
较为成熟的遗传转化方法 ,使其成为木本植物研究
的模式树种 [ 1～4 ]。继拟南芥 (A rabidopsis tha liana
(L. ) Heynh. )、水稻 (O ryza sa tiva L. )之后 ,杨树全
基因组序列已于 2002年启动 ,目前已完成测序约
480 Mb,覆盖全基因组的 7. 5倍 ,已有 102 019个
EST被分析并整合 ,并对所预测的 58 036个基因进
行了初步的注解 [ 5 ]。杨树全基因组序列的公开释放
为林木功能基因组研究及发现和克隆树木新基因奠
定了基础。
目前所发现和克隆的基因中 ,大多数是通过构
建突变体库 ,产生突变体而获得的。T2DNA插入突
变体库总体的遗传背景是一致的 ,因此在基因克隆
和功能研究中受到高度的重视 ,已在拟南芥和水稻
中建立了一些突变体库 [ 6, 7 ]。林木的生长周期长 ,自
然突变频率低。而理化诱变过程难以控制 ,一个突
变体经常包含多个点突变 , 突变表型可能由多个点
突变引起 ,功能基因鉴定难度大。因此多数采用 T2
DNA插入技术构建突变体发现和克隆新基因。目
前 ,在拟南芥和水稻的功能基因组研究中利用 T2
第 4期 王曙光等 :适于杨树功能基因组研究的 T2DNA激活标签构建
DNA插入方法构建突变体库已有广泛应用 ,已有多
个国家的研究小组构建了插入突变体库 [ 8～13 ]。在
杨树中 , Busov V B等 [ 14 ]通过 T2DNA插入突变体库
克隆了赤霉素氧化酶基因 (GA2ox)。
功能基因组学具有大规模、高通量、信息密集的特
点 ,建立突变体库是发现新基因并揭示其功能的重要
而有效的途径。揭示控制树木各种性状的基因远比农
作物育种复杂 ,树木多为杂合体 ,难以通过杂交实现对
性状的基因解析。传统方法是通过功能缺失突变体来
分离、鉴定基因 ,这种方法对存在基因家族或数量性状
控制的基因有明显缺陷 ,构建饱和基因突变群体是分
离、鉴定基因功能最直接、有效的方法 ,因此激活标签技
术在突变体研究中具有重要作用 [15～18 ]。
本文构建了适合于杨树功能基因组学研究的新
型 T2DNA插入激活标签系统 ,以 GUS作为启动子捕
获元件 , 2 ×35S启动子作为激活标签 ,并引入了 bar
基因 [ 11, 19 ]作为转基因植株筛选标记 ,提高转基因材
料筛选效率 ,满足杨树功能基因组学研究大规模、高
通量的要求 ,旨在为以后大规模构建杨树 T2DNA插
入突变体库奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
pCAS04激活标签系统由中国科学院遗传与发
育生 物 学 研 究 所 储 成 才 研 究 员 惠 赠。 pDS2
BAR1300H由中国水稻研究所水稻生物学国家重点
实验室保存 , pBSB3 2nag70、大肠杆菌 ( Escherich ia co2
li (M igula) Castellani et Chalmers) DH5α、根癌农杆菌
( A grobacterium tum efaciens ( Sm ith et Townsend )
Conn. ) EHA105由中国林科院亚林所国家林业局亚
热带林木培育重点实验室保存。
T4 DNA连接酶、限制性内切酶 Kpn I、Sac I、Hind
III等试剂购于宝生物工程 (大连 )有限公司 ( Takara)。
壮观霉素、氨苄霉素购于 Sigma公司 (USA)。
1. 2 方法
1. 2. 1 质粒 DNA 的提取 质粒 DNA 提取采用
Axygen公司 (USA)小抽试剂盒 ,提取步骤依照试剂
盒说明书上的方法进行。
1. 2. 2 质粒 DNA的酶切反应 1μg pBSB3 2nag70
质粒 [ 7 ] DNA用限制性内切酶 S ac I 37℃消化 3 h,回
收酶切产物中的大片段后用 T4 DNA连接酶自连 ,
再用 H ind III单酶切自连后的 pBS2 ×35S质粒 DNA;
1μg pDSBAR1300H质粒 DNA用 H ind III酶切 ,回收
bar基因表达框 (约 2. 5 kb) [ 11 ] ;连接后所构成的中
间载体 pBS35SBAR和 pCAS04各 1μg分别用 Kpn I
和 Sac I酶切 ,回收目的片段连接后获得新型 T2DNA
激活标签载体 pCAS05。
1. 2. 3 连接反应 150 ng酶切回收 DNA 片段与
50 ng载体大片段用 T4 DNA 连接酶 16 ℃连接过
夜 ,连接产物加入 1 /10体积的 3 mol·L - 1 CH3 COO2
Na (pH值 5. 2) ,再加入 2. 5倍体积预冷的无水乙醇
后于 - 20 ℃放置 40 m in, 12 000 g离心 1 m in回收沉
淀 ,用 70%预冷的乙醇洗涤沉淀后真空干燥 ,加入
25μL TE溶液溶解沉淀 ,取 15μL电激转化。
1. 2. 4 DNA 回收 DNA 回收采用 Axygen公司
(USA)凝胶回收试剂盒 ,具体步骤依试剂盒说明书
上的方法进行。
1. 2. 5 去磷酸化反应 100 ng自连后的 pBS2 ×
35S质粒 DNA的 H ind III单酶切回收产物用 2μL (1
U·μL - 1 ) C IAP在 50 ℃水浴中反应 30 m in,再加入
1μL的 C IAP继续反应 30 m in,电泳回收。
1. 2. 6　电激转化 2～5μL纯化后的连接产物加
入 100μL的电激感受态细胞中 ,转移至预冷的电激
杯 (0. 2μm )中于 2 500 V、25 uF、200Ω (B IO2RAD
电激转化仪 ) [ 12 ]条件下电激转化 4 s,再转移到 1. 5
mL离心管中加入预热的 900μL SOC培养基 , 37 ℃
摇床上中速振荡培养 1 h,取 50～200μL涂板。
1. 2. 7　PCR检测 bar基因 PCR检测所用的引物
为 : BARF: 5′2ATGAGCCCAGAACGACGCCCG23′,
BARR: 5′2TCCAGCTGCCAGAAACCCACG23′。反 应
体系为 20μl,包含 30 ng质粒 DNA、1 ×PCR缓冲液
2μL、0. 2 mmol·L - 1 dNTPs 2μL、0. 2μmol·L - 1引
物 2μL、1 U Taq酶 ,最后用去离子水补足 20μL。
反应程序为 : 94 ℃预变性 4 m in, 94 ℃变性 30 s, 60
℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s, 30次循环 ,最后 72 ℃
延伸 10 m in, PCR产物用 1%琼脂糖凝胶检测。
2 结果与分析
2. 1 中间载体 pBS35SBAR的构建
2. 1. 1 中间载体 pBS2 ×35S 的获得 由于
pBSB3 2nag质粒 AMV序列中含有 Sac I酶切位点 ,因
此利用 Sac I限制性内切酶消化 pBSB3 2nag质粒
DNA ,获得仅含有 2 ×35S启动子序列的中间载体
pBS35S线性 DNA片段 (图 1) ,回收后进行连接 ,利
用电激转化大肠杆菌 DH5α,挑选单克隆 37 ℃震荡
培养 ,提取质粒 DNA,利用 Kpn I和 Sac I进行酶切鉴
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
定 ,可以发现含有目的片段 (图 2)。
1、2: pBSB3 2nag70;M: 15 000 bp分子标记
图 1 pBSB3 2nag质粒 Sac I酶切 1、2:两个单克隆 ; 3: pBSB3 2nag70;M: 15 000 bp分子标记图 2 pBS2 ×35S酶切片段
2. 1. 2 bar基因片段的获得 　利用 H ind III消化
pDSBAR1300H质粒 DNA ,电泳后回收 [ 10 ] 2. 5 kb的
小片段 ,用于中间载体 pBS35SBAR的构建。
2. 1. 3 中间载体 pBS35SBAR的获得 利用限制
性内切酶 H ind III消化 pBS2 ×35S,并利用碱性磷酸
酶去磷酸化 ,与 bar基因片段进行连接 ,获得含有
bar基因的中间载体 pBS35SBAR,利用 PCR检测 bar
基因 ,可以发现 PCR产物中含有 530 bp的目的片段
(图 3) ,说明 bar基因已经连接到 pBS35S载体中。
1、2、3: 3个单克隆 ;M: DL2 000分子标记
图 3　bar基因 PCR检测
2. 2 激活标签载体 pCAS05
将 pBS35SBAR载体 DNA用 Kpn I和 Sac I进行
酶切 ,回收大片段 ,与经过同样限制性内切酶消化的
pCAS04大片段 (图 4 ) 进行连接 ,获得最终载体
pCAS05,载体构建流程见图 5。用 PCR对 bar基因、
N PT II基因分别进行检测 ,可发现 pCAS05载体 DNA
可以扩增出目的基因片段 (图 6) ,可以肯定 bar基因
和 2 ×35S启动子序列已经连接到目的载体上。
M: 15 000 bp分子标记
图 4　pCAS04 Kpn I + Sac I酶切
3 讨论
T2DNA激活标签在拟南芥等植物中已广泛应
用 ,并获得大量的表型异常突变体和被标记基因 ,如
1个成花诱导子基因 , 1个参与生长素生物合成的黄
素单加氧酶类似基因 [ 14 ] ,证明该方法技术可行。
由中国科学院遗传与发育生物学研究所储成才
研究员构建的 T2DNA激活标签 pCAS04中含有 Ac2
tin1启动子序列 ,该启动子在单子叶植物如水稻中
具有很高的活性 ,但在双子叶植物中活性很低 ,因此
必须对它进行改造。本研究选择 2 ×35S启动子替
换 Actin1启动子序列 ,一方面使它适合于双子叶植
物 ,另一方面希望它不使下游基因过分超表达 ,严重
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第 4期 王曙光等 :适于杨树功能基因组研究的 T2DNA激活标签构建
图 5　pCAS05 T2DNA激活标签载体构建流程
影响转基因材料的生长发育。此外 ,由于杨树与水
稻、拟南芥不同 ,生长周期很长 ,难以通过建立 T2代
定位群体 ,进而通过图位克隆进行功能基因组研究 ,
主要采用 Tail2PCR的方法进行目的基因分离 ,再通
过反向遗传学方法验证基因的功能 ,这对于大量转
基因植株来说 ,如果没有简单易行的检测方法 ,工作
量及资金花费巨大。本研究在载体构建中引入了
bar基因作为转基因植株选择标记 ,由于转基因植株
含有 bar基因 ,具有 Basta抗性 ,这样只要通过喷涂
Basta,就可以直接选择出阳性植株。该方法简单易
行 ,可以节省人力和物力的投入 ,为后续突变体库的
构建奠定了基础。
杨树是完成全序列测定的唯一的木本植物 [ 19 ] ,
随着全序列的公开 ,杨树功能基因组学研究将突飞猛
进。林木分子生物学家已经开始构建杨树 T2DNA插
入突变体库 ,其中以美国俄勒冈州立大学最为突出 ,
研究人员已经获得了 627株 T2DNA插入突变体 ,并且
利用 Tail2PCR技术成功分离了控制杨树 GA氧化酶
合成的 GA2ox基因 [ 14 ] ,我国是杨树大国 ,杨树育种对
我国木材生产和生态环境建设等方面具有重要意义 ,
因此必须考虑开展杨树功能基因组学研究。
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左 : N PT Ⅱ基因 1～6个不同质粒 DNA; 右 : bar基因 1、2两年质粒 DNA;M: DL2 000分子标记
图 6　pCAS05 N PT Ⅱ、bar基因 PCR检测
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