全 文 ：林业科学研究　2009, 22 (2) : 243～248
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2009) 0220243206
复叶槭 F tsZ基因的克隆、RNA干扰载体的构建
及其在烟草中瞬时表达 3
车代弟 , 王海峰 , 王金刚 , 龚束芳 , 樊金萍
(东北农业大学园艺学院 ,黑龙江 哈尔滨　150030)
摘要 :利用简并引物 RT2PCR,克隆复叶槭 FtsZ基因的 cDNA序列 ,利用马铃薯 X组病毒载体 pgR107,构建 RNA干
扰重组病毒载体 pVX2A nFtsZ i,并转化农杆菌 GV3101 (含辅助质粒 pJ IC Sa2rep )侵染烟草。40 d后 ,检测烟草内源
FtsZ基因的表达量。研究结果表明 :从复叶槭中克隆到的 569bp FtsZ基因 cDNA片段 ,具有 FtsZ蛋白的核心功能序
列 GGGTGSG。构建的 hpRNA型 RNA干扰载体抑制了 FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论
基础。
关键词 :复叶槭 ; FtsZ; RNA干扰 ;重组病毒载体
中图分类号 : S792. 35　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2008203210; 　　修回日期 : 2008210221
基金项目 : 东北农业大学创新项目发展计划资助 (CXZ004)
作者简介 : 车代弟 (1964—) ,女 ,博士、教授、博士研究生导师 ,东北农业大学园艺学院副教授 ,主要从事园林植物遗传育种与生物技术
研究 : E2mail: daidiche@ yahoo. com. cn,电话 : 0451255190563.3 感谢英国 Sainsbury实验室 Baulcombe教授惠赠的马铃薯 X病毒植物表达载体 PGR107、农杆菌菌株 GV3101 (含辅助质粒 pJ IC Sa2
rep) ,及对本研究的支持和鼓励 !
C lon ing of F tsZ Gene Fragm en ts from A cer negundo, Con structing of RNA i
Vectors and Its Tran sien t Expression in Tobacco
CHE Dai2di , WANG Hai2feng , WANG J in2gang , GONG Shu2fang , FAN J in2ping
(Hortiscience College, Northeast Agricultural University, Harbin　150030, Helongjiang, China)
Abstract: This experiment was performed by app lying degenerate p rimer RT2PCR, and FtsZ gene cDNA sequence
was cloned from A cer negundo L. pgR107, X2group virus vector of potato was used and then RNA interference
recombinant virus vector pVX2A nF tsZ i was constructed. It was transformed to GV3101 ( including auxiliary p lasm id
pJ IC Sa2rep) and infected N icotiana tabacum L. The exp ression of endogenous F tsZ gene was exam ined 40 days
later. Results indicated that 569 bp of F tsZ gene cDNA fragment was acquired from A cer negundo L. Sequencing
showed that it contained F tsZ p rotein fam ily function sequence GGGTGSG. The F tsZ gene exp ression was
supp ressed by the constructed RNA interference vector of hpRNA type. This experiment laid molecular theory
foundation for new colourful leaves breeding of A cer negundo L.
Key words:A cer negundo L. ; F tsZ; RNA i; recombinant virus vector
　　复叶槭 (A cer negundo L. )属槭树科 (Acerace2
ae)、槭树属 (A cer L. )落叶乔木 ,喜光、耐旱、耐寒、
耐烟尘 ,是优良的园林绿化树种 [ 1 ]。在槭树育种方
面 ,国外已育出多种彩叶槭树品种 ,而我国槭树观赏
资源的开发利用相对滞后 [ 2 ]。所以创新槭树类种质
资源 ,在园林绿化中有非常广阔的应用前景。彩色
叶性状是由于一些细胞失去叶绿体或者叶绿体机能
受阻 ,最终导致非绿色组织分布于绿色组织中而产
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
生的 [ 3 ]。F tsZ蛋白就是与叶绿体分裂密切相关的
一类高度保守的蛋白家族 [ 425 ] ,一旦其表达被抑制 ,
则明显地影响叶绿体的分裂 ,甚至在细胞中只观察
到一个巨大的不分裂的丝状叶绿体 [ 6 ]。有研究推
测 ,随着质体分裂相关基因表达逐渐减弱 ,类胡萝卜
素生物合成代谢途径中的 Zds基因表达逐渐增强 ,
叶绿素含量降低而类胡萝卜素含量增高 ,叶绿体逐
渐转变成花色体 ,叶色由绿转黄 [ 7 ]。利用 T2DNA插
入拟南芥 FtsZ 21基因 ,证实突变体虽然叶绿体分裂
受到影响 ,但是可以正常的生长和产生种子 [ 8 ]。可
见 F tsZ蛋白是进行彩叶园林树木育种的理想研究
对象。
RNA干扰技术 [ 9 ]的出现 ,使有效调控叶绿体发
育过程成为了可能。目前 ,已有研究表明高等植物
的一些参与生长发育的基因被成功地利用 RNA干
扰技术进行了功能抑制 [ 10212 ]。但利用此技术进行园
林树木叶色变化方面的研究尚未见报道。
本研究利用简并引物 RT2PCR,克隆复叶槭 F tsZ
基因的 cDNA序列 ,构建复叶槭 FtsZ基因 RNA干扰
载体 ,并在烟草中进行验证。为今后遗传转化培育
木本彩叶新品种奠定理论基础。
1　材料和方法
1. 1　材料
2007年 1月采集生长在东北农业大学校园内
的复叶槭雄株枝条 ,在人工气候箱中水培 ,温度 23～
28 ℃,相对湿度 60% ,光照强度约 5 000 lx,每天 12
h光照 , 28 d后即可展叶 ,取长度约为 3 cm的叶片 ,
液氮速冻后置于 - 70 ℃冰箱中储存备用。实验所
用马铃薯 X 组病毒载体 pgR107、农杆菌菌株
GV3101由英国 Sainsbury实验室 Baulcombe 教授
惠赠 [ 13 ]。
1. 2　方法
1. 2. 1　目标基因的克隆及序列分析 　取水培后的
复叶槭叶片 ,参照王玉成 SDS法 [ 14 ] ,提取总 RNA。
以 F tsZ 21 (5’2AA ( T/C) AA ( T/C) GC IGTIAA ( T/C)
(A /C ) GIATG23’)和 F tsZ 22 ( 5’2AC (A /G) TC IGC
(A /G) A A (A /G) TC IAC (A /G) TT23’)为引物进行
RT2PCR, RT反应参照 TaKaRa B caBESTTM RNA PCR
Kit Ver1. 1 试剂盒说明书进行。 PCR 程序 : 94 ℃
4 m in; 94 ℃ 30 s; 55 ℃ 45 s; 72 ℃ 1 m in ( 30个循
环 ) ; 72 ℃ 10 m in; 4 ℃ pause。将 PCR产物进行琼
脂糖凝胶电泳 ,回收 ,连接 ,转化大肠杆菌。鉴定阳
性克隆后 ,命名为 A nF tsZ 2M ,送上海生工测序。然
后利用 DNAMAN5. 0 分析其编码蛋白质的结构
特点。
1. 2. 2　RNA干扰重组病毒载体的构建与鉴定 　通
过比对 ,选择 A nF tsZ 2M 中与烟草 (N icotina tabacum
L. )同源性较高的 ,位于 + 216～ + 498之间的序列 ,
PCR扩增正义、反义基因片段 ;以质粒 pCAMB IA2
1301为模板 PCR扩增间隔基因。具体引物序列见
表 1。三段基因经酶切后 ,依次连接到 T载体上。
测序正确后 ,经 Sm aⅠ和 Sa lⅠ双酶切 ,克隆到同样
双酶切的病毒载体 PVX 中 ,构建重组病毒载体
PVX2A nFtsZ i。其具体构建流程及 PVX2A nF tsZ i的
T2DNA区结构如图 1所示。
表 1　引物序列
基因名称 引物序列 扩增片段
FtsZ2正 2S 5’2AGCCCGGGTGTTTATAACAGCC23’ (Sm aⅠ) 283
FtsZ 2正 2A 5’2TAGGGTACCATCAGCTAGAAGGAAAG23’ ( KpnⅠ)
FtsZ2反 2S 5’2AGCGACTAGTCAGCTAGAAGGAAAG23’ (SpeⅠ) 283
FtsZ 2反 2A 5’2CAGGTCGACTGTTTATAACAGCC23’ (SalⅠ)
Gus2S 5’2CCGACTAGTATGGTAGATCTGAG23’ (SpeⅠ) 232
Gus2A 5’2CGGGGTACCAGTCGTCGGTTCTG23’ ( KpnⅠ)
　　注 :下划线部分为酶切位点.
1. 2. 3　重组病毒载体向 GV3101农杆菌导入及接
种烟草 　冻融法将质粒 PVX2A nF tsZ i转化农杆菌
GV3101感受态细胞。转化后的菌液涂布于含 50
mg·L - 1 Genta, 50 mg·L - 1 R if, 5 mg·L - 1 Tet和 50
mg·L - 1 Kan抗生素的 LB选择平板上。培养后 ,挑
取菌落 ,利用引物 F tsZ 2正 2S和 F tsZ 2反 2A进行 PCR
鉴定 ,筛选阳性转化子。
真叶期时 ,将含有目标载体 PVX2A nF tsZ i的农杆菌
在 LB培养基 [含 50 mg·L - 1 Kam , 50 mg·L - 1 R if,
5 mg·L - 1 Tet, 10 mmol·L - 1 22N2吗琳基乙磺酸
(MES)和 20μmol·L - 1乙酰丁香酮 (AS) ]过夜振荡
培养 ,之后扩大培养。离心富集菌体 ,等体积重悬
(10 mmol·L - 1 MgCl2 , 10 mmol·L - 1 MES和 100
μmol·L - 1 AS )。室温静止 2～3 h后 ,用无菌的牙
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第 2期 车代弟等 :复叶槭 F tsZ基因的克隆、RNA干扰载体的构建及其在烟草中瞬时表达
图 1　PVX2AnFtsZ i的构建流程
签沾取菌液轻轻刺伤叶片 ,同时以 PVX空载体作为
阴性对照。接种后的烟草在人工气候室中常规
管理。
1. 2. 4　被感染烟草 F tsZ基因表达量的检测 　接种
40 d,选择低湿 (约 35% )条件下培养的植株 ,调查
被感染烟草叶片中 F tsZ基因的转录水平。经过 30
个反应循环烟草的 F tsZ和 GAPDH的扩增产物 ,电
泳后在凝胶成像系统拍照。
半定量 RT2PCR中内参基因 GA PDH 引物的
设计参照 B urton等 [ 15 ]描述 : GA PDH1 ( 5’2CA G2
GAACCCTGAA GA TA TCCC23 ’) ; GA PDH2 ( 5 ’2
GCA GTTGGTACTCTGAA GGCC23 ’) 。烟 草 内 源
F tsZ 基因检测的引物 : F3 ( 5 ’2CAAACAAACA 2
GA GGGA GC23 ’) ; F4 ( 5 ’2CTTA GCA GAA T2
CAAAA GGA G23’) 。 PCR反应各管的循环数分别
为 15 , 18 , 21 , 24 , 27 , 30 , 33。
2　结果与分析
2. 1　A nF tsZ2M的克隆及序列分析
利用简并引物 ,自复叶槭中扩增出两条带
(图 2 ) ,初步判定 500 ～600 bp 的为目的条带。
测序后 ,发现此序列可以读通 ,长度为 569 bp ,编
码 189个氨基酸。对其编码的氨基酸分析显示 ,
该序列具有 F tsZ 蛋白家族的两个保守基序 ,即
FTS Z _ 1: V IGV GGGGSNAVNRM ( PRO SITE;
PS01134 )和 FTS Z _2: FA TA GM GGGTG /TGAA PV /
IV / IA ( PRO SITE; PS01135 ) ,其中 FTS Z _2的序列
中还 包 括 真 核 生 物 F tsZ 蛋 白 的 典 型 基 序 :
GGGTGSG ( PRO SITE; PS00277 ) (图 3 ) 。利用
DNAMAN5. 0 , 将该序列与 GeneB ank 登录的烟
草、拟南芥 (A rabidopsis tha liana ( L. ) H eynh. )等
进行比对发现 :核苷酸序列的同源性为 81. 72 % ,
推测的氨基酸序列同源性为 96. 90 % (图 4 ) 。将
A nF tsZ 2M的氨基酸序列进行 B lastp ,证实本序列
是 F tsZ蛋白 F tsZ _ type1结构域的一部分。
图 2　AnF tsZ 2M基因片段的 RT2PCR扩增
M: DL2000 Maker; 1:利用随机引物扩增 ; 2:利用 oligo dT
扩增的 A nFtsZ2M基因片断 ; 3:阴性对照 ;
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
图 3　A nFtsZ2M核苷酸序列和递推的氨基酸序列
注 :下划线表示 F tsZ蛋白的两个保守基序 ,黑体示 F tsZ核心功能位点—GTP结合位点
图 4　A nF tsZ2M氨基酸序列同 GeneBank登录的 F tsZ氨基酸序列比对
2. 2　重组病毒载体 PVX2A nF tsZ i的构建及酶切
鉴定
　　根据表 1的引物序列 ,以 A nF tsZ 2M 为模板 ,扩
增出带有相应酶切位点、片段长度同为 283 bp 的
正、反义基因及 232 bp的间隔基因。提取 PVX2A n2
F tsZ i阳性菌的质粒 ,分别用 Sm aⅠ和 S a lⅠ双酶切 ,
切成了两个片段 ,一个是载体片段 ,大小为 10 kb,一
个是正、反义及间隔区基因的融合片段 ,大小为
800 bp左右 (图 8)。可见植物表达载体已经将融合
基因整和进去 ,载体构建成功。载体转化农杆菌后 ,
经 PCR鉴定获得 PVX2A nFtsZ i阳性转化子。 图 5　重组病毒载体 PVX2AnFtsZ i的酶切鉴定M1:λDNA / H ind IIIMarker; 1: Sm aⅠ单酶切 ; 2: SalⅠ单酶切 ;
3: Sm aⅠ /SalⅠ双酶切 ;M2: DL2000 Marker
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第 2期 车代弟等 :复叶槭 F tsZ基因的克隆、RNA干扰载体的构建及其在烟草中瞬时表达
2. 3　被感染烟草 F tsZ基因表达水平分析
如图 6所示 :经过 20个循环扩增 (第三泳道 ) ,
PCR反应未达到平台期。在内参基因 GAPDH扩增
产物比较一致 (图 6A; C) ,即样品总模板浓度一致
的条件下 ,对照植株中检测到明显的目标条带 (图
6B) ,而感染植株目标条带微弱 (图 6D ) ,转录水平
受到了抑制。半定量 RT2PCR结果表明 , PVX2A nF ts2
Z i感染烟草的 F tsZ mRNA表达量下降。
图 6　半定量 PCR检测被侵染烟草 FtsZ基因表达的差异
2. 4　被感染烟草 F tsZ基因叶绿体形态分析
如图 7所示 :对照烟草叶片表皮细胞叶绿体数目
较多 ,经统计每个细胞中平均含有 21. 2个叶绿体 ,而
且叶绿体形态大小均匀。而转化后烟草叶片表皮细
胞中叶绿体数目平均为 8. 65个 ,明显低于对照烟草 ,
并且在 60倍镜下观察 ,转化后的烟草叶片中叶绿体
的形态明显大于对照植株 ,说明 PVX2AnFtsZ i感染烟
草的 FtsZ对烟草叶绿体的发育有明显的抑制。
图 7　光学显微镜对烟草叶片表皮细胞叶绿体形态观察 (A、C为对照 , B、D为转化后 )
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
3　讨论
质体分裂基因 F tsZ 对叶绿体的分裂起关键作
用。对其调控可以影响叶绿体的发育 [ 6 ] ,改变叶片
中叶绿体的分布形态 ,但又不严重影响植株正常生
长发育 [ 8 ] ,所以本研究以质体分裂基因 F tsZ为研究
对象 ,探索园林植物叶色育种的理想目标基因。
本研究构建 RNA 干扰载体属于 hpRNA 型结
构。该载体由 CAMV35S组成型强启动子诱导 ,包
括正义臂和反义臂 ,两臂之间有插入一段间隔基因
(内含子 )。转录后 ,两段序列会自身退火 ,形成
dsRNA结构 ,进而引发 RNA干扰效应。而插入中间
的内含子会随着转录后的修饰而被剪切掉 ,它的存
在可以使反向重复序列的单链 RNA在空间上更加
接近 ,更易配对形成双链 ,增强转基因沉默效率 [ 16 ]。
但是 ,内含子的长短和内含子的插入方向是否影响
干扰片段的转录进而影响干扰效果还不是很清楚。
重组病毒侵染烟草后 ,会快速复制产生大量的
dsRNA,而 dsRNA将被切割成若干 21～23nt的 siR2
NA s。理论上只要复叶槭的这段基因可以产生一
个 ,与烟草靶基因完全匹配的 siRNA s,就可以在烟
草中产生沉默的现象 [ 9 ]。本研究的结果与其一致。
利用这种反向遗传学的方法可以快速的验证从木本
植物中得到的未知基因 ,避免了繁琐的遗传转化过
程 ,而且转基因植株表型的变化也会更加显著。但
是也有报道指出 , siRNA除正义链上 3′端的两个碱
基在序列识别上不起作用外 ,其它碱基中任何一个
改变都可能引起 RNA i效应失效 [ 17 ]。如何保证序列
同源但是亲缘关系较远 (如复叶槭和烟草 )的基因 ,
在剪切过程中形成匹配 siRNA,引起 RNA i效应 ,在
木本类植物中还有待于进一步研究。
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