全 文 ：林业科学研究 2009, 22( 1): 144~ 147
Forest R esearch
文章编号: 10011498( 2009) 01014404
内蒙古中西部杨树内生真菌链格孢属 (A lternaria Nees)的 RAPD分析
袁秀英, 白红霞, 白玉明
(内蒙古农业大学林学院,内蒙古呼和浩特 010019)
关键词: 杨树;内生真菌; 链格孢属; RAPD分析
中图分类号: S792. 11 文献标识码: A
收稿日期: 20070310
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 30660149 )
作者简介: 袁秀英 ( 1954 ) ,女,内蒙古磴口人,教授,主要从事森林病理学研究.
RAPD Analysis ofA lternaria of Endophyte in Poplar in
theM iddlewest Area of InnerM ongolia
YUAN X iuy ing, BA I Hongx ia, BA I Yum ing
( The Forest Col lege of InnerM ongolia Agricu ltu ralUn ivers ity, H uhhot 010019, InnerM ongolia, Ch ina)
Abstract: A total of 25 iso lates ofA lternaria sp. from different loca lities and host plantsw ere amp lified w ith 6 RAPD
pr imers se lected from 50 primers. 69 RAPD markers w ere obta ined, 62 of them were varied. 89. 86% of them were
po lymorph ic. The genetic distance and phy logenetic tree w ere constructed by use o f PopG en32. Iso lates w ere
div ided into 7 groups. The resu lts show ed that genet ic d ivergence of a ll stra ins w ere closely re lated to their host
plants and localit ies.
Key words: poplar; endophyte; A lternaria sp. ; RAPD
内生真菌 ( endophyte或 endophy tic fungi)是指
生活在植物体内或在其生活史的一定阶段处于植物
体内的一类真菌,包括菌根真菌和植物病原真菌 [ 1]。
从目前已经研究过的植物看, 已有很多分离到内生
真菌,因此, 可以推断内生真菌在植物内是普遍存在
的 [ 2]。2004 2005年,先后从呼和浩特市地区及达
拉特旗、四子王旗、额济纳旗采集的杨树 (Populus
spp. )中分离获得内生真菌, 发现链格孢属 (A lternar
ia Nees)广泛分布于各杨树植株中,因此对分离的链
格孢属菌株进行种间遗传多样性分析。
链格孢属真菌是一种分布广、适应性强、极为常
见的真菌, 在人工培养条件下, 孢子形态有趋同倾
向,其属级特征明显而种级特征变异较大, 利用形态
学方法易于鉴定到属而难于鉴定到种。[ 3 - 4 ]由于
RAPD技术具有简单、快速、灵敏度高的特点, 已被
广泛应用于真菌的系统学研究。大量国内外研究成
果表明, RAPD分析技术用于链格孢属下种间及种
内遗传分析是可行的 [ 3 - 5 ]。本文采用 RAPD分析方
法对获得的杨树内生真菌链格孢属菌株进行遗传多
样性分析,并探讨了遗传多样性与宿主及地理分布
的相互关系。
1 材料与方法
1. 1 菌种来源
供试的链格孢菌株均属于杨树的内生真菌, 其
来源见表 1。
1. 2 菌体培养
采用玻璃纸法培养菌丝:试管斜面活化后, 接入
PDA平板中, 25 培养 2~ 3天,转接入铺有玻璃纸
的平板中, 平板培养基为 PDA培养基 (加 80 u!
mL
- 1青霉素 ) ,每皿接入 5 mm见方的小菌块 4~ 5
块,均匀分布于玻璃纸表面。25 培养 3~ 48 h, 小
第 1期 袁秀英等: 内蒙古中西部杨树内生真菌链格孢属 ( A lternaria Nees)的 RAPD分析
心取出接种菌块,用刀片从玻璃纸表面刮去菌丝, 收
集于 1. 5 mL离心管中, - 20 保存备用 [ 6]。
表 1 供试链格孢属菌株的来源
序号 宿主派别 分离部位 宿主年龄 / a 来源
1 胡杨派 干皮 5~ 10 额济纳旗
2 胡杨派 木质部 40 额济纳旗
3 胡杨派 木质部 100 额济纳旗
4 胡杨派 干皮 100 额济纳旗
5 青杨派 叶 20~ 30 和林格尔县
6 青杨派 枝皮 5~ 10 达拉特旗
7 青杨派 叶 20~ 30 和林格尔县
8 白杨派 干皮 1~ 5 和林格尔县
9 青杨派 叶 10~ 20 武川县
10 白杨派 枝皮 1~ 5 和林格尔县
11 青杨派 叶 5~ 10 四子王旗
12 青杨派 枝皮 5~ 10 四子王旗
13 青杨派 叶 5~ 10 四子王旗
14 青杨派 叶 10~ 20 武川县
15 青杨派 干皮 10~ 20 四子王旗
16 青杨派 枝皮 10~ 20 武川县
17 青杨派 枝皮 1~ 5 和林格尔县
18 青杨派 叶 10~ 20 榆林镇
19 青杨派 枝皮 10~ 20 榆林镇
20 青杨派 枝皮 20~ 30 四子王旗
21 青杨派 木质部 10~ 20 武川县
22 青杨派 叶 5~ 10 达拉特旗
23 青杨派 枝皮 5~ 10 达拉特旗
24 青杨派 枝皮 10~ 20 达拉特旗
25 青杨派 干皮 10~ 20 榆林镇
注: 白杨派 ( S ect. L euce Duby )、青杨派 ( S ect. Ta cam aha ca
Spach. )、胡杨派 ( Sect. Tu ranga Bge. )。
1. 3 DNA的提取
采用 CTAB法。称取 0. 5 g菌丝样品, 放入硏钵
中,加液氮研磨成粉, 然后转移至离心管中, 加入 2
mL、65 预热的 CTAB buffer ( 2% CTAB, 1. 4 mmo l
N aC ,l 20mmol EDTA, 100mmolT risHC,l 2% PVP,
0. 2% 巯基乙醇, pH值 8. 0) ,充分混匀后于 65 下
孵育 90m in;加入等体积的氯仿 /异戊醇 ( 24∀1) , 混
匀, 4 下 10 000 r! m in- 1离心 10m in; 取上清液,
加入 2 /3体积 - 20 预冷的异丙醇混匀, 放置 5m in
后出现絮状沉淀, 8 000 r! m in- 1离心 5m in,去掉上
清液;将沉淀溶于 0. 6 mLCTAB bu ffer中, 待充分溶
解后加入等体积的氯仿 /异戊醇 ( 24∀1 ), 4 下
10 000 r! m in- 1离心 10 m in;取上清液,加入等体积
- 20 预冷的异丙醇混匀, 放置 5 m in后出现絮状
沉淀, 8 000 r! m in- 1离心 5 m in; 用 70%的乙醇洗
涤沉淀 2次,待乙醇彻底挥发后加入 150 L三蒸水
溶解 DNA,置于 4 冰箱保存备用。
1. 4 引物筛选
随机引物采用上海生工公司 S系列引物 (引物
序列中 # G+ C∃含量为 60% ~ 70% ), 经预备实验选
择扩增产物稳定、重复性好的引物,用于所有供试菌
株的随机扩增多态性分析。
1. 5 PCR扩增体系
反应体系总体积为 25 L,包括: 10 % Buffer 2. 5
L; M g2+ 2 mmol! L- 1; dNTP 250 mo l! L- 1;
TaqDNA聚合酶 1. 5 U; 10碱基随机引物 30 ng!
L- 1; DNA 10~ 50 ng。按顺序分别加入 PCR管充
分混匀。反应在 GeneAmpPCR System 9700 PCR仪
上进行。扩增程序为: 94 变性 2 m in, 以后 94
变性 40 s, 37 退火 1 m in, 72 延伸 1m in,共 40
个循环,最后 72 延伸 6m in[ 5]。电泳时采用 1 kb
DNA ladder P lus(上海生工公司 )为 DNA m arker指
示扩增片段的大小。扩增产物在 1%的琼脂糖凝胶
中电泳分离, 用 0. 5 %TBE电泳缓冲液,上样 10 L,
3~ 4 V! cm - 1电泳 90 m in, 溴化乙锭染色, 用 UL
TRA CAM D ig ita l Im ag ing型凝胶成像系统 254 nm紫
外光下检测、拍照,重复 3次。
1. 6 数据处理
每个样品的扩增带存在时赋值 # 1∃, 不存在时
赋值 # 0∃,重复过程中稳定出现的带均记为 # 1∃, 建
立原始数据矩阵。计算各样品间的相似系数 S =
2N AB /N A +NB +N AB (其中N A 为 A 样品特有的带数,
NB为 B样品特有的带数, N AB为样品 A、B共有的带
数 )。遗传距离 D = 1- S。用 PopGen32进行聚类分
析,采用 UPGMA(非加权对数算术平均法 )聚类。
2 结果与分析
2. 1 菌丝的 DNA提取
采用 CTAB法提取链格孢菌 DNA时,应在菌丝
生长 1~ 2天内提取, 电泳检测结果表明此时 DNA
片段清晰、整齐,适用于进行 RAPD扩增。
2. 2 引物筛选结果
从 S1~ S50这 50个随机引物中筛选出 6个扩增产
物稳定、重复性好、具多态性的引物,其序列分别是:
S22: 5&- TGCCGAGCTG- 3&;
S23: 5&- AGTCAGCCAC- 3&;
S24: 5&- AATCGGGCTG - 3&;
S27: 5&- GAAACGGGTG- 3&;
S38: 5&- AGGTGACCGT - 3&;
S42: 5&- GGACCCAACC- 3&。
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林 业 科 学 研 究 第 22卷
用 6个引物对所有供试菌株进行扩增, 共获得
69条 DNA条带, 其中 62条为多态性条带,多态率为
89. 86%。 6个引物中 S42引物对 14号菌株未扩增
出任何条带,其他引物 %菌株组合均可扩增到 1~
10条带, 引物扩增的 DNA产物长度范围很广, 在
200~ 4 000 bp之间。
2. 3 系统聚类与菌株来源相关性分析
用筛选出的 6个随机引物分别对 25个链格孢
菌株进行 RAPD扩增,均得到清晰的电泳图谱。图
1是引物 S38的扩增结果。
图 1 引物 S38对 25个链格孢菌株扩增的电泳图谱
菌株之间的聚类结果 (图 2)表明, 在遗传距离
16. 8~ 17. 7之间,可将供试的菌株分为 7组: 8、14、
24号 3个菌株为单菌株组; 1、2、3、4号 4个菌株在
遗传距离 16. 8处被聚为第∋组; 19、20、21、22、23、
25号 6个菌株在 14. 1处聚为第(组; 17、18号 2个
菌株在 15. 8处聚为第) 组; 余下的 5、6、7、9、10、11、
12、13、15、16号 10个菌株在 15. 0处聚为第 ∗ 组。
25个菌株以不同的遗传距离聚于不同的类群, 分析
表明武川县、四子王旗、和林格尔县、达拉特旗和榆
林镇几个地区, 来源相同的菌株分布于不同遗传聚
类组内,来源不同的菌株被聚在同一遗传聚类组, 几
个地区的供试菌株遗传分化不明显, 这表明菌株间
具有遗传组成上的相似性; 而额济纳旗的菌株均来
源自胡杨 (P. euphratica O liv. )却很明显地被分离出
来,可见菌株的遗传分化与宿主及采集地区有一定
的相关性。
2. 4 不同地理来源菌株间的聚类结果分析
文中采集杨树地点达拉特旗位于库布其沙漠东
北部,气候干旱, 风大沙多,四季温差大, 日照充足;
榆林镇位于呼和浩特市以东,大青山地区; 四子王旗
位于呼和浩特市以北,内蒙古高原南沿,荒漠化草原
地带, 干旱、少雨、风大; 武川县位于呼和浩特市以
北,地处大青山北坡, 内蒙古高原南沿, 高寒干旱少
雨;和林格尔县位于呼和浩特市南部, 全县 80% 是
丘陵山区;额济纳旗地处巴丹吉林沙漠,气候干燥少
雨,这里的年降水量多年来平均不足 50 mm,且四季
多大风天气,温差大。地区之间的聚类结果 (图 3 )
图 2 采用 6个引物对 25个链格孢菌株进行 RAPD分析
形成的树状聚类图
表明:武川县、四子王旗这两个生境最相似的地方链
格孢菌株之间的差距也最小, 它们与接下来的和林
格尔县、达拉特旗和榆林镇几个地区菌株之间的遗
传距离相差也较小,但额济纳旗菌株与其他地区之
间的区别很明显。可见, 当气候和生境条件相差较
小时菌株之间的遗传差距不明显, 反之这种差距就
很显著,菌株的遗传分化与环境和采集地有一定的
相关性。
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第 1期 袁秀英等: 内蒙古中西部杨树内生真菌链格孢属 ( A lternaria Nees)的 RAPD分析
图 3 对不同地区进行 RAPD分析
形成的树状聚类图
3 小结与讨论
RAPD分析作为一种快速、灵敏的分子标记已
广泛应用于真菌的种间、种内遗传多样性分析以及
种性鉴定等,表现出很强的多态性 [ 7]。在对真菌遗
传背景了解甚少的情况下, 采用随机引物扩增多态
性 DNA分子标记对内生真菌链格孢进行多态性分
析是行之有效的,可提高分类的客观性、真实性和正
确性。
通过对菌株之间进行聚类未发现扩增产物完全
一致的菌株, RAPD分组与供试菌株的地理来源呈
一定的相关性。生境相差较小的几个地区供试菌株
遗传分化不明显, 这表明菌株间具有遗传组成上的
相似性;而额济纳旗的菌株却很明显的被分离出来,
可见菌株的遗传分化与采集地区、宿主有一定的相
关性。即:当宿主及生境相差不大时杨树内生真菌
链格孢菌株之间的遗传分化很不明显, 而当宿主及
环境条件相差较远时菌株之间的遗传分化就会
明显。
地区之间的聚类结果表明, 各地区的生境差别
大小与菌株的遗传分化之间表现出一定的对应关
系.当地区之间的综合环境条件差别大时这种菌株
之间的遗传分化就表现得明显。菌株之间的聚类结
果和地区之间的聚类结果是一致的, 即: 只有环境条
件差异达到一定程度时菌株之间的这种遗传差距才
会明显地表现出来,供试菌株遗传分化与宿主及其
地理来源呈一定的相关性。关于杨树内生真菌菌株
间差异是否与地理来源、宿主相关的研究,对研究和
应用内生真菌具有重要指导意义。
本文采用玻璃纸法培养菌丝, 给菌丝的收集带
来很大方便。对于易于产孢且菌丝老化快的真菌,
用玻璃纸法培养可提高菌丝收集率, 有效防止孢子
含量高而影响基因组 DNA产率和质量问题的发生。
一些宿主和来源都相同的菌株, 如菌株序号为
23号和 24号、18号和 19号却被聚到不同遗传聚类
组内,说明这些地区的杨树内生真菌在同一属内有
丰富的多样性, 这可能在种的水平上反映了内生真
菌的宿主及组织专一性特点, 应在这方面进行进一
步的研究与探讨。
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