全 文 ：林业科学研究摇 圆园员猿渊专刊冤院园愿苑 园怨缘云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员猿冤专刊鄄园园愿苑鄄园怨
黑杨 阅晕粤甲基转移酶基因片段的分离及表达分析
陈成彬袁 王摇 彬袁 胡宝全袁 王春国袁 宋文芹鄢
渊南开大学生命科学学院袁天津摇 猿园园园苑员冤
收稿日期院 圆园员猿鄄园愿鄄圆园
基金项目院 国家野怨苑猿冶计划项目渊圆园园怨悦月员员怨员园缘冤曰天津市自然科学基金重点项目渊员猿允悦在阅允悦圆怨园园园冤
作者简介院 陈成彬渊员怨苑圆要冤袁男袁河北冀州人袁博士袁主要从事分子细胞遗传学研究援
鄢通讯作者院 耘鄄皂葬蚤造院泽燥灶早憎择岳 灶葬灶噪葬蚤援 藻凿怎援 糟灶袁电话院园圆圆鄄圆猿缘园愿圆源员
摘要院利用同源序列克隆技术袁分离了三倍体黑杨中 源 类渊酝耘栽尧悦酝栽尧阅砸酝尧阅晕酝栽圆冤愿 个特异甲基转移酶片段袁其
中袁缘 个片段与二倍体同源性达到 员园园豫 袁猿 个片段发生了剪切变化遥 通过实时定量 孕悦砸 技术检测 愿 个甲基转移酶
在不同倍性尧不同部位尧不同生长时期间表达模式的差异袁通过对 缘 个不同部位基因表达的检测袁表明不同倍性黑杨
在相同的部位可能由不同种类的甲基转移酶参与主要的甲基化调控遥 通过分析植株从分化早期的茎尖到分化晚期
的叶和茎整个生长过程中基因表达的情况袁发现随着时间的推移袁酝耘栽家族渊孕灶阅员 和 孕灶阅圆冤基因可能是拮抗调节袁
悦酝栽渊孕灶阅猿 和 孕灶阅源冤家族基因可能是协同调节曰而隶属于 阅晕酝栽圆 家族的 孕灶阅远 基因在各部位的表达都比较弱袁唯
独三倍体茎尖有很高的表达遥 由于茎尖是生长旺盛的部位袁孕灶阅远 有可能是影响三倍体速生的重要基因遥 这些结果
可能暗示袁阅晕粤甲基转移酶基因可能参与了黑杨发育过程中叶片形态发生的过程遥
关键词院黑杨曰多倍体曰阅晕粤甲基转移酶曰表达差异
中图分类号院杂苑员愿援 源远 文献标识码院粤
陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 阅晕粤 酝藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻
云则葬早皂藻灶贼泽 蚤灶 孕燥责怎造怎泽 伊 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬
悦匀耘晕 悦澡藻灶早鄄遭蚤灶袁 宰粤晕郧 月蚤灶袁 匀哉 月葬燥鄄择怎葬灶袁 宰粤晕郧 悦澡怎灶鄄早怎燥袁 杂韵晕郧 宰藻灶鄄择蚤灶
渊悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 晕葬灶噪葬蚤 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 栽蚤葬灶躁蚤灶摇 猿园园园苑员袁悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 云则葬早皂藻灶贼泽 燥枣 藻蚤早澡贼 泽责藻糟蚤枣蚤糟 阅晕粤 皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 遭藻造燥灶早蚤灶早 贼燥 酝耘栽袁 悦酝栽袁 阅砸酝 葬灶凿 阅晕酝栽圆 憎藻则藻 蚤鄄
泽燥造葬贼藻凿 枣则燥皂 贼则蚤责造燥蚤凿 孕燥责怎造怎泽 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬 遭赠 怎泽蚤灶早 澡燥皂燥造燥早赠 糟造燥灶蚤灶早 贼藻糟澡灶蚤择怎藻泽援 栽澡藻 澡燥皂燥造燥早赠 葬灶葬造赠泽蚤泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿
贼澡葬贼 枣蚤增藻 燥怎贼 燥枣 藻蚤早澡贼 阅晕粤 皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 泽澡燥憎藻凿 员园园豫 澡燥皂燥造燥早赠 憎蚤贼澡 贼澡藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 凿蚤责造燥蚤凿袁
葬灶凿 泽责造蚤糟蚤灶早 糟澡葬灶早藻泽 蚤灶 燥贼澡藻则 贼澡则藻藻 早藻灶藻泽 憎藻则藻 凿藻贼藻糟贼藻凿援 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽 凿藻贼藻糟贼藻凿 贼澡藻 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻
蚤灶 贼则葬灶泽糟则蚤责贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 贼澡藻泽藻 藻蚤早澡贼 阅晕粤 皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 皂葬贼藻则蚤葬造泽袁 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼蚤泽泽怎藻泽 葬灶凿 凿蚤枣枣藻则藻灶贼
早则燥憎贼澡 责澡葬泽藻泽援 云怎则贼澡藻则 葬灶葬造赠泽蚤泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 阅晕粤 皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶 泽贼葬贼怎泽 蚤灶 贼澡藻 泽葬皂藻 贼蚤泽泽怎藻泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 责造燥蚤凿赠
责燥责造葬则泽 憎葬泽 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 阅晕粤 皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶援 月葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 葬灶葬造赠扎蚤灶早 贼澡藻 贼则葬灶鄄
泽糟则蚤责贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 贼澡藻泽藻 阅晕粤 皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 早则燥憎贼澡 责澡葬泽藻泽袁 蚤贼 泽怎早早藻泽贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 皂藻皂遭藻则泽 燥枣 酝耘栽
早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠 渊孕灶阅员 葬灶凿 孕灶阅圆冤 葬灶凿 悦酝栽 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠 渊孕灶阅猿 葬灶凿 孕灶阅源冤 皂葬赠 责葬则贼蚤糟蚤责葬贼藻 蚤灶 葬灶贼葬早燥灶蚤泽贼蚤糟 则藻早怎造葬贼蚤燥灶
葬灶凿 糟燥燥则凿蚤灶葬贼藻 则藻早怎造葬贼蚤燥灶袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 陨灶 葬凿凿蚤贼蚤燥灶袁 贼澡藻 则藻泽怎造贼泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 孕灶阅远 憎澡蚤糟澡 遭藻造燥灶早泽 贼燥 阅晕酝栽圆
早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠 憎葬泽 憎藻葬噪造赠 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼蚤泽泽怎藻泽 藻曾糟藻责贼 蚤灶 贼澡藻 泽贼藻皂 贼蚤责 燥枣 贼则蚤责造燥蚤凿 孕援 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬援 陨贼 蚤皂责造蚤藻凿
贼澡葬贼 孕灶阅远 皂葬赠 责造葬赠 葬灶 蚤皂责燥则贼葬灶贼 则燥造藻 蚤灶 贼澡藻 枣葬泽贼鄄早则燥憎蚤灶早 燥枣 贼则蚤责造燥蚤凿 孕援 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬援 粤造造 贼澡藻泽藻 则藻泽怎造贼泽 泽怎早早藻泽贼藻凿
贼澡葬贼 阅晕粤 皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 早藻灶藻 皂葬赠 遭藻 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 贼澡藻 藻灶贼蚤则藻 责则燥糟藻泽泽 燥枣 造藻葬枣 皂燥则责澡燥早藻灶藻泽蚤泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院 孕燥责怎造怎泽 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬曰 责燥造赠责造燥蚤凿曰 阅晕粤 皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽曰 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻泽
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
植物中的甲基化调控 阅晕粤 甲基化是基因组
阅晕粤的一种主要表观遗传修饰形式袁是调节基因组
功能的重要手段遥 阅晕粤 甲基化是由 阅晕粤 甲基转移
酶催化进行的袁其分子机制是当甲基转移酶结合
阅晕粤后袁目的胞嘧啶从双螺旋大沟内外翻袁碱基对
间的氢键断裂袁同时伴随着一系列的共价中间物转
移袁在转移酶的作用下 杂鄄腺苷甲硫氨酸中结合于硫
原子上的甲基基团被转移到胞嘧啶的 缘 位碳原子
上遥 在植物中袁阅晕粤 甲基转移酶被分为 源 种袁分别
是 酝耘栽员尧悦酝栽尧阅砸酝和 阅晕酝栽圆遥 酝耘栽员 主要负责在
阅晕粤复制过程中胞嘧啶 缘 位碳原子甲基化状态的
维持遥 通过影响 悦郧位点的甲基化袁组蛋白 匀猿运怨 的
甲基化能够在核仁期控制异染色体的凝聚和组
装咱员暂 遥 利用其维持甲基化的功能达到使其甲基化状
态遗传的目的遥 悦酝栽 类酶是在植物中特有的一类
甲基转移酶袁主要控制非 悦郧 位点的甲基化遥 在拟
南芥中袁悦酝栽猿 突变会导致 悦匀郧 位点以及着丝粒区
非对称的 悦匀匀 位点甲基化的丢失袁同时还伴随着
悦郧位点的甲基化的部分丢失以及转座子的灭
活咱圆 原 猿暂 遥 阅砸酝类蛋白与哺乳动物中的 阅晕酝栽猿 是同
源物袁它们的催化保守结构域有很高的相似性咱源暂 袁但
是在植物中 阅砸酝蛋白有一个独特的 晕端袁包含有 圆
个或 猿 个疏水性 哉月粤渊怎遭蚤择怎蚤贼蚤灶 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿冤结构域袁
这些结构域被认为具有介导蛋白间相互作用的功
能咱缘暂 遥 阅砸酝参与甲基化的具体机制可能是 哉月粤 结
构域通过与染色质蛋白相互作用使 阅砸酝 聚集到特
定的 阅晕粤目标区域袁从而进行从头甲基化遥 阅晕酝栽圆
类酶在植物中的功能和归属划分不是很清楚袁但是
其研究证明袁阅晕酝栽圆 基因在哺乳动物和植物中具有
高度的保守性遥 研究表明袁阅晕酝栽圆 具有 贼砸晕粤 甲基
转移酶活性咱远暂 遥
杨属植物具有生长速度快尧适应性强尧用途广等
特点袁因而袁在世界的许多国家和地区被广泛栽培袁
三倍体黑杨的生长速度远高于普通的二倍体黑杨袁
有着极大的经济和环境效益遥 实验室前期研究证
明袁黑杨三倍化后咱苑暂 袁其基因组甲基化水平显著高于
二倍体袁说明 阅晕粤甲基化后对植物的生长发育起着
非常重要的作用遥 阅晕粤 甲基转移酶是 阅晕粤 甲基化
过程中重要的催化酶袁为进一步探索三倍体黑杨速
生形成的分子机制袁本研究以三倍体和二倍体黑杨
为材料袁利用同源序列克隆尧定量 孕悦砸 技术尧分离了
阅晕粤甲基转移酶基因的特异片段袁并对其在 圆曾 和
猿曾黑杨之间表达差异进行了分析袁试图从 阅晕粤甲基
转移酶基因差异表达角度探究黑杨 圆曾 与 猿曾 速生性
状形成的机理遥
员摇 材料与方法
员援 员摇 材料
实验材料为自然条件下生长的黑杨二倍体渊圆灶
越 圆曾 越 猿愿冤渊孕燥责怎造怎泽 藻怎则葬皂藻则蚤糟葬灶葬 糟造援 耶在澡燥灶早造蚤灶 源远爷冤
和黑杨三倍体渊圆灶 越 猿曾 越 缘苑冤的顶芽尧幼叶和成熟叶
片袁幼叶为顶芽下完全展开的 员 猿 片叶片袁成熟叶
片指叶片形态完全建成袁叶片完全展开且呈深绿色遥
凭证标本保存在南开大学生科院网室遥
员援 圆摇 研究方法
员援 圆援 员摇 基因组总 砸晕粤的提取和反转录摇 选取三倍
体黑杨和二倍体黑杨茎尖尧根尧幼叶尧老叶尧新茎等不
同组织袁使用改良 悦栽粤月 法提取总 砸晕粤咱愿暂 遥 用不含
砸晕葬泽藻的 阅晕葬泽藻 陨处理总 砸晕粤袁除去 砸晕粤 中可能存
在的 阅晕粤遥 用 员援 园豫琼脂糖凝胶和分光光度仪渊晕阅鄄
员园园园 杂责藻糟贼则燥责澡燥贼燥皂藻贼藻则袁 晕葬灶燥阅则燥责冤检测 砸晕粤 的完
整度和浓度遥 使用 孕则燥皂藻早葬 酝鄄酝蕴灾 反转录酶进行
反转录遥
员援 圆援 圆摇 分离 阅晕粤甲基转移酶片段扩增引物摇 根据
郧藻灶藻月葬灶噪中毛果杨的甲基转移酶和去甲基化酶序
列袁利用软件 孕则蚤皂藻则 孕则藻皂蚤藻则 缘 设计引物袁最后经过
晕悦月陨网站的 孕则蚤皂藻则 月造葬泽贼 检测袁引物的序列和退火
温度见表 员遥
表 员摇 分离甲基转移酶基因引物序列
基因名渊黑杨冤 引物名 序列 缘忆鄄猿忆 退火温度 辕 益
孕灶阅员 阅酝栽员云 粤粤郧粤栽栽粤栽栽粤悦粤郧郧粤粤郧粤粤郧粤 缘园
阅酝栽员砸 郧悦粤粤悦粤粤悦栽粤悦粤栽粤悦栽悦粤
孕灶阅圆 阅酝栽圆云 栽粤栽悦粤悦栽粤悦郧悦粤悦郧郧粤悦粤 缘园
阅酝栽圆砸 粤郧粤粤粤郧悦悦郧栽郧粤栽粤悦栽悦郧
孕灶阅猿 阅酝栽猿云 郧粤栽郧悦栽郧悦栽郧郧郧郧栽粤粤粤郧 缘猿
阅酝栽猿砸 郧粤粤郧栽粤郧粤郧郧栽悦粤悦郧悦栽郧郧
孕灶阅源 阅酝栽源云 粤悦粤悦悦粤郧悦郧栽悦栽郧粤悦栽栽悦栽 缘缘
阅酝栽源砸 悦栽栽郧郧粤栽栽栽郧粤粤悦悦悦悦栽悦
孕灶阅缘 阅酝栽缘云 粤粤栽郧郧粤郧粤栽郧粤栽郧粤郧郧郧粤郧 缘圆
阅酝栽缘砸 粤粤悦郧粤粤栽粤悦悦粤粤郧悦悦郧粤栽
孕灶阅远 阅酝栽远云 栽郧粤郧粤悦栽悦栽郧粤悦郧郧悦栽郧悦栽 缘远
阅酝栽远砸 郧悦粤粤悦悦粤悦栽郧悦栽粤悦郧悦栽栽
孕灶阅苑 阅酝栽苑云 粤粤郧悦悦粤粤粤悦栽悦栽悦粤郧栽悦粤栽悦 缘圆
阅酝栽苑砸 粤粤悦悦粤悦郧粤郧粤粤栽悦粤栽悦悦粤郧
孕灶阅愿 阅酝栽愿云 郧粤郧悦粤悦粤粤栽郧栽悦栽悦郧郧栽栽悦 缘圆
阅酝栽愿砸 郧悦悦粤悦悦粤郧悦粤粤郧郧栽栽粤栽栽
愿愿
专刊 陈成彬等院黑杨 阅晕粤甲基转移酶基因片段的分离及表达分析
员援 圆援 猿摇 孕悦砸 产物克隆尧测序摇 在 园援 圆 皂蕴 薄壁离心
管中袁将回收纯化的 孕悦砸 产物与 责耘粤杂再鄄栽员 载体进
行连接遥 取 缘 滋蕴连接产物加到 栽则葬灶泽栽员 大肠杆菌感
受态细胞中去遥 用灭菌牙签挑取单个白色克隆于 员
皂蕴含 粤皂责 员园园 滋早窑皂蕴 原员的 蕴月 液体培养基中袁圆园园
则窑皂蚤灶 原员 猿苑 益 孵育 员圆 员源 澡曰孕悦砸 检测袁将 蕴月 液
体培养基中放置的牙签对应编号逐一移至事先配好
的 孕悦砸 反应液中袁轻摇 孕悦砸 管袁进行 孕悦砸 反应遥
圆郾 园豫琼脂糖凝胶电泳检测袁选取有目的条带菌液袁
部分送北京华大测序袁剩余部分加 苑缘豫灭菌甘油至
终浓度 圆缘豫 袁源 益或 原圆园 益保存遥
员援 圆援 源 摇 实时定量 孕悦砸 检测 摇 根据 郧藻灶藻月葬灶噪 中的
甲基转移酶和去甲基化酶序列袁利用软件 孕则蚤皂藻则
孕则藻皂蚤藻则 缘援 园 设计引物袁并优化引物减少引物二聚体袁
及错配的发生遥 最后经过 晕悦月陨 网站的 孕则蚤皂藻则 月造葬泽贼
检测袁使每对定量引物具有高特异性遥 所有引物渊表
圆冤均由上海生工合成遥
表 圆摇 甲基转移酶及去甲基化酶定量 孕悦砸引物
陨阅 郧藻灶藻月葬灶噪 陨阅 云燥则憎葬则凿 责则蚤皂藻则 攒砸藻增藻则泽藻 责则蚤皂藻则
粤糟贼蚤灶 郧匝猿猿怨苑苑员援 员 砸藻枣藻则藻灶糟藻 缘忆鄄悦悦粤悦郧粤郧粤悦栽粤悦粤栽粤悦粤粤悦栽悦粤粤栽悦
缘忆鄄栽悦栽悦悦栽栽郧悦栽悦粤栽栽悦郧郧栽悦粤
阅酝栽怨园员 圆圆源园苑苑远缘猿 酝耘栽员 缘忆鄄悦郧粤栽郧粤郧栽粤栽郧栽粤郧栽栽郧栽
缘忆鄄粤粤郧栽郧粤悦悦粤郧栽栽粤栽郧粤粤郧
阅酝栽怨园圆 圆圆源员源源源猿圆 酝耘栽员 缘忆鄄栽粤栽悦粤悦栽粤悦郧悦粤悦郧郧粤悦粤
缘忆鄄粤郧粤粤粤郧悦悦郧栽郧粤栽粤悦栽悦郧
阅酝栽怨园猿 圆圆源园缘苑员圆怨 悦酝栽 缘忆鄄郧栽悦栽粤悦郧郧郧栽悦栽栽栽郧栽悦栽栽郧郧栽
缘忆鄄郧栽悦栽栽悦粤郧悦粤郧栽悦栽悦粤栽栽栽悦栽悦粤悦
阅酝栽怨园源 圆圆源园苑员源猿源 悦酝栽 缘忆鄄悦粤悦栽郧栽栽郧悦悦栽粤栽郧粤栽郧粤粤郧
缘忆鄄栽郧栽栽郧粤悦悦栽栽粤栽郧粤粤栽栽郧栽栽郧粤
阅酝栽怨园缘 圆圆源园远园员员愿 阅砸酝 缘忆鄄郧悦悦栽栽悦悦郧栽粤栽悦栽栽悦栽悦栽郧栽
缘忆鄄悦悦栽悦栽栽悦栽栽悦悦郧悦栽栽悦悦栽
阅酝栽怨园远 圆圆源园怨圆源猿苑 阅晕酝栽 圆 缘忆鄄粤郧粤粤郧郧悦栽郧郧栽郧栽悦粤粤栽郧悦
缘忆鄄悦悦栽郧粤栽粤粤郧郧粤悦郧郧栽郧郧悦
阅酝栽怨园苑 圆圆源员员圆园源怨 阅砸酝 缘忆鄄郧悦栽郧悦栽粤粤粤悦悦栽悦悦郧栽粤栽栽
缘忆鄄栽郧栽粤栽郧栽粤粤悦悦栽栽悦悦悦栽悦悦栽粤
阅酝栽怨园愿 圆圆源员猿苑员圆缘 阅砸酝 缘忆鄄悦郧悦悦粤栽粤郧栽栽栽郧栽栽郧粤栽栽悦
缘忆鄄栽栽悦悦粤栽栽栽粤悦栽郧郧栽栽郧粤郧郧
摇 摇 反转录参照宝生物公司的 糟阅晕粤 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 噪蚤贼
说明书进行遥 定量 孕悦砸反应采用罗氏公司的 云葬泽贼鄄
杂贼葬则贼 杂再月砸 郧则藻藻灶 酝葬泽贼藻则 试剂盒袁反应程序在伯乐
公司的 酝赠 陨匝定量 孕悦砸仪上进行袁反应程序院怨缘 益
预变性 猿园 泽袁怨缘 益变性 缘 泽袁远园 益退火 圆缘 泽袁苑圆 益延
伸 猿园 泽袁源缘 个循环袁怨缘 益变性 员 皂蚤灶袁缘缘 益 员 皂蚤灶袁
缘缘 益开始 愿员 个循环袁每个循环上升 园援 缘 怨缘 益遥
定量数据分析使用伯乐软件袁采用 圆驻驻糟贼的分析方法
计算相对表达值遥
员援 圆援 缘摇 不同部位基因表达模式的差异分析摇 为了
保证部位间的表达量进行比较时可以代表同样的生
长环境下的表达状况袁缘 个部位的组织都取自同一
时间的同一个体遥 分别为 躁躁 渊茎尖冤袁曾赠渊幼叶冤袁造赠
渊老叶冤袁曾躁渊新茎冤袁早渊根冤遥 这 缘 个不同部位从生长
时期的角度可以构成 圆 个不同的分化方向袁起始点
都是茎尖袁经过生长则分别向叶和茎方向分化遥
为保证黑杨二倍体和三倍体比较的误差最小袁
需要对样品尧提取 栽燥贼葬造 砸晕粤 组织量渊缘园 皂早冤袁反转
录反应使用的 砸晕粤量都调到 圆 滋早袁孕悦砸扩增模板浓
度都调整成 圆园园 灶早窑滋蕴 原员遥 不同组织 择砸栽鄄孕悦砸 引
物见表 猿袁内参基因 粤糟贼蚤灶序列见表 圆遥
表 猿摇 用于不同组织间定量分析的引物序列
基因名 引物名 序列 缘忆鄄猿忆 退火温度 辕 益
孕灶阅员 阅蕴员云 粤粤郧粤栽栽粤栽栽粤悦粤郧郧粤粤郧粤粤郧粤 缘缘
阅蕴员砸 郧悦粤粤悦粤粤悦栽粤悦粤栽粤悦栽悦粤
孕灶阅圆 阅蕴圆云 栽粤栽悦粤悦栽粤悦早悦粤悦早早粤悦粤 缘园
阅蕴圆砸 粤郧粤粤粤郧悦悦郧栽郧粤栽粤悦栽悦郧
孕灶阅猿 阅蕴猿云 郧栽悦栽粤悦郧郧郧栽悦栽栽栽郧栽悦栽栽郧郧栽 缘愿
阅蕴猿砸 郧栽悦栽栽悦粤郧悦粤郧栽悦栽悦粤栽栽栽悦栽悦粤悦
孕灶阅源 阅蕴源云 郧郧郧粤悦粤郧栽栽粤粤粤悦粤粤粤郧郧栽粤栽 缘愿
阅蕴源砸 栽郧粤粤郧郧栽栽粤郧栽栽郧粤郧栽郧粤郧粤
孕灶阅远 阅蕴远云 粤郧粤粤郧郧悦栽郧郧栽郧栽悦粤粤栽郧悦 远园
阅蕴远砸 悦悦栽郧粤栽粤粤郧郧粤悦郧郧栽郧郧悦
圆摇 结果与分析
圆援 员摇 黑杨甲基转移酶片段的分离及功能分类
圆援 员援 员摇 砸晕粤的提取及检测结果摇 琼脂糖凝胶电泳
结果表明院圆愿杂尧员愿杂 条带清晰袁亮度接近 圆 颐 员袁晕葬灶鄄
阅则燥责砸晕阅鄄员园园园 核酸测定仪测定 韵阅圆远园 辕 韵阅圆愿园的比值
为 员援 愿 圆援 园袁韵阅圆远园 辕 韵阅圆猿园的比值大于 员援 愿袁砸晕粤 提
取质量较好袁蛋白质及 阅晕粤 含量较低袁试验所提取
的 砸晕粤完全可达到反转录的要求遥 反转录后用杨
树看家基因 粤糟贼蚤灶引物对反转录产物进行扩增袁目的
条带在 员缘园 遭责左右渊图 员冤袁与预期的相符合袁表明反
转录结果良好遥
圆援 员援 圆摇 毛果杨 愿 个甲基转移酶的分类摇 为了研究
杨属植物中各甲基转移酶的功能以及明确 晕悦月陨 上
给出的序列到底属于哪种甲基转移酶遥 首先对毛果
杨已测序的甲基转移酶与拟南芥的甲基转移酶进行
序列比对分类遥 同时使用 晕允渊邻接法冤构建进化树
渊图 圆冤遥
通过进化树与拟南芥相应基因的归类以及功能
怨愿
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
图 员摇 粤糟贼蚤灶基因检测反转录产物的电泳图
摇 摇 悦酝栽员尧悦酝栽圆尧悦酝栽猿尧酝耘栽员尧阅酝栽圆尧阅砸酝员尧阅砸酝圆尧阅晕酝栽圆 为拟
南芥中的甲基转移酶遥 阅酝栽怨园员 怨园愿 为毛果杨中对应基因
图 圆摇 毛果杨与拟南芥甲基转移酶序列系统进化树分析
结构域咱怨暂分析袁将毛果杨中 愿 个甲基转移酶进行功
能分类袁并对其黑杨中同源基因进行命名渊表 源冤遥
表 源摇 各甲基转移酶家族功能和对应命名
拟南芥中名称 白杨中命名 黑杨中命名 该家族功能
酝耘栽员 阅酝栽怨园员阅酝栽怨园圆
孕灶阅员
孕灶阅圆
主要参与甲基化状态的维持渊即将半甲基化转为全甲基化冤袁也是非 悦责郧
位点从头甲基化所必需袁并与甲基化状态的延伸有关遥
悦酝栽 阅酝栽怨园猿阅酝栽怨园源
孕灶阅猿
孕灶阅源
该类蛋白具有 悦阅渊糟澡则燥皂燥 凿燥皂葬蚤灶冤遥 有研究表明袁悦酝栽猿 可能在组蛋白甲
基化到 阅晕粤甲基化的过程中起到桥梁作用遥 还参 阅砸酝员 和 阅砸酝圆 之后
的从头甲基化袁起到维持甲基化的作用遥 主要负责非 悦郧 位点的甲基化
维持遥
阅砸酝
阅酝栽怨园缘
阅酝栽怨园苑
阅酝栽怨园愿
孕灶阅缘
孕灶阅苑
孕灶阅愿
该类基因与 阅晕酝栽猿 同源袁主要功能是从头甲基化袁也有一部分维持甲基
化功能遥
阅晕酝栽圆 阅酝栽怨园远 孕灶阅远
功能不是很清楚袁目前研究认为袁它的 阅晕粤 甲基化酶活性可能非常弱袁
而且识别位点并非 悦责郧遥 近期发现袁阅晕酝栽圆 是一种 贼砸晕粤 甲基化酶袁它
对 贼砸晕粤 粤杂孕有专一的活性遥 这一活性在真核生物中是非常保守的遥
圆援 员援 猿摇 黑杨中甲基转移酶基因的分离摇 根据已测
序的毛果杨序列袁分别设计了 愿 对同源克隆引物用
以从三倍体黑杨中分离相应片段遥 使用 栽葬噪葬则葬 的
则栽葬择进行扩增遥 经过 员豫琼脂糖检测得到单一清晰
的片段渊图 猿冤袁片段的大小与预测的一致渊表 缘冤遥
表 缘摇 黑杨中分离出的甲基转移酶各基因片段的长度
基因名 片段长度 辕 遭责 基因名 片段长度 辕 遭责
孕灶阅员 愿缘 孕灶阅缘 苑远园
孕灶阅圆 员源怨 孕灶阅远 缘缘圆
孕灶阅猿 缘园源 孕灶阅苑 员圆源怨
孕灶阅源 怨猿员 孕灶阅愿 愿苑苑
将所得片段与 栽则葬灶泽早藻灶藻 的 责耘粤杂再鄄栽 载体进行
连接遥 阳性克隆送生工进行测序遥 各片段序列经过
遭造葬泽贼灶比对袁除 孕灶阅源尧孕灶阅苑尧孕灶阅愿 外袁与已经测序的
孕灶阅员 孕灶阅愿 分别代表从黑杨中同源扩增 孕悦砸的片段
图 猿摇 黑杨中甲基转移酶分离片段电泳检测
毛果杨对应基因具有 员园园豫 的同源性遥 孕灶阅源 与
阅酝栽怨园源 苑远豫 同源曰 孕灶阅苑 与 阅酝栽怨园苑 愿缘豫 同源曰
园怨
专刊 陈成彬等院黑杨 阅晕粤甲基转移酶基因片段的分离及表达分析
孕灶阅愿 与 阅酝栽怨园愿 远圆豫同源遥
使用 悦蕴韵晕耘酝粤晕粤郧耘砸 软件将 孕灶阅源尧 孕灶阅苑尧
孕灶阅愿 的同源克隆片段与毛果杨对应基因的 皂砸晕粤
序列进行比对渊图 源冤遥
图中阴影部分为相同的序列
图 源摇 孕灶阅源尧孕灶阅苑尧孕灶阅愿 与毛果杨核苷酸序列的比对结果
员怨
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
将图 源 所示的各差异片段与毛果杨的基因组
阅晕粤序列进行比对袁发现差异片段在毛果杨中属于
内含子部分曰因此可以断定黑杨中 孕灶阅源尧孕灶阅苑尧
孕灶阅愿 猿 个基因与毛果杨相比发生了剪切变化袁而只
有 怨园苑 的剪切符合 郧栽 辕 粤郧 规则遥 对图 源 所示的差
异片段序列翻译成氨基酸序列再用 酝燥贼蚤枣 杂悦粤晕 网
站进行功能预测袁发现只有 孕灶阅愿 的一部分序列有
确定功能袁该部分序列为 粤粤粤郧栽粤悦栽郧郧郧粤粤粤悦栽鄄
悦粤栽栽栽悦粤郧郧栽栽栽郧悦粤悦粤 悦郧郧栽粤栽悦栽栽栽栽郧悦粤栽栽郧鄄
悦粤粤栽悦栽郧栽袁翻译后氨基酸序列为 运灾蕴郧晕杂云匝灾悦鄄
栽砸再蕴蕴匀悦晕蕴袁该端氨基酸经 皂燥贼蚤枣泽糟葬灶 预测表明袁此
段序列是 员 个 悦鄄缘 糟赠贼燥泽蚤灶藻鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟 阅晕粤 皂藻贼澡赠造葬泽藻泽
悦鄄贼藻则皂蚤灶葬造 泽蚤早灶葬贼怎则藻遥 在毛果杨中该 皂燥贼蚤枣 被切去了
一段袁失去了这个末端信号遥
圆援 圆摇 甲基转移酶在不同倍性幼叶中的表达差异
取 猿 个黑杨 圆曾和 猿 个 猿曾幼叶 缘园 皂早袁利用改良
悦栽粤月方法提取总 砸晕粤遥 提取后各取 圆 滋早 总 砸晕粤
进行反转录袁以 糟阅晕粤 作为模板遥 根据已测序的相
应基因序列设计特异引物遥 使用 月蚤燥鄄则葬凿 陨匝缘 实时
定量 孕悦砸 仪进行 孕悦砸 反应以及荧光检测袁以 粤糟贼蚤灶
基因作为内参遥 各基因扩增反应都进行 猿 次重复以
确保准确性遥 所得结果使用 圆驻驻糟贼法进行相对表达量
的测定遥 各基因在二倍体和三倍体中表达量如图
缘遥 在幼叶时期 酝耘栽 类和 阅砸酝 类基因表达差异不
大渊除 孕灶阅员 外没有超过 圆 倍体的表达差异冤遥 较明
显的表达差异是属于 酝耘栽 类的 孕灶阅圆 和属于 悦酝栽
类的 孕灶阅源遥 这 圆 个基因在三倍体中的表达与二倍
体相比分别是下调和上调遥
圆曾院二倍体曰猿曾院三倍体
图 缘摇 不同甲基转移酶在黑杨幼叶中的表达差异
圆援 猿摇 不同组织部位中甲基转移酶的表达差异分析
经过初步对 愿 个甲基转移酶在幼叶中的表达量
进行分析袁发现 酝耘栽 类和 悦酝栽 类等负责 阅晕粤 甲基
化维持的甲基转移酶袁他们在不同倍性黑杨中表达
有比较明显的差异遥 为了进一步探索甲基转移酶的
表达模式袁在二倍体和三倍体黑杨中各选择 员 个个
体袁分别取它们不同部位和不同生长时间的组织对
酝耘栽类尧悦酝栽类和功能研究尚不透彻的 阅晕酝栽圆 类
甲基转移酶表达量进行测定袁希望得到在不同组织
黑杨中甲基转移酶的表达模式差异遥
圆援 猿援 员摇 黑杨不同组织间的表达差异 摇 为探究每一
个基因在同一个体内不同组织表达模式的差异袁对
缘 个甲基转移酶在不同部位表达量分别进行了比较
渊图 远冤遥
从图 远 可以看出院孕灶阅员尧孕灶阅圆尧孕灶阅猿尧孕灶阅源 和
孕灶阅远 在黑杨三倍体与二倍体相同部位的表达值不
同院渊员冤孕灶阅员 在三倍体老叶和新茎中的表达值比二
倍体高 愿 倍左右袁而在二倍体幼叶中的表达值却是
三倍体的 猿 倍渊图 远粤冤曰渊圆冤孕灶阅圆 在三倍体茎尖和
新茎中的表达值比二倍体高 员园 倍 渊图 远月冤曰渊猿冤
孕灶阅猿 在二倍体老叶和新茎中的表达值比三倍体高
愿 倍渊图 远悦冤曰渊源冤孕灶阅源 在三倍体茎尖和幼叶中的表
达值比二倍体高 员园 倍和 苑 倍袁而在老叶和新茎中的
表达值却比二倍体的低渊图 远阅冤曰渊缘冤孕灶阅远 在三倍
体中茎尖的表达值比二倍体高 员远 倍渊图 远耘冤遥
圆援 猿援 圆摇 生长分化过程中基因表达差异摇 为了解每
一个基因在同一个体内随着植株生长表达模式的变
化袁将各甲基转移酶在不同部位渊生长时间冤的表达
量分别进行倍性间比较遥 以部位名称渊按照生长时
期和分化方向进行排序冤为横轴袁相对表达量为纵轴
渊图 苑冤遥
图 苑 中袁粤尧月尧悦 是由茎尖到老叶的分化方向袁
阅尧耘尧云 是由茎尖到茎的分化方向遥 三倍体中 孕灶阅圆
在茎尖时期表达高袁而 孕灶阅员 在老叶中高表达渊图
苑粤冤遥 悦酝栽类基因在三倍体随着生长时期呈下降的
趋势袁在二倍体中呈上升的趋势渊图 苑月冤遥 阅晕酝栽圆
类基因在三倍体茎尖时期有多达 员远 倍的表达差异
渊图 苑悦冤遥 孕灶阅圆 在三倍体中从茎尖到新茎时期一直
保持高表达袁远高于二倍体渊图 苑阅冤曰而由茎尖到老
叶发育时期三倍体中的 孕灶阅圆 明显下调袁孕灶阅员 基因
在二倍体和三倍体的茎尖时期差异不大袁但是新茎
时期在二倍体中明显升高遥 悦酝栽 类基因二倍体中
是上升趋势袁三倍体中是下降趋势渊图 苑耘冤遥 在茎尖
时期袁二倍体 孕灶阅源 比 孕灶阅猿 表达高袁到了新茎时期
的三倍体 孕灶阅猿 比 孕灶阅源 高遥 阅晕酝栽圆 基因在三倍体
圆怨
专刊 陈成彬等院黑杨 阅晕粤甲基转移酶基因片段的分离及表达分析
圆曾院二倍体曰猿曾院三倍体曰 早院根曰 躁躁院茎尖曰造赠院老叶曰曾躁院新茎曰曾赠院幼叶
图 远摇 黑杨的不同部位尧不同倍性基因的表达差异
茎尖时期有高表达袁但到新茎时期就降到相近的水
平渊图 苑云冤遥
猿摇 结论与讨论
植物发育过程中袁阅晕粤 甲基转移酶的表达同
阅晕粤甲基化一样随时间尧空间尧组织的不同而动态
变化咱员园暂 曰然而袁在水稻甲基化酶与 阅晕粤 甲基化水平
的研究中发现袁阅晕粤 甲基化与 阅晕粤 甲基转移酶的
活性并不直接相关咱员员暂 曰而在前期的研究中袁黑杨二
倍体检测结果与水稻相似袁但三倍体叶片发育中的
悦郧及 悦匀郧甲基化水平与相应甲基化酶间的相关性
明显高于二倍体咱苑暂 遥 负责 悦郧 甲基化维持的酶
酝耘栽员 在三倍体顶芽中大量表达正对应顶芽高水平
悦郧甲基化水平遥 拟南芥中 酝耘栽员 的突变导致异染
色质中超过 远园豫的甲基化位点发生去甲基化袁并引
起发育异常咱员圆暂 袁由此研究者认为袁酝耘栽员 主要参与控
制异染色质区的甲基化沉默袁从而维持基因组的稳
定和完整咱员猿暂 遥 正如 酝耘栽员 活性对胚胎期发育十分
重要一样咱员源暂 袁植物经过胚胎期要经历甲基化模式的
重新建立袁在三倍体顶芽中处于旺盛时期细胞分裂袁
产生大量的新复制 阅晕粤袁由于基因组的加倍尤其是
奇数倍基因组及亲本基因组不平衡的条件下袁基因
组中复制产生的异染色质区中转座子等移动元件可
能并不稳定袁可能突破甲基化的束缚而激活表达袁从
而激活了 泽蚤砸晕粤介导的 阅晕粤甲基化沉默机制袁通过
三种甲基转移酶稳定甲基化模式袁维持基因组的稳
定性遥 如图 远袁顶芽期渊茎尖冤三倍体大部分甲基转
移酶表达水平高于二倍体袁尤其是与异染色质密切
相关的 酝耘栽员 和未知功能的 阅晕酝栽圆遥
幼叶期的 悦匀郧 甲基化急剧增加对应于负责维
持 悦匀郧甲基化的 悦酝栽 的高水平表达袁相对于顶芽
来说 酝耘栽员 和 阅砸酝 的表达相对下降遥 这类似于拟
南芥的甲基转移酶突变体的研究遥 拟南芥中 酝耘栽员
和 阅砸酝员 及 阅砸酝圆 的三基因突变体中袁基因主体的
悦匀郧位点发生超甲基化咱员缘暂 遥 非 悦郧 甲基化不同于
悦郧甲基化袁非 悦郧 甲基化的建立需要信号的指
猿怨
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
圆曾院二倍体曰猿曾院三倍体曰早院根曰躁躁院茎尖曰造赠院老叶曰曾躁院新茎曰曾赠院幼叶
图 苑摇 黑杨不同生长分化过程中 圆曾和 猿曾基因表达的差异
导咱员远暂 袁组蛋白匀猿运怨 和 匀猿运圆苑 共同甲基化形成 悦酝栽
的识别信号遥 研究发现袁悦酝栽和 阅砸酝控制非 悦郧甲
基化有位点特异性袁而且在功能上对甲基化的控制
有功能冗余现象袁阅砸酝员 辕 阅砸酝圆 辕 悦酝栽猿 三基因突变
体显示出多效的表型改变袁包括发育迟缓尧植株矮小
和部分不育袁这些表型说明 悦酝栽 和 阅砸酝 功能并非
冗余咱员苑暂 袁而 悦酝栽或 阅砸酝单独的突变都没有这些表
型咱员愿暂 袁说明 悦匀郧 甲基化是对 悦郧 甲基化的补充袁
悦酝栽和 阅砸酝可能参与形成了一个受信号诱导的具
有位点特异性的 阅晕粤 甲基化调控系统遥 同时幼叶
期的去甲基化酶表达水平高于顶芽和成熟叶片袁对
应了甲基化趋势分析中袁幼叶期去甲基化趋势高于
超甲基化趋势遥 甲基化的建立尧维持和去甲基化是
甲基化动态调控系统的 猿 个主要步骤袁而去甲基化
在幼叶期的活跃则侧面说明了甲基化动态变化十分
活跃袁非 悦郧甲基化参与多倍体黑杨叶片的发育调
控曰而且通过对部分片段的测序发现袁大部分这些甲
基化位点是在基因编码区遥 最近的研究发现袁传统
的只有启动子甲基化抑制基因表达的观点袁在植物
阅晕粤甲基化调控网络中并不完整袁植物中基因编码
区的 阅晕粤甲基化也能参与基因调控袁基因编码区的
甲基化能抑制转录的延生引起转录沉默咱员怨暂 遥
基于以上分析袁作者认为 阅晕粤 甲基化参与黑
杨三倍体叶片发育的可能过程院顶芽中活跃的
阅晕粤复制激化了三倍体基因组的不平衡袁激活了
阅晕粤甲基化途径袁主要是 悦郧甲基化维持基因组的
稳定曰随后在幼叶中袁细胞分裂活动减缓 酝耘栽员 表
达减少袁但三倍体依然维持高于二倍体的表达水
平袁多倍化激活了相关发育信号并指导非 悦郧 甲基
化参与基因表达调控曰在成熟叶片中袁基因表达水
平基本稳定袁阅砸酝 开始重新建立甲基化袁使某些基
因的表达沉默遥
源怨
专刊 陈成彬等院黑杨 阅晕粤甲基转移酶基因片段的分离及表达分析
参考文献院
咱员暂 栽葬则蚤择 酝袁 杂葬扎藻 匀袁 孕则燥遭泽贼 粤 灾袁 藻贼 葬造援 耘则葬泽怎则藻 燥枣 悦责郧 皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶 蚤灶
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 葬造贼藻则泽 责葬贼贼藻则灶泽 燥枣 澡蚤泽贼燥灶藻 匀猿 皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶 蚤灶 澡藻贼藻则燥糟澡则燥皂葬鄄
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咱源暂 悦葬燥 载袁 杂责则蚤灶早藻则 晕 酝袁 酝怎泽扎赠灶泽噪蚤 酝 郧袁 藻贼 葬造援 悦燥灶泽藻则增藻凿 责造葬灶贼 早藻灶藻泽
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咱员怨暂 砸葬灶早葬灶蚤 郧袁 运澡燥凿葬噪燥增泽噪葬赠葬 酝袁 粤造蚤皂燥澡葬皂皂葬凿蚤 酝袁 藻贼 葬造援 杂蚤贼藻鄄泽责藻鄄
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