全 文 ：书林业科学研究!"#$"!"%"&#$&$$ &$
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!!文章编号!$##$($&)""#$"##&(#&$$(#
落叶松体胚发育中 !" 个针叶树
特异 #$%&()*+表达分析
张俊红$! 吴!涛$! 韩素英"! 齐力旺$! 张守攻$!
"$*中国林业科学研究院林业研究所!北京!$###)$% "*中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所!北京!$###)$#
收稿日期$ "#$"(#+($+
基金项目$ 国家&),+计划项目""##)-.$$)$###和国家自然基金"+#+##/#
作者简介$ 张俊红"$)&(#!女!江西新余人!博士研究生*
!
通讯作者*
摘要!以落叶松体细胞胚胎发育 个阶段的材料构建小 012文库!进行了 345678测序)9:012鉴定)靶基因预测)
;0<(=-0定量分析等研究* 结果表明$发现的 , 个 9:012>中!") 个为针叶树特异的!来自 $" 个家族!分别为
9:0)&/)9:0)&,)9:0)%#)9:0)%$)9:0$+$$)9:0$+$")9:0$+$+)9:0$+$&)9:0$+$/)9:0+,#$)9:0+,#" 和 9:0+,#&!其
中 "% 个长度为 ""?@!且在小012文库中的最低拷贝数为 $"9:0$+$$#!最高拷贝数为 ++ ##)"9:0)%##* 发现 $"
个9:012家族的 +& 个靶基因可能参与生长发育)抗病)2AB反馈调节等多方面遗传调控%;0<(=-0分析表明$,"C
9:012>表达次高峰在后期单胚或早期子叶胚!在中期子叶胚最低!最高峰在后期子叶胚!分别与子叶形成)胚胎后
熟)胚胎休眠的生理活动相吻合!而9:012前体的表达模式不同于9:012!前体变化幅度小于成熟体*
关键词!日本落叶松%体细胞胚胎%9:DE4012%针叶树%表达分析
中图分类号!3,)$*"" 文献标识码!2
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$" 9:012I89:5:6>!SF:DF S6E65:?T6L @498?KE6>Q6D@>4IE6NH58@:4?!:?D5HL:?NQ58?@NE4S@F 8?L L6P654Q96?@! L:>(
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林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
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!!9:DE4012"9:012#是一类 "# ""?@长内源小
012!参与调控植物器官的形态建成)激素应答途
径)逆境胁迫和营养代谢等一系列过程,$ V+- * 目前
公认 "# 个9:012家族在陆地植物中保守!而有些
9:012仅在某些进化分支的物种中存在!如9:0&#+
仅在双子叶植物中保守,&- %因而!分化更早的裸子植
物或针叶树是否也有着特异的 9:012已成为待解
的问题* 目前!9:0.8>6登录的植物 9:012信息绝
大部分是被子植物的!关于裸子植物的仅见火炬松
"B:21%&($C( W:??*# 和欧洲云杉 "B:)$( (D:$%W*
X8E>@#
,% V/-
* 裸子植物9:012信息的匮乏很大程度
阻碍了裸子植物 9:012的研究进展* 新兴的小
012文库高通量测序技术的运用可帮助解决这个
瓶颈!特别对于基因组庞大)O3<>信息少的针叶树*
日本落叶松 " =(#:?@$A&"@$A:%" 3:6R*6@YHDD*#
A4EL*#是我国北方及亚热带中高山区针叶速生造林
用材树种,,- * 植物体细胞胚胎发生技术是针叶树育
种与繁殖的重要手段之一!同时也是研究合子胚胎
发育的良好模式体系* .4S6等,-研究发现!裸子植
物与被子植物是在石炭纪"约 + 亿年前#从同 $ 个祖
先中分化出来的!这两界植物的种子和胚胎形成过
程有着实质性的差异!二者的胚胎发育形态和发育
阶段也显著不同!暗示着裸子植物胚胎发育的特异
分子生物学机制,) V$#- * 由大部分 9012在被子植
物和裸子植物中保守,$$ V$+-的事实推断!二者的差异
可能归因于主调控基因的差异表达或不同活性,$#- %
然而!部分 9012仅在裸子植物胚胎发育时期表
达,$+- !且裸子植物特别是针叶树有着庞大的基因组
"/ %##ZR +, ###ZR#
,$&-
!因此!裸子植物胚胎发
育过程中可能存在着特异的基因调控网络* 本实验
构建小012文库和 345678技术测序!分析落叶松体
细胞胚胎发育 个阶段的9:012表达!旨在发现针
叶树特异 9:012和分析其在体细胞胚胎发育过程
中的表达!为揭示针叶树体细胞胚胎发育中 9:012
的遗传调控机理提供科学依据*
$!材料与方法
!*!A实验材料
以日本落叶松体细胞胚胎稳定发生的 /+ 细胞
系为实验材料!胚性细胞的继代培养"2.2添加前#
和成熟培养"2.2添加后#均在黑暗环境下"""% [
"#\#!根据形态解剖学特征划分为 个发育阶段!
依次为$原胚团
!
"=OZ
!
!继代培养 " L#)=OZ
"
"继代培养 $% L#)早期单胚"成熟培养 " L#)中期单
胚"成熟培养 / L#)后期单胚"成熟培养 $% L#)早期
子叶胚"成熟培养 "& L#)中期子叶胚"成熟培养 ")
L#和后期子叶胚"成熟培养 +) L#*
图 $!落叶松体细胞胚胎发生 个发育阶段的形态观察
"$&
第 & 期 张俊红等$落叶松体胚发育中 $" 个针叶树特异9:DE4012>表达分析
!*"A试剂与仪器
$*"*$!试剂!<4@85012=HE:I:D8@:4? X:@购自1B0(
AO1R:4@6T D4EQ4E8@:4?"加拿大#%3985012G>458@:4?
X:@购自百泰克生物科技有限公司"北京#%1-4L6
]GWB9:012D^12>K?@F6>:>T:@购自:?P:@E4N6? 公司
"美国#%3_.0=E69:7O` <8; 购自宝生物工程有限
公司"大连#%其它试剂为国产分析纯试剂*
$*"*"!仪器!1^ ($### 购自 2N:56?@公司"美国#%
小 012文库构建与测序在 W-3D:6?D6>"美国#%
;0<(=-0定量分析在2.G,%## 定量仪"美国#*
!*BA研究方法
$*+*$!小 012文库构建和数据分析!<4@85012
=HE:I:D8@:4? X:@提取总012! 1^ ($### 和 $C琼脂糖
凝胶电泳检测 012浓度和质量* 个阶段的总
012等量混合后构建小 012文库)345678技术测
序)G5H9:?8软件读取原始数据)2-A<$#$(9:0QE4(
NE89"]6E>:4? +*%#下游分析,$%- )筛选后的小 012
序列比对到 9:0.8>6$,*# " F@Q$aaSSS*9:ER8>6*
4EN
,$/-
#! 允许 " 个错配*
$*+*"!靶基因预测!9:012序列与落叶松 O3<>
上传至 Q>012<8EN6@网页 " F@Q$aaQ58?@NE?*?4R56*
4ENaQ>012<8EN6@a#!选择功能 + 和默认参数!预测
9:012靶基因,$,- !在 b?:QE4@注释其功能" F@Q$aa
SSS*H?:QE4@*4ENa#*
$*+*+!;0<(=-0定量研究!3985012G>458@:4? X:@
提取小012!1^ ($### 和 $%C变性 =2AO胶检测小
012浓度和质量!1-4L6]GWB9:012D^12>K?@F6(
>:>T:@将小012加2反转录成 D^12"稀释 "# 倍#%
<4@85012=HE:I:D8@:4? X:@提取总 012!06P6E@2:L
J:E>@3@E8?L D^123K?@F6>:>X:@将总 012反转录成
D^12"稀释 % 倍#* 3_.0=E69:7O` <8; T:@在 ,%##
定量仪器上进行9:012定量分析!具体步骤按说明
书进行* =-0结束后!做熔解曲线和 "C琼脂糖凝
胶电泳验证产物的特异性* 每个样品 + 次技术重
复!在前期的筛选与分析后!9:012成熟体和前体
分别选用 %*3 E012和OJ($ 做内参基因*
"!结果与分析
"C!A落叶松体细胞胚胎的#$()*分析
小012文库测序发现了 +% 个 9:012家族!共
, 个 9:012>!其中!$" 个 9:012家族包括 ") 个
9:012>仅在针叶树中保守!这些特异 9:012用于
进一步分析和下游实验* 这类 9:012>的大部分长
度为 ""?@!仅 9:0$+$+R)9:0$+$/8aR 和 9:0+,#" 为
"$?@"表 $#!不同于 -^W$ 切割产生的传统 "$?@长
9:012%然而!这些9:012>有着植物保守9:012的
共性!如大部分9:012%+端以&b开始!占 )*/C!
仅9:0)&/8以&-!9:0$+$/R 和 9:0+,#" 以&2开
始"表 $#* 在小012文库中!9:012家族的丰度变
化很大!最低拷贝数为 $ 个"9:0$+$$#!最高拷贝
数为 ++ ##) 个"9:0)%##!且各 9:012的丰度变化
也很大!在文库中最低拷贝数为 $ 个"9:0)&,R#!最
高拷贝数为 ) $+/ 个"9:0)%$8#*
"C"A落叶松#$()*靶基因的预测
$" 个9:012家族预测到 +& 个靶基因"表 "#!
这些潜在靶基因的功能复杂多样!参与植物生长发
育)抗病)2AB蛋白反馈调节等多方面遗传调控*
具体为$9:0)&/"$ 个#)9:0)&,"$ 个#和9:0$+$/"$
个#的 $ 个潜在靶基因与转录因子同源%9:0)&/""
个#)9:0)%# "$ 个#)9:0$+$$ "" 个#)9:0$+$" ""
个#和 9:0+,#&"$ 个#的潜在靶基因与 1.3(W00病害抵抗蛋白同源% 9:0)&, " $ 个 #)
9:0$+$$"$ 个#和 9:0$+$+"+ 个#的潜在靶基因与
蛋白激酶同源* 另有 + 个潜在靶基因比对到云杉未
知功能9012!其它的靶基因多为具有某种结构域
的蛋白质或功能酶!如 9:0)&, 的 $ 个可能靶基因
"c0$/,%/)#与 2EN4?8H@6蛋白"2AB#同源!2AB蛋
白包含=2Y和 =GdG" 个结构域!是 012沉默复合
体"0G3-#的核心组分,$- *
"CBA落叶松体胚发生过程中#$()*的表达分析
针对9:012在落叶松体细胞胚胎发生过程中
的表达分析!采用 ;0<(=-0技术实时监测了 $ 个
9:012在体胚发生过程中 个发育阶段的表达变化
"图 "#* 大部分 9:012的表达最高峰在后期子叶
胚!次高峰分别在 =OZ
"
"9:0+,#"#)早期单胚
"9:0)&,8和9:0)&,R#)中期单胚"9:0)&/R#)后期
单胚"9:0)%$8)9:0)%$D)9:0$+$$ 和 9:0$+$&# 和
早期子叶胚 "9:0)&/8)9:0)%#8(%=a+=)9:0)%#L)
9:0)%#6)9:0)%$R)9:0$+$")9:0$+$/ 和9:0+,#$#%
但是!9:0$+$+ 表达模式有着实质性的差异!表达丰
度在前 % 个阶段持续升高!后期单胚达到最高峰!而
早期)中期子叶胚下降!但后期子叶胚显著上升至次
高峰*
+$&
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
"CDA落叶松体胚发生过程中 #$()*前体的表达
分析
为分析9:012前体在体胚发生过程中的表达
模式!采用 ;0<(=-0技术实时监测了 & 个9:012前
体在体胚 个发育阶段的表达变化* 9:012前体
的表达模式不同于 9:012!前体变化幅度小于成熟
体"图 +#* 表现为$9:0)&/R 前体表达在前 & 个阶
段逐渐升高!最高峰在中期单胚!而后期单胚急剧降
低!早期子叶胚降至 =OZ
!
水平!而在中期)后期子
叶胚升高!呈&升(降(升模式%9:0)&,R 前体丰度在
前 + 阶段逐渐升高!最高峰在早期单胚!中期单胚开
始的 & 个阶段逐渐降低!但后期子叶胚升高!呈&升(
降(升模式%9:0)%#8前体水平在继代培养略有降
低!而早期单胚显著升高至最高值!中期单胚开始的
% 个阶段逐渐降低!呈&降(升(降模式%9:0)%$8前
体含量在继代培养中略有降低!而成熟培养后显著
升高!中期单胚为表达最高峰!而在后期单胚降低后
保持相对稳定水平!呈&降(升(降模式*
表 !A落叶松中针叶树特异#$()*的序列
家族 9:012 序列"%+(++# 长度a?@ 拷贝a个
9:0)&/ 9:0)&/8 -2A---bb-b--b2b--2-22b "" $"$
9:0)&/R b22A-2A---bb-b--A2b--2 "" $ )$
9:0)&, 9:0)&,8 b2b-AA22--bAbb2-bAbbb- "" / ,#&
9:0)&,R b2b-AA22b-bAbb2-bAbbb- "" $
9:0)%# 9:0)%#8(%Q b-2-Ab-bAAA--2-A2bAAbb "" % #$#
9:0)%#8(+Q b--AAA--2-A2bAAbbb2bA2 "" ,)/
9:0)%#R(%Q bb2-Ab-bAAA--2-A2bAAbb "" /)
9:0)%#R(+Q b-bAA2--b-AAbAAbbb2bA2 "" $/&
9:0)%#D(%Q bA2-2b-AAAA--2-A2bAAbb "" "+
9:0)%#D(+Q b22-2b-bAAA--2-A2bAAbb "" + %,/
9:0)%#L b-2-2b-bAAA--2-A2bAAbb "" " &",
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9:0)%#I b-2-2b-bAAA--2-A2bA2bb "" ,&$
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9:0)%#F b-bAAA--2-A2bAAbb22bA2 "" " $&%
9:0)%$ 9:0)%$8 bAbb-bbA2-Ab-bAA2--2-A "" ) $+/
9:0)%$R b2bb-bbA2-Ab-bAA2--2-A "" / )&#
9:0)%$D bAbb-bbA2-Ab-bAAA--2-A "" " $/
9:0$+$$ 9:0$+$$ b-2A2AbbbbA--2Abb--A-- "" $
9:0$+$" 9:0$+$" bb-AA2A2A2222bAA-A2-2b "" $ #%+
9:0$+$+ 9:0$+$+8 b2--2-bA222bb2bbAbb-A2 "" ,
9:0$+$+R b2--A-bA222bb2bbAbb-A "$ &&
9:0$+$& 9:0$+$& b-AA--b-A22bAbb2AA2A22 "" +"&
9:0$+$/ 9:0$+$/8 bb--2bA-2-222--2bbAA2 "$ ,
9:0$+$/R 2A2b-bb--2bA-2-222--2 "$ ++
9:0+,#$ 9:0+,#$ b222-22bA---2---bb-2b- "" ,)
9:0+,#" 9:0+,#" 22b-2bA2-bAbAA2b-AA2b "$ &,,
9:0+,#& 9:0+,#&8 bbbbb-A22-b--2--b2A2-- "" " )"
9:0+,#&R bb---22-b--2--A2A2---2 "" %//
&$&
第 & 期 张俊红等$落叶松体胚发育中 $" 个针叶树特异9:DE4012>表达分析
表 "A针叶树特异#$()*的靶基因预测
9:012
靶基因
"不匹配碱基#
功能注释 得分a期望值
9:0)&/ c0$&))") "+*## .+ 转录因子 琴叶拟南芥"-#(D:C"A%:%@9#(&( W:??# $$/"")$# a,6(",
c0$/+#$ "$*%# --(1.3(W00蛋白 西部白松"B:21%E"2&:)"@( 4^HN5# /)*+"$/# a+6($%
c0$,+,#% ""*%# --(1.3(W00蛋白 西部白松 /"*&"$%## a)6($#
9:0)&, c0$/,%/) ""*%# 2EN4?8H@6蛋白 毛果杨"B"A1@1%&#:)*")(#A( <4E*eAE8K# &+&"$ $$%# a/6($&$
c0$/& "+*## 酪蛋白激酶 蓖麻":):21%)"EE12:%W*# $$&"$"/# a+6(""
c0$%", "+*## "/3蛋白酶体 葡萄"F:&:%G:2:H$#( W*# $ +$#"$ &%"# a#*#
c0$%)++& "+*## Z20结合蛋白 甜瓜"I1)1E:%E$@"W*# $/$"&#,# a6(&+
9:0)%# c0$&)%"# "$*%# Af#&$#$g1$) 9012白云杉"B:)$( 4@(1)( Z46?DF*# $"%"$+# a"6("%
c0$),$ ""*%# c0$%$"#+ "+*## d3#&,"g=$, 9012北美云杉"B:)$( %:&)*$2%:%.4?N*# "$")$## a#*#
9:0)%$ c0$%"%,/ ""*%# 1^2复制起始因子Z-Z, 蓖麻 $ #") "" //$# a#*#
c0$/+)/+ "+*## 锌指蛋白 拟南芥"-#(D:C"A%:%&*(@:(2( W*# ",,",#)# a"6(,
c0$&#," "+*## Af#+)#"gJ""9012白云杉 "/# ""# a&6(//
9:0$+$$ c0$%&+&" ""*%# --(1.3(W00蛋白 西部白松 ""/ ""%## a$6(%%
c0$%%)$% "+*## 085:?6合成酶 蓖麻 "+","%# a+6()+
c0$/%$/ "+*## 受体蛋白激酶 樟子松"B:21%%9@G$%&#:%W:??*# $"% "+$%# a&6(+"
c0$%/")$ "$*%# --(1.3(W00蛋白 糖松"B:21%@(ED$#&:(2( 4^HN5# ,/*/"$,# a%6($&
9:0$+$" c0$%#,,& "+*## 锌指蛋白 水稻"J#9K( %(&:G( W*# "$ "%%/# a/6(/$
c0$/,)&/ "+*## A<=环水解酶 大麦","#C$1EG1@4(#$W:??*# *"""$,# a&6(+#
c0$)&",# "+*## c0$///, "+*## 9:0$+$+ c0$/""#" "+*## 丝氨酸a苏氨酸蛋白激酶 拟南芥 "%+ "/&,# a$6(/
c0$"&# ""*%# 丝氨酸a苏氨酸蛋白激酶 拟南芥 $##""&)# a%6("+
c0$&$&$& "+*## 丝氨酸a苏氨酸蛋白激酶 拟南芥 +##",/)# a$6()
9:0$+$& c0$/)%), "+*## 单脱氢抗坏血酸还原酶 麝香百合"=:@:1E@"24:H@"#1E9:0$+$/ c0$/%%)# "+*## 锌指蛋白 欧洲云杉 &#+"&&/# a6($#)
c0$,+&&" ""*%# O^ 3$ 类似蛋白 玉米"+$( E(9%W*# )&*#""+"# a"6("#
c0$,)#$/ ""*%# 乙烯不敏感 + 型转录因子 苹果"L(@1%C"E$%&:)( .4ETF*# $)&""$&# a&6(&/
c0$&")%% "+*## 细胞分裂蛋白 蓖麻 $+"$%"# a)6(")
c0$&$/$ "$*## O^ 3$ 蛋白 烟草".:)"&:(2( &(D()1EW*# $&&"+/&# a$6(+/
9:0+,#$ V V V
9:0+,#" c0$&)##, ""*%# 毛状体双折射类似蛋白 拟南芥 #*% "$),# a/6($%
9:0+,#& c0$&+, "+*# # <:D"" 类似蛋白 拟南芥 $,&"&&"# a$6(%#
c0$,,+,$ "+*# # c0$,)+# "+*# # /#3核糖体蛋白 拟南芥 +++ "+/# a)6(
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林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
图 "!落叶松体细胞胚胎发生过程中的9:012表达分析
图 +!落叶松体胚发生过程中 & 个9:012前体的表达分析
/$&
第 & 期 张俊红等$落叶松体胚发育中 $" 个针叶树特异9:DE4012>表达分析
+!结论与讨论
9:0)&/)9:0)&, 和 9:0)%# 等 $" 个 9:012家
族仅在火炬松或云杉中保守!为针叶树特异 9:0(
12!在针叶树的生长发育中起调控作用!而被子植
物中因无进化优势而丢失!或在被子植物和裸子植
物分化后!仅在针叶树中进化* 9:0)%# 和 9:0)%$
在小012文库中丰度最高* 9:0)%$ 在火炬松中证
实可切割非蛋白质编码序列"与植物病害抵御蛋白
同源#产生短肽或次级 >:012!9:0)%# 也可能如
此,/- * 短肽是一类植物信号分子!在生长发育中起
重要作用!不能由生长素或细胞分裂素替代,$) V"#- *
关于 9:012调节短肽信号转导进而调控体细胞胚
胎发生还有待进一步研究证实* 次级>:012可切割
靶基因 9012,"$- !靶基因多为快速扩张的基因家
族,""- !因此!针叶树进化出一类可产生次级 >:012
的9:012!用于平衡那些快速扩张的基因家族*
传统古老植物9:012的长度为 "$?@!在陆地植
物中保守,%! "+- * 在落叶松中发现的这类仅在针叶树
"火炬松或云杉#中保守的 9:012!长度为 ""?@* 研
究认为!L<基因是靶基因反向复制而进化产生的!
漫长进化伴着的突变使茎环长度逐渐缩短!序列匹
配性逐渐降低,"+ V"&- * 9:012前体的茎环长度与
-^W>的选择有关!产生不同长度小012>!具体表现
为$最古老的 L<基因转录的较短发夹结构前体!
主要由 -^W$ 加工产生 "$?@9:012%中间G0(L<基
因转录的中等长度发夹结构前体!主要由 -^W& 加
工产生 "$?@9:012%而原L<"QE4@4(L<#基因转录
的长发夹结构前体!主要由 -^W" 加工产生 ""?@
9:012
,"&-
* 因此!落叶松中这类针叶树特异的9:0(
12可能由原L<基因编码! -^W" 切割产生*
大部分针叶树特异 9:012>的表达次高峰在后
期单胚或早期子叶胚!表达最低值在中期子叶胚!而
在后期子叶胚丰度急剧上升至最高峰* 后期单胚至
早期子叶胚的过渡期间!子叶的大小)数目和对称性
等特性均受到高度调控!与 9:012上调表达相吻
合* 中期子叶胚阶段!贮存蛋白基因和晚期丰富蛋
白基因高度表达,"% V"/- !9:012的下调表达可能直
接或间接地保护9012不被切割!完成胚胎的后熟*
后期子叶胚阶段!胚胎已成熟即将进入休眠!参与成
熟或后期萌发的基因都需关闭!急剧上调表达的
9:012将残留靶基因9012快速清除*
本文在落叶松体胚发生过程中发现了针叶树特
异的 $" 个9:012家族并预测了靶基因!开展了这
些9:012在落叶松体细胞胚胎发生过程的表达分
析%然而!仍有大量针叶树特异 9:012待鉴定和发
现!因有限的落叶松 O3<信息!靶基因预测仍不完
善* 根据9:012的表达模式!只能预测其功能!要
验证一个9:012功能!需进行遗传转化!这也是当
务之急需进行的工作*
参考文献!
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