全 文 ：林业科学研究 2005, 18( 3) : 364~ 368
Forest Research
文章编号: 10011498( 2005) 03036405
转双价抗蛀干害虫基因杨树的获得及其抗虫性鉴定
张冰玉1, 苏晓华1* , 李义良1, 张永安2, 曲良建2, 王玉珠2, 田颖川3*
( 1 中国林业科学研究院林业研究所, 北京 100091; 2 中国林业科学研究院森林生态与环境保护研究所,北京
100091; 3中国科学院微生物研究所, 北京 100080)
关键词: 杨树; 遗传转化;双价基因; 蛀干害虫;抗虫性
中国分类号: S79211 文献标识码: A
收稿日期: 20041202
基金项目: 国家转基因植物研究与产业化专项课题 优质高产抗干旱耐盐碱杨树基因工程育种研究( J2002B004)
作者简介: 张冰玉( 1969 ) ,女,博士,助理研究员,主要从事林木生物工程育种研究.
* 通讯作者: suxh@ caf. ac. cn; tianyc@ sun. im. ac. cn
Transformation of Poplar ( Populus alba P. glandulosa cv. !84K∀ ) with
Binary Insect Resistant Genes and Analysis of Insect Resistance
ZHANG Bingyu1, SUXiaohua1, LI Yiliang 1 , ZHANG Yongan 1
QU Liangj ian2 , WANG Yuzhu 2, TIAN Yingchuan3
( 1 Research Institute of Forestry, CAF, Beijing 100091, China; 2 Research Institute of Forest Ecology, Environment
and Protect ion, CAF, Beijing 100091, China; 3 Institute of Microbiology , CAS, Beijing 100080, China)
Abstract: Transgenic poplar ( Populus alba P. glandulosa cv! 84k∀ ) plants with the coleopterous insect resistant genes
( BtCry3A and OCI )were obtained. The transgenic nature of these plants was confirmed by PCR amplification and dot hybridiza
tion. The transgenic poplar∀ s toxicity towards the Anoplophora glabripennis larvae was assessed on two yearold selected plants in
laboratory conditions. The results indicated that the transgenic lines BOGA38 and BOGA39 were deleterious for A . glabripennis
larvae, and BOGA5、BOGA31、BOGA38、BOGA39 could inhabit the growth of A . glabripennis larvae. BOGA39 was the most
toxic one among the transgenic lines, with 4118 % corected mortality rate and 7890 % growth inhabit rate for the larvae.
Key words: Populus; transformation; binary genes; coleopterous insect ; insect resistance
随着我国大规模人工林的发展, 天牛等高危害蛀
干森林害虫蔓延肆虐。目前,防治蛀干森林害虫主要
采用人工机械防治和化学防治等。由于绝大多数蛀
干害虫具有繁殖速度快、生活场所隐蔽、世代较长并
不整齐等特点,防治难度较大,所以到目前为止, 由蛀
干森林害虫所导致的虫害并未得到根本的控制, 并且
呈逐年加重态势,对林业生产和生态环境建设影响严
重。如在我国的华东、华北、东北、西北等地都有大片
杨树( Populus spp. )、柳树( Salix spp. )被光肩星天牛
(Anoplophora glabripennis Motsch. )毁灭的报道。三北
防护林工程, 遭受天牛的危害严重, 完全失去利用价
值,经济损失严重[ 1]。为减轻蛀干害虫给林业生产造
成的巨大危害, 减少有毒化学农药的使用量, 保护环
境和生态平衡,培育抗蛀干害虫的林木是解决这一难
题的安全、环保、有效的方法之一。
由于林木的世代周期较长, 采用基因工程手段
在短时间内培育出抗虫林木新品种已经成为育种工
作中行之有效的方法。杨树作为林木基因工程的模
式树种,其遗传转化研究,特别在抗虫转基因方面已
经取得突破性进展, 获得了大量抗虫转基因植
株[ 2~ 10] ,其中我国抗虫转基因欧洲黑杨 ( P . nigra
L. )和双抗虫转基因 741杨已于 2002年获得国家林
业局基因安全委员会审定批准商品化生产[ 11] ; 上述
均为获得抗叶部害虫转基因杨树的研究报道, 迄今
为止,国内外尚无成功获得转抗蛀干害虫基因杨树
的报道。
害虫对转单一 Bt 杀虫基因的单价抗虫植物产
生抗性的潜在危险已普遍引起了关注。因此, 人们
已经尝试联合使用 Bt 毒蛋白基因和其它类型杀虫
机理不同的抗虫基因, 如各种蛋白酶抑制剂基因
( CPTI、OC) ,以防止或延迟害虫产生耐受性,同时也
可以扩大转基因植物的抗虫谱。范贤林等[ 12]研究
表明:转双抗虫基因烟草( Nicotiana tabacum L. )对幼
虫死亡率、存活虫体质量、化蛹率和化蛹时间等生长
发育的影响, 均显著高于转单基因烟草; 苏宁等[ 13]
研究也表明,转双价抗虫基因( Btcry1Ac、OC )烟草植
株比转单一抗虫基因植株具有更强的杀虫活性。
本研究采用农杆菌介导法, 将两种杀虫机理不
同基因( BtCry3A 和 OCI ) 导入银腺杂种杨基因组
中,其中 BtCry3A 基因对杨树天牛所隶属的鞘翅目
具有高度专一的抗性[ 14] ,水稻( Oryza sative L. )巯基
蛋白酶抑制剂( OCI )属巯基类蛋白酶抑制剂, 对鞘
翅目昆虫有较强的抗虫性[ 15] ,以期通过两种抗虫基
因的抗性互补和协同增效作用, 提高转基因杨树的
抗蛀干害虫抗性, 为进一步选育抗蛀干害虫转基因
杨树新品种奠定基础。
1 材料与方法
11 植物材料
以银腺杂种杨( 84K 杨) ( Populus alba L. P .
glandulosa Dode cv. !84 K∀ )的无菌苗为材料,取其完
全展开的叶片作为遗传转化的外植体。
12 农杆菌及植物表达载体质粒
农杆菌为 Agrobacterium tumefaciens LBA4404, 其
中含有植物表达载体质粒 pBC3O1(图 1)。
在含有 50 mg#L - l卡那霉素、25 mg#L- l利福平、
50 mg#L- l链霉素的 YEP固体培养基上, 划线培养含
有 BtCry3A 基因和 OCI 基因的农杆菌 LBA4404, 挑
取单菌落接种于含有相同抗生素的 YEP 液体培养
基中,在 26 ∃ 、200 r#min- 1培养 12~ 14 h, 5 000 r#
min- 1离心 10 min收集菌体,用 MS液体培养基将其
稀释到 OD600nm= 04~ 06,备用。
图 1 植物表达载体 pBC3O1 的结构示意图
13 农杆菌介导的杨树叶片遗传转化和植株再生
转化方法主要参照 Confalonieri等[ 16]的方法, 并
作了适当的修改。将 05~ 10 cm2的叶盘浸入转化
菌液中,轻微震荡,处理 30 min, 取出叶盘, 在无菌滤
纸上吸干, 接种到MS+ 10 mg#L- 1 6BA + 005 mg
#L- 1 NAA的分化培养基上, 27 ∃ 、黑暗条件下共培
养2 d后, 将共培养后的叶盘用含有 300 mg#L- 1头
孢霉素的无菌水冲洗后, 在无菌滤纸上吸干,转移到
附加卡那霉素 60mg#L- 1、头孢霉素 300 mg#L- 1的选
择分化培养基上筛选, 每 10 d 左右更换一次培养
基,直至长出不定芽。切取再生的卡那霉素抗性芽
( 10~ 15 cm) , 转入附加卡那霉素 50 mg#L- 1的
1/ 2MS + 002 mg#L - 1 NAA + 002 mg#L- 1 IBA 选
择生根培养基中诱导生根,进一步培养成为完整的
小植株,并进行扩繁。植株再生及扩繁均在 27 ∃ /
21 ∃ 、2 000 lx、每日光照 16 h的培养室内培养。
14 转基因植株的 PCR检测
取无菌苗叶片, 采用 CTAB法[ 17]提取转基因杨
树植株及对照植株的基因组 DNA。抗虫基因
BtCry3A PCR 引物序列为: 5%引物为: 5%ACTGCT
GATAACAACACGGAG3%, 3% 引 物 为: 5%CAGT
GATCAGTGTACTCTTGCG3%。PCR产物大小约为 06
kb。阳性对照的模板为含有双价抗虫基因( BtCry3A
和OCI )的 pBC3O1 质粒, 阴性对照的模板为未经转
化的银腺杂种杨基因组 DNA。PCR 反应条件为: 94
∃ 预变性 5min,然后 94 ∃ , 1 min, 57 ∃ , 30 s, 72 ∃ ,
1 min, 扩增 35个循环,最后 72 ∃ 延伸 7 min。反应
产物用 12%琼脂糖凝胶电泳进行分离。
15 转基因植株的点杂交检测
取大约 10 g 植物总 DNA,热变性后,转移到尼
龙膜上,同时加上 pBC3O1 质粒 DNA( 20 ng) 为对照,
紫外交联固定膜。用 BtCry3A 基因和 OCI 基因的
365第 3期 张冰玉等: 转双价抗蛀干害虫基因杨树的获得及其抗虫性鉴定
特异引物(5%引物为:5%TCGAGCGACGGAGGGCCGGT
3%, 3%引物为: 5%GCATTTGCACTGGCATCGACA3%) ,
以质粒 pBC3O1 DNA为模板进行 PCR 扩增。电泳并
回收 BtCry3A 基因和OCI 的特异基因片段,标记为
探针, 探针的标记、杂交、洗膜及显影采用 ECL Direct
Nucleic Acid Labelling and Detection System ( Amersham
Biosciences)试剂盒, 方法参照说明书。
16 转基因植株室内虫试
对8个斑点杂交检测呈阳性的直径 2 cm 以上
的两根一干转基因株系进行了室内虫试, 室内虫试
在中国林科院森林生态与环境保护研究所完成。
161 供试虫源 供试虫为光肩星天牛, 成虫采于
野外,室内产卵孵化后幼虫在生化培养箱内( 22 ∃ ,
暗培养)用人工饲料饲养,至 2龄做为供试虫。
162 抗虫性鉴定方法 将转基因株系及对照主
干锯为 10个长约 20 cm 的小段(每株系取 2株) , 每
小段接光肩星天牛幼虫 2头, 树段两段用湿润的脱
脂棉包好后用封口膜密封以保持湿度,每 2 d调查 1
次,记录死虫数及体质量,并更换脱脂棉, 15 d 后统
计虫试结果。
163 相关数据的计算方法
死亡率= 处理虫数- 活虫数处理虫数 100%
校正死亡率= 处理死亡率- 对照死亡率
1- 对照死亡率 100%
幼虫生长抑制率= 对照增质量- 处理增质量对照增质量 100%
2 结果与分析
21 转化体的筛选和转基因植株的再生
叶盘外植体在选择分化培养基上筛选约 20~ 30
d,部分叶盘边缘长出不定芽,在不断筛选过程中, 大
部分不定芽白化死亡,少量绿色芽逐渐长大。将 07
~ 10 cm的不定芽转移到含50 mg#L- 1卡那霉素的生
根培养基中诱导生根,共获得 42株完整植株(图2)。
图 2 获得的银腺杂种杨卡那霉素抗性芽(左)及植株(右)
22 转基因植株的 PCR检测
提取转基因杨树和对照基因组 DNA, 用双价抗
虫基因中 BtCry3A 基因的 PCR特异引物, 进行 PCR
扩增。从PCR的结果来看,在所检测的 39株抗卡那
霉素植株中,有 17株扩增出约 06 kb的 DNA片段,
其大小与 pBC3O1质粒为模板的扩增片段相同,也与
抗虫基因 BtCry3A 中 2个引物之间推算出的片段大
小相符合, 而未转化对照植株则没有条带, 3 次重复
结果均一致, 由于双价抗虫基因中 BtCry3 和 OCI
紧密连锁,从而可以初步推断这些抗卡那霉素植株
的基因组中整合了双价抗虫基因(图3)。
23 PCR阳性植株的斑点杂交检测
将17个 PCR阳性株系的植物总DNA,不经过酶
切, 变性后直接点于尼龙膜上, 进行斑点杂交。为
了保证检测的可靠性,用人工合成的 BtCry3A 基因和
OCI 基因的特异引物,进行PCR 扩增。电泳并回收
图 3 部分转基因植株的 PCR 检测 ( M : 标准分子量; 1: 质粒
pBC3O1;2:未转化对照; 3~ 10:转基因植株 BOGA15; BOGA16; BO
GA17; BOGA30; BOGA31; BOGA38; BOGA39; BOGA40)
BtCry3A 基因和OCI 的特异基因片段,标记为探针,
分别与植物总DNA进行杂交。检测结果表明, 在检
测的 17个株系中,斑点杂交均呈阳性(图 4)的株系
有 13个,从而证明这些 PCR阳性株系的基因组中整
合了双价抗虫基因。
366 林 业 科 学 研 究 第 18 卷
24 转基因杨树抗虫性室内鉴定
241 转基因株系对光肩星天牛幼虫的杀虫效果
从转基因株系对光肩星天牛幼虫的杀虫效果统计
结果(表 1)可以看出, 在 8个转基因株系中, BOGA
39对光肩星天牛具较强的毒杀作用,校正死亡率达
4118 %; BOGA38的毒杀作用中等, 校正死亡率为
1176 % ;其它转基因株系的毒杀作用则不明显。
图 4 部分转基因植株分别以 BtCry3A 基因(左)和 OCI 基因(右) 为探针进行斑点杂交的检测结果( + :质粒 pBC3O 1; 1:未
转化对照; 2:H2O; 3~ 16:BOGA13、BOGA15、BOGA16、BOGA31、BOGA34、BOGA39、BOGA38、BOGA41、BOGA30、BOGA26、
BOGA4、BOGA33、BOGA36、BOGA40)
表 1 转基因株系对光肩星天牛幼虫虫试结果( 15 d)
系号 试虫数/条 试虫初质量/ g 死亡率/ % 校正死亡率/ % 平均体质量/ g 抑制率/ %
BOGA5 20 0031 29 15 0000 0036 54 7102
BOGA42 20 0033 92 20 5882 0068 69 - 9380
BOGA30 20 0025 73 20 5882 0046 55 - 1591
BOGA31 20 0035 17 15 0000 0050 49 1480
BOGA36 20 0033 01 10 - 5882 0055 41 - 2474
BOGA38 20 0032 92 25 11760 0046 52 2440
BOGA39 20 0034 23 50 41180 0038 07 7890
BOGA41 20 0035 45 15 0000 0055 76 - 1307
CK 20 0024 50 15 0000 0042 47 000
242 转基因株系对光肩星天牛幼虫生长量的影
响 室内生物测定的结果(表 1)初步表明, 转基因株
系BOGA39(图5)和 BOGA5能明显抑制光肩星天牛
幼虫的生长, 抑制率分别为 7890%和 7102%; BO
GA38和 BOGA31对幼虫生长具有一定的抑制作用,
其它转基因株系对幼虫生长抑制作用不明显。
图 5 转基因株系室内生物测定实验结果( BOGA39株
系对光肩星天牛幼虫生长的抑制)
3 讨论
采用农杆菌介导法获得了银腺杂种杨转双价抗
虫基因( BtCry3A 和 OCI )植株, 通过 PCR检测和点
杂交证实, 该基因已经整合进杨树基因组。转基因
杨树抗虫性室内测定初步表明: 转基因株系 BOGA
38、BOGA39对光肩星天牛幼虫具有一定的毒杀作
用, BOGA5、BOGA31、BOGA38和 BOGA39不同程
度的抑制了光肩星天牛幼虫的生长,其中, 转基因株
系 BOGA39对光肩星天牛幼虫的毒杀和生长抑制
作用显著,而其它转基因株系的毒杀和生长抑制作
用不明显。转基因植株不同个体间目标形状存在差
异是转基因研究中普遍存在的现象, 与转基因植物
中外源基因插入位点、基因沉默和转录后的调控等
有关[ 18]。
由于受供试天牛幼虫数量的限制以及保证试验
的可靠性,对照中最初接入的虫子较小,导致对照幼
虫的死亡率较高、生长较为缓慢,这就可能导致了虫
试结果中部分株系出现负的校正死亡率和生长抑制
率,而且表现出抗虫性的株系的校正死亡率和生长抑
制率偏低。针对以上原因,作者将对上述株系进行进
一步的室内和大田抗虫性检测, 并对外源基因的整
合、拷贝数和表达水平、抗虫稳定性等做进一步的分
析研究,以对其抗虫性作出更加科学准确的评价。
参考文献:
[ 1] 张玉平,于立增,张宝贵. 四种农药使用打孔注药防治光肩星天
牛的药效分析[ J] .天津农林科技. 2004, 178: 23~ 24
367第 3期 张冰玉等: 转双价抗蛀干害虫基因杨树的获得及其抗虫性鉴定
[ 2] Robison D J, McCown B H, Raffa K F. Responses of gypsy moth ( Lepi
doptera: Lymantridae) and forest tent caterpillar( Lepidoptera: lasiocampi
dae ) to transgenic poplar Populus spp. , containing a Bacillus thuringiensis
delta endotoxin gene[ J] . Environ Entomol, 1994, 23: 1030~ 1041
[ 3] Lepl J C, BonadBottino M, August in S, et al. Toxicity to chrysomela
tremulae ( Coleoptera: Chrysomelidae ) of transgenic poplars expressing a
cysteine proteinase inhibitor[ J] . Molecular Breeding, 1995, 1: 319~ 328
[ 4] 陈颖, 李强, 李玲,等. 抗虫转基因欧洲黑杨的Western印迹法分
析[ J] . 林业科学, 1996, 32( 3) : 274~ 276
[ 5] 饶红宇,陈英,黄敏仁,等. 杨树 NL280106转 Bt 基因植株的获得
及抗虫性[ J] . 植物资源与环境学报, 2000, 9 (2) : 1~ 5
[ 6] 李明亮,张辉,胡建军,等. 转 Bt 基因和蛋白酶抑制剂基因杨树
抗虫性的研究[ J] . 林业科学, 2000, 36( 2) : 93~ 97
[ 7] 伍宁丰,孙芹,姚斌,等.抗虫的转 Aa IT 基因杨树的获得[ J] .生
物工程学报, 2000, 16( 2) : 129~ 133
[ 8] Delledonne M, Allegro G, Belenghi B, et al . Transformat ion of white
poplar ( Populus alba L. ) with a novel Arabidopsis thaliana cysteine pro
teinase inhibitor and analysis of insect pest resistance [ J ] . Molecular
Breeding, 2001, 7: 35~ 42
[ 9] 诸葛强,王婕琛,陈英,等. 豇豆胰蛋白酶抑制剂( Cp TI) 抗虫转
基因新疆杨的获得[ J] . 分子植物育种, 2003, 1( 4) : 491~ 496
[ 10] Gnissel A, Lepl J C, M illet N, et al. High tolerance against
Chrysomela tremulae of transgenic poplar plants expressing a synthet ic
cry3Aa gene from Bacillus thuringiensis ssp tenebrionis [ J] . Molecular
Breeding, 2003, 11: 103~ 110
[ 11] 苏晓华,张冰玉, 黄秦军,等.我国林木基因工程研究进展及关
键领域[ J] . 林业科学, 2003, 39( 5) : 111~ 118
[ 12] 范贤林,石西平,赵建周, 等. 转双基因烟草对棉铃虫的杀虫活
性评价[ J] . 生物工程学报, 1999, 15( 1) : 6~ 10
[ 13] 苏宁,孙萌,杨波,等. 双价抗虫基因叶绿体共转化植株抗虫性
及其后代表型分析[ J] . 遗传, 2002, 24( 3) : 288~ 292
[ 14] 崔洪志,郭三堆. Bt 毒蛋白抗虫植物基因工程进展 [ J] . 农业生
物技术学报, 1998, 6 ( 2) : 166~ 172
[ 15] 孟昆, 苏宁, 沈桂芳.水稻巯基蛋白酶抑制剂研究进展 [ J] . 生
物技术通报, 2000, 2: 5~ 7
[ 16] Confalonieri M, Allegro G, Balestrazzi A, et al. Regeneration of Popu
lus nigra transgenic plants expressing a Kunitz proteinase inhibitor
( KTi3) gene[ J] . Mol Breeding, 1998 ( 4) : 137~ 145
[ 17] Csaikl U M, Bastian H, Brettschneider R, et al. Comparat ive analysis
of different DNA extraction protocols: A fast , universal maxiprepara
tion of high qual ity plant DNA for genetic evaluation and phylogenet ic
studies[ J] . Plant Mol, Biol Reptr 1998 ( 61) : 69~ 86
[18] 杨金水, 王光清. 转基因的失活与沉默[ J] . 生物工程进展,
1995, 15( 3) : 41~ 45
368 林 业 科 学 研 究 第 18 卷