全 文 ：林业科学研究 2007, 20( 2): 283~ 286
Forest R esearch
文章编号: 10011498( 2007) 02028304
韩国、美国和中国栗疫病菌的遗传变异分析
朴春根 1, K im Kyunghee2, Lee Sanghyun2, Lee Seungkyu2, M oon Byungju 3
( 1.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,国家林业局森林保护学重点实验室,北京 10091;
2.韩国国立山林科学院山林病虫害科,韩国 首尔 130712; 3.东亚大学,韩国 釜山 604714)
摘要: 用 RAPD方法,对来自韩国、美国和中国的 26个栗疫病菌菌株进行了遗传变异分析。使用筛选的 12个随机
引物, 共扩增了 115个 0. 19~ 3. 1 kb大小的扩增片段,其中多态性片段占 61. 7%。聚类分析结果,相似系数为 0. 92
时, 26个菌株分为两大组,一组由 21个菌株组成,包括大部分韩国菌株和美国菌株; 另一组包括部分韩国菌株和中
国菌株。表明美国菌株和大部分韩国菌株的遗传相似性很高,部分韩国菌株有较大的变异,而中国菌株则表现出了
遗传上的远缘关系。
关键词: 栗疫病;寄生隐丛赤壳; 栗树;遗传变异
中图分类号: S763 文献标识码: A
收稿日期: 20060602
基金项目: 本研究得到了韩国科学财团 (KOSEF) B rain PoolP rogram的资助
作者简介: 朴春根 ( 1963 ) ,男,朝鲜族,吉林汪清人,副研究员,主要从事林业微生物资源工作. Em ai:l cfcc@ ca.f ac. cn
Genetic Variation of Strains ofCryphonectria
parasitica from Korea, USA and China
PIAO Chungen1, K IM Kyunghee2, LEE Sang hyun2, LEE Seung kyu2, MOON Byung ju3
( 1. R esearch In stitute of Forest E cology, Environm en t and Protection, CAF, K ey Laboratory of Forest Protection of State Forestry
Adm inistrat ion, Bei jing 100091, Ch ina; 2. D epartm ent o fForest Diseases and Pests, Korea Forest Research Ins titu te, Seou l 130712, Korea;
3. Facu lty ofNatural Resou rces and Life Science, DongA University, Pusan 604714, Korea)
Abstract: Genetic variation of 26 stra ins o fC ryphonectria parasitica from Korea, USA and Ch ina w as investigated
using random amplified po lymorph ic DNA (RAPD) of genom ic DNA. 115RAPD bandsw ere amplified by po lymer
ase cha in react ion w ith 12 random primers, and 61. 7% o f wh ich w ere polymorphic, the size of amp lified RAPD
bands ranged from 0. 19 to 3. 1 kb. The lineage of 26 strains based on cluster analysis of RAPD bands, could be
classified as 1 b ig g roup and the big group inc luded 17 stra ins o fKo rea and 4 strains ofUSA. From th is resu l,t it
w as show ed thatmost stra ins ofKoreaw ere sim ilar to each other, and also sim ilar to strains o fUSA, and the genetic
re lationsh ip w ith stra in o f China w as very low.
Key words: chestnut bligh;t C ryphonectria parasitica; Castanea spp. ; genetic variation
栗疫病菌 (寄生隐丛赤壳 C ryphonectria parasitica
(M urr. ) Barr)是危害栗树 ( Castanea spp. )的主要病
原菌之一。自 1904年在美国首次发现后,曾给欧美
的栗树带来了毁灭性的灾害。在亚洲, 1913, 1925年
和 1916年分别在中国,日本和韩国首次发表了有关
该病的记录。在亚洲虽然栗疫病普遍发生,但并不造
成象欧美那样严重危害,普遍认为亚洲的栗树品种抗
病性较强。但是, 1999年的调查表明,在韩国的主要
板栗生产区中, 栗疫病的发病率为 66. 7%, 其中栗疫
病菌的分离率为 53. 0% ,庆尚南道地区的发病尤为严
重 [ 1]。在欧洲首次发现栗疫病菌的弱致病力现象后,
林 业 科 学 研 究 第 20卷
作为生物防治的可能途径,做了很多相关研究 [ 2]。栗
疫病菌弱致病力菌株的细胞质中存在有 dsRNA, 利用
含有 dsRNA的弱致病力菌株进行的生物防治同菌株
的细胞融合系有密切关系。较单一的细胞融合系是
在欧洲部分地区成功进行生物防治的关键因素 [ 3]。
用于栗疫病菌遗传变异分析的探针有 dsRNA、分散中
度重复序列、线粒体 DNA等 [ 4]。RAPD方法由于简便
的实验方法和较多的多态性扩增产物等特点,广泛应
用于包括栗疫病菌在内的病原菌的遗传、进化、分类、
连锁分析、基因图谱等研究。 SSRs( S imp lesequence
repeats)、SR ILS UniPrimer等单引物的开发与利用,使
RAPD方法更加多样化。本文利用 RAPD遗传标记,
对包括弱致病力菌株在内的韩国、美国和中国的栗疫
病菌菌株进行了遗传变异分析,这对栗疫病的生物防
治研究将提供基础信息。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株
用于本实验的菌株为保存在韩国国立山林科学
院树木病理研究室的韩国菌株 21个 (其中 1个为弱
致病力菌株 )、美国菌株 4个 (其中 2个为弱致病力
菌株 )和中国菌株 1个,共 26个 (表 1,图 1)。将供
试菌株在尼龙滤膜的 PDA培养基上, 24 下培养
15 d,刮取菌丝,风干, - 80 保存,待用。
表 1 栗疫病菌供试菌株及其来源
菌株号 来源
FR IC rP1 韩国江原道, K oseongC ounty
FR IC rP2 韩国京畿道, Suw onC ity
FR IC rP3 韩国京畿道, An seongCoun ty
FR IC rP4 韩国京畿道, Y icheonC ity
FR IC rP5 韩国庆尚南道, SancheongC ounty
FR IC rP6 韩国庆尚南道, Jin juC ity,
FR IC rP7 韩国庆尚北道, K yungjuC ity
FR IC rP8 韩国庆尚北道, SangjuC ity
FR IC rP9 韩国庆尚北道, CheongdoC ity
FR IC rP10 韩国全罗南道, KwangyangC ity
FR IC rP11 韩国全罗南道, Ku rueC oun ty
FR IC rP12 韩国全罗北道, JangsuCounty
FR IC rP13 韩国全罗北道, Y im silCoun ty
FR IC rP14 韩国济州道, S eogu ipoC ity
FR IC rP15 韩国济州道, S eogu ipoC ity
FR IC rP16 韩国济州道, N am ChejuCoun ty
FR IC rP17 韩国忠清南道, K ongjuC ity
FR IC rP18 韩国忠清南道, BuyeoC oun ty
FR IC rP19 韩国忠清北道, Ku esanC ounty
FR IC rP20 韩国忠清北道, Cheongw onC ounty
FR IC rP21 中国北京市怀柔县
FR IC rP22 美国 (原菌株号: ep1552)
FR IC rP23 美国 (原菌株号: sb2)
FR IC rP24 美国 (原菌株号: uep1;弱致病性 )
FR IC rP25 美国 (原菌株号: CP30;弱致病性 )
FR IC rP26 韩国庆尚南道, H adongcoun ty(弱致病性 )
图 1 韩国栗疫病菌供试菌株的采集地 (示意图 )
1. 2 DNA的提取
采用修改的 Lee& Tayler方法 [ 5 ] , 将沉淀 DNA
用 TE溶解和 RNase A处理, 最后用无菌水定量,
- 20 下保存。
1. 3 扩增反应
本实验采用了美国 Operon公司的随机引物盒
和 PE9600扩增仪 ( PERK IN ELMER, GeneAmpTM
PCR System 9600)。 20 L反应液包括 20 ng模板
DNA、15 ng随机引物、1 unit Taq DNA 聚合酶
( TAKARA )和 0. 2 mmo l! L- 1 dNTP。扩增程序为,
最初 95 变性 5 m in; 然后以 94 1 m in、36 1
m in和 73 2 m in为 1个循环,共进行 40个循环;
最后 73 延长 5m in。
电泳和数据分析: 用 3% Nusive 3∀1 A garose
( FMC B ioproducts, USA)和 TBE缓冲液, 120 V电泳
4 h,用溴化乙锭染色 40 m in和 1 mmo l! L- 1M gSO4
脱色 1 h,紫外照相, 并用 NTSYSpc( V ersion 1. 80)
的 UPGMA软件进行聚类分析。
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第 2期 朴春根等:韩国、美国和中国栗疫病菌的遗传变异分析
2 结果与分析
基于扩增反应的多态性和重复性, 本实验筛选
并采用了 12个随机引物 (表 2)。利用 12个随机引
物,在 26个供试菌株中共扩增了 115个扩增片段,
其分子量大小为 0. 19~ 3. 1 kb, 多态性扩增片段占
61. 7%, 平均每个随机引物获得了 5. 9个多态性扩
增片段 (图 2)。W ronsk i等用随机引物 OPEG对奥
地利的栗疫病菌进行的 RAPD遗传变异分析表明,
其平均每个随机引物能获得 8个多态性扩增片
段 [ 4] ,说明因筛选的引物不同而所获取的信息量也
不同。本实验中,尚未发现能区别致病力菌株和弱
致病力菌株的特异性 RAPD扩增片段。
表 2 用于 RAPD分析的引物及其序列
引物号 碱基序列 ( 5#∃ 3#) DNA片段数*
OPA03
OPA08
OPA11
OPA13
OPA16
OPA18
OPA19
OPE04
OPE07
OPE16
OPE18
OPE20
(合计 )
AGT CAG CCA C
GTG ACG TAG G
CAA TCG CCG T
CAG CAC CCA C
AGC CAG CGA A
AGG TGA CCG T
CAA ACG TCG G
GTG ACA TGC C
AGA TGC AGC C
GGT GAC TGT G
GGA CTG CAG A
AAC GGT GAC C
8 ( 3)
12 ( 5)
12 ( 11)
14 ( 8)
13 ( 7)
9 ( 9)
7 ( 6)
8 ( 4)
9 ( 4)
7 ( 3)
8 ( 7)
9 ( 4)
115 ( 71)
注: * 示多态性片段数;均为 Operon T ch. Inc.
图 2 用引物 OPA03和 OPA08扩增的栗疫病菌 RAPD图谱, Maker为 200 bp梯度的分子量标记
用 12个随机引物扩增的 71个多态性扩增片段
中,为了避免因片段的模糊而造成的误差, 从中只选
择比较清楚的 59扩增片段进行了菌株间的聚类分
析 (图 3 )。结果表明, 在树状分类中, 相似系数为
0. 92时, 由 17个韩国菌株和 4个美国菌株组成一个
大组,而其他菌株则表现出了较大的变异, 其中中国
菌株的变异最大。这个大组又分成两个小组, 一个
小组包括分离自韩国江原道 ( FR ICrP1)、京畿道
( FR IC rP2, 3)、庆尚南道 ( FR ICrP5)、庆尚北道 ( FR I
C rP7)、全 罗 南道 ( FR IC rP10, 11 )、全 罗 北 道
( FR IC rP12)、济州岛 ( FR ICrP15, 16 )和忠清南道
( FR IC rP17)的菌株,而另一个小组则包括分离自庆
尚北道 ( FRIC rP8, 9)、全罗北道 ( FR ICrP13)、忠清南
道 ( FRIC rP18)和忠清北道 ( FR IC rP20)等 4个韩国
菌株和 4个美国菌株。分离自京畿道、庆尚南道、济
州岛和忠清北道的 4个韩国菌株表现出了较大的变
异,而中国菌株与韩国以及美国菌株间的亲缘关系
则较远。大部分韩国菌株间的亲缘关系较近且尚看
不出地域性特征,并且与美国菌株间的亲缘关系也
较近。但韩国菌株中也存在有部分变异较大的菌
株,而中国菌株与韩国和美国菌株间的亲缘关系则
较远。
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林 业 科 学 研 究 第 20卷
图 3 利用 12个随机引物扩增的 RAPD片段和 UPGMA
的栗疫病菌 26个菌株的 RAPD树状图 (NTSYSp c Ver. 1. 80 )
3 讨论
对 35个奥地利栗疫病菌的 RAPD遗传标记分
析表明,其地域性特征很小 [ 4] , 同样, 韩国国内的栗
疫病菌菌株也没有地域性遗传特征。韩国菌株与美
国菌株有很近的亲缘关系, 而中国菌株与韩国、美国
菌株间的遗传亲缘关系则很小。对来自中国、日本、
北美和欧洲的栗疫病菌菌株的 RFLP分析表明, 北
美和欧洲菌株间的亲缘关系最近, 这两者与日本菌
株间的亲缘关系也较近, 而他们与中国菌株间的
亲缘关系则较远,认为北美的栗疫病菌是由日本传入
的 [ 6]。结合本实验的结果, 推测北美、欧洲、日本和
韩国的栗疫病菌菌株可能存在相似的遗传背景, 而
中国菌株在遗传上可能是较独立的。在韩国菌株中
也有变异较大的菌株, 因此不排除从中国等地传入
的可能性。今后, 应对欧美亚等世界主要板栗栽培
区的栗疫病菌菌株进行系统的遗传变异研究, 将有
助于弱致病力菌株的筛选和引进及其细胞融合系等
生物防治的相关研究。
参考文献:
[ 1 ] K im K H, Lee S H, Lee SM, et a l. 1999年度林业研究事业报告
书 (山林环境 51 ) [R ].韩国林业研究院, 1999: 384~ 393
[ 2 ] Anagnostakis S L. C rphonectria parasit ica carse of chestnu t b ligh t
[ J] . Advances in Plant Patho logy, 1988, 6: 123~ 136
[ 3 ] H ein igerU, R igl ing D. B iological con trol of chestnu tb light in Eu rope
[ J] . Annu Rev Phytopatho,l 1994, 32: 581~ 599
[ 4 ] W ron sk iR, Kudera U, W ih elm E. C haracterizat ion of Cryphon ectria
pa rasitica strains by random am p lijied polym orph ic DNA ( RAPD )
techn iqu e and convent ion alm ethods [ J ]. Eu r J For Path, 1997, 27
( 2 ): 95~ 103
[ 5 ] Lee S B, Tayler JW. Isolation of DNA from fungalmycel ia and s in
gle spores[A ] . in: A Gu id e to M ethods and App lication[ M ] . APS
Press , S t. Pau lMN USA , 1990: 282~ 287
[ 6 ] M ilgroom M G, W ang K, ZhouY, et al. Intercont inen tal popu lation
stru cture of the ch estnut bl igh t fungus. Cryph onectria pa rasitica [ J] .
M ycolog ia, 1996, 88 ( 2) : 179~ 190
286