全 文 ：收稿日期: 2003
12
08
基金项目: 国家科技攻关计划( 2001BA506b04
01)
作者简介: 李发根( 1977
) ,男,江西萍乡人,硕士.
注 :第一作者和第二作者对本文具有相同的贡献.
林业科学研究  2004, 17( 6) : 824~ 828
Forest Research
  文章编号: 1001
1498( 2004) 06
0824
05
棕榈藤基因组DNA提取及RAPD反应条件探索
李发根, 杨  华, 尹光天, 许煌灿 , 甘四明
(中国林业科学研究院热带林业研究所,广东 广州  510520)
关键词: 棕榈藤;基因组 DNA提取; CTAB; RAPD
中图分类号: S79291    文献标识码: A
棕榈藤( rattan)是棕榈科( Palmae Juss)藤本植物,属棕榈科省藤亚科( Calamoideae)省藤族
( Calameae)植物,包括 13属 600余种,主要分布于热带地区[ 1]。棕榈藤是热带森林宝库中的多
用途植物资源, 具有很高的经济价值和开发前景,是仅次于木材和竹材的重要林产品, 其中黄
藤( Daemonorops margaritae (Hance) Beccari)和单叶省藤( Calamus simplicifolius Wei)是我国大面
积栽培的 2个重要藤种。目前, 棕榈藤的人工林用种主要采自前期建立的人工林,而系统的良
种选育仍未开展,这大大制约了棕榈藤人工林和藤产业的发展。随着以 PCR为基础的分子标
记技术的迅速发展, 采用基于基因组 DNA分析的分子标记来进行育种是当前国际植物遗传育
种研究的热点[ 2]。棕榈藤分子生物学研究的开展,将为棕榈藤良种的生产与推广以及藤产业
的长期发展提供重要的技术支撑,这对缩短棕榈藤的育种周期、提高育种效率、加速育种进程
均有非常重要的作用。
成功地从组织细胞中提取高质量 DNA, 是进行分子生物学研究的前提。自从Marmur[ 3]在
1961年建立用十二烷基磺酸纳( SDS)和氯仿从细胞中分离提取 DNA样品的经典方法以来,研
究者一直在探索能制备高纯度和高完整性的 DNA 制品的最佳方案。Rogers 和 Bendich [4] 用
CTAB法从植物材料中提取 DNA, 但产量较低。Collins和 Symons[ 5] 在 1992年从新鲜叶片中成
功提取出核 DNA,但步骤比较繁琐,产量也不高。目前,植物组织 DNA的提取方法主要有 SDS
法[ 3]、高盐低 pH 法[ 6, 7] 、CTAB法 [ 8, 9]和氯化苄法 [10]等。虽然植物 DNA提取方法因材料不同而
各异,但在材料的选择上,总的一个原则是尽量使用植物的幼嫩部位。本实验以单叶省藤和黄
藤为材料,首次进行了棕榈藤基因组 DNA的提取和 RAPD( Random Amplif ied Polymorphic DNA,
随机扩增多态性 DNA)实验体系优化的研究,建立了重复性强、稳定性好的反应体系和扩增程
序,这为棕榈藤分子生物学研究提供了技术支持。
1  材料和方法
11  实验材料
于2003年8月下旬, 从广东省肇庆市金鸡坑林场(地处112 16!~ 112 24! E, 23 05!~
23 09! N,海拔 250~ 350 m)的黄藤和单叶省藤人工林中采集幼嫩叶片,除去灰尘等杂物和水
分,用塑料袋封装,用冰袋保鲜,带回实验室后保存于- 70 ∀ 备用。2藤种各取 20株。
12  基因组 DNA提取方法
121  改良 CTAB法  用改进后的 CTAB法[ 11] 从棕榈藤的新鲜叶片中提取总 DNA, 具体步骤
如下: 在 5 mL离心管加入含 2%

巯基乙醇和5% PVP
40的 CTAB提取液 2 mL, 65 ∀ 预热 10
min。将经液氮冷冻的 1 g 叶片研磨成粉末,放入预热的提取液中, 65 ∀ 保温 45 min。加入 2
mL 氯仿
异戊醇( 24
1) , 10 000 r#min- 1离心 10 min,移出上清液;重复1次本步骤。向上清液中
加入 2倍体积的无水乙醇和 1
10体积的 3 mol#L- 1 NaAc,温和混匀后于- 20 ∀ 放置 2 h以上,
然后 10 000 r#min- 1离心 10 min,弃上清液,收集沉淀。所得沉淀用500 L 无水乙醇洗涤2次,
沉淀自然风干后溶于 100 L 1 ∃ TE中(保存液) , - 20 ∀ 保存备用。DNA浓度测定通过与 100
bp DNA Ladder 的 500 bp片段亮度对比进行。
122  CTAB法  具体参照文献[ 8, 9]。
123  SDS法  具体参照文献[ 3]。
13  PCR扩增方案的初步优化
RAPD扩增体系的优化以尾叶桉( Eucalyptus urophylla S. T. Blake) PCR方案为基础[ 12] ,以黄
藤和单叶省藤各 1个样品为材料,利用随机引物 S435进行(引物序列见表 1)。本研究的随机
引物均购自Sangon公司。优化因子包括不同模板DNA用量、是否加矿物油覆盖和不同反应体
积(表 2)。15 L 反应体系的组成为: 10 ∃ buffer(w
mg) 15 L( 100 mmol#L- 1 Tris
HCl( pH 90) ;
100 mmol#L- 1 KCl; 05% NP
40; 80 mmol#L- 1 ( NH4 ) 2SO4 ; 20 mmol#L- 1 MgSO4 ) , 02 mmol#L- 1
dNTPs, 02 mol#L- 1引物, 1单位Taq酶, DNA模板 20、40 或 60 ng。25 L 反应体系除 DNA模
板用量同 15 L 反应体系外, 其余成分均按比例增加。
表 1 本研究所用的 RAPD随机引物及其碱基序列
引物 碱基序列( 5!% 3!) 引物 碱基序列( 5!% 3! ) 引物 碱基序列( 5!% 3!)
S21 CAGGCCCTTC S435 CAGCGACTGT S472 AAGGGCGAGT
S83 GAGCCCTCCA S436 AAGCGACCTG S473 GGAGTGCCTC
S128 GGGATATCGG S437 CATTGGGGAG S474 CCAGCCGAAC
S130 GGAAGCTTGG S438 GGTGAGGTCA S475 GGAAGCCAAC
S160 AACGGTGACC S439 GTCCGTACTG S476 CCAAGCTGCC
S431 TCGCCGCAAA S440 GGTGCTCCGT S477 TGACCCGCCT
S432 CACAGACACC S469 GTGGTCCGCA S478 GGCTTGGCCT
S433 AGCGTCACTC S470 TCCCGCCTAC
S434 TCGTGCGGGT S471 AACGCGTCGG
  扩增程序的优化以 2藤种各 1个样品为材料,利用 S21、S83、S128、S130和 S160共 5 个随
机引物进行(引物序列见表 1)。基本扩增程序为: 94 ∀ 预变性 1 min; 再 40个循环: 94 ∀ 变性
30 s, 41 ∀ 退火 30 s和 72 ∀ 延伸 15 min;最后 72 ∀ 延伸 7 min。扩增程序的优化主要是针对
退火温度, 不同退火温度的设置见表 2。PCR扩增仪为 GeneAmp PCR System 2700 (Applied Bio

system Co)。扩增产物用含有溴化乙锭( 05 g#mL- 1 )的12%琼脂糖凝胶在05 ∃TBE缓冲液
中电泳分离检测,电泳结果通过凝胶成像分析系统(法国VL Photoprint 215SD)记录。
825第 6 期 李发根等: 棕榈藤基因组 DNA 提取及 RAPD反应条件探索
优化程序的检验利用 2藤种各 1个样品为材料, 用于单叶省藤的随机引物为 S469、S470、
S471、S472、S473、S474、S475、S476、S477和 S478共 10个,用于黄藤的引物为 S431、S432、S433、
S434、S435、S437、S438、S439和S440共 10个(引物序列见表 1)。
表 2 棕榈藤 RAPD扩增程序的优化设计
步骤 优化因子 梯度设置 结果
1 模板 DNA 用量
ng 20, 40, 60 均可,确定 12 ng
1 矿物油(有
无) 有,无 有
1 反应体积
L 15, 25 均可,确定 15 L
2 退火温度
∀ 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 44和 46均可,确定 45 ∀
2  结果与讨论
21  DNA提取
本研究对比了 3种方法提取棕榈藤基因组 DNA的效果。其中改良 CTAB法是在 CTAB法
基础上加以改进后形成的, 主要是在缓冲液中加入 PVP 和

巯基乙醇。从试验结果可以看出
(图 1) , 3种方法均能提取出黄藤和单叶省藤的基因组 DNA, 但改良 CTAB法能有效地去除酚
类化合物、多糖和蛋白质,使提取的 DNA浓度最高,电泳前沿杂质也最少。浓度测定表明,利
用改良CTAB法,从 1 g叶片中提取的 DNA量为22 g,按每次 PCR的 DNA用量 12 ng计,可以
满足 1 800次PCR反应所需。因此,改良 CTAB法提取的棕榈藤基因组 DNA 在质量和数量上
均能满足大量 PCR扩增的需要,可以作为优先选用的方法。
22  RAPD扩增反应的初步优化
通过对RAPD反应体系中各因子的对比研究发现(图 2) ,有矿物油覆盖时, 15、25 L 反应
体系在不同的 DNA模板用量下扩增结果相似,表明 DNA 模板用量可以在较大范围内波动。
因此,为了节约试剂和DNA模板,一般可选用 15 L 反应体系和 12 ng DNA模板用量(按照 25
826 林  业  科  学  研  究 第17卷
L 体系中 20 ng DNA模板的比例)。一般认为, RAPD反应的最佳模板浓度取决于所研究的类
群与模板纯度, 高浓度和低浓度都不利于 PCR扩增,一般 5~ 500 ng( 100倍)范围的 DNA 能提
供好的结果 [13]。本研究所总结的 DNA模板用量接近一般范围的下限, 能较大程度地节约
DNA模板。虽然有无矿物油覆盖对 25 L 反应体系影响不大, 两种情况下扩增产物的亮度相
似,但对15 L 反应体系影响较大,没有矿物油覆盖时扩增产物明显减少,表明选用15 L 体系
时(尤其 DNA模板量较少时) ,一定要在 PCR管中加入矿物油覆盖反应体系。
通过对 RAPD反应的退火温度的调节,发现棕榈藤的 RAPD反应在 44、46 ∀ 最好(图 3) ,
在44、46 ∀ 时,从图中可看到较大片断 ( 1 500 bp)的扩增比较清晰。最后, 确定退火温度为
45 ∀ 。
利用优化的反应体系和扩增程序, 对2藤种各 1个样品和 7个引物的扩增表明,多数条带
清晰,扩增背景比较干净,扩增片断的大小范围也较大,因此,优化的反应体系和扩增程序能有
效地进行棕榈藤的 RAPD分析(图 4)。虽然, RAPD的重复性较受争议 [14, 15] , 但许多实验表明,
只要严格控制反应体系各组份和扩增条件, 可以得到较好的可重复的实验结果[ 16]。加上
RAPD快速、简便、不需基因组背景知识和不需同位素操作等优点,并且需要时 RAPD标记也可
转化为在不同实验室间可重复的 SCAR 标记, 因此作者仍把 RAPD作为棕榈藤分子生物学研
究的重要标记方法之一。
优化的棕榈藤 RAPD扩增体系为 15 L 体系: 10 ∃ buffer ( w
mg) 15 L( 100 mmol#L- 1Tris

HCl( pH 90) ; 100 mmol#L- 1KCl; 05% NP
40; 80 mmol#L- 1 ( NH4 ) SO4 ; 20 mmol#L- 1 MgSO4 ) , 02
mmol#L- 1 dNTPs, 02 mol#L- 1引物, 1单位 Taq酶, 12 ng的模板 DNA。扩增程序为: 94 ∀ 预变
性1 min;再 40个循环: 94 ∀ 30 s, 45 ∀ 30 s和 72 ∀ 2 min,最后 72 ∀ 延伸 7 min。
参考文献:
[ 1] 江泽慧,萧江华,许煌灿.世界竹藤[M ] .沈阳:沈阳科技出版社, 2002. 509~ 612
[ 2] Chowdari K V,Venkatachalam S R,Davierwala A P, et al.Hybrid performance and genet ic distance as revealed by the ( GATA) 4 micro

827第 6 期 李发根等: 棕榈藤基因组 DNA 提取及 RAPD反应条件探索
satellit e and RAPD markers in pearl millet[ J] . Theor Appl Genet, 1998, 97: 163~ 169
[ 3] Marmur J. Determinat ion of DNA by formamide[ J] . Biochimica Biophysica Acta, 1961, 51: 32 ~ 36
[ 4] Rogers S O, Bendich A J.Extraction of DNA from plant tissues[ J] . Plant Mol Biol Manual, 1988,A6: 1~ 10
[ 5] Collins G G,Symons R H. Extract ion of nuclear DNA from grape vine leaves by a modified procedure[ J] . Plant Mol Biol Rept, 1992, 10:
233~ 235
[ 6] Pierre G,Haurence M D. Isolation of plant DNA: a fast, inexpensive and reliable method[ J] . Plant Mol Bio Rep, 1992, 10: 60~ 65
[ 7] 邹喻苹,汪小全,雷一丁,等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定[ J] .植物学报, 1994, 36( 7) : 528~ 533
[ 8] Doyle J J, Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quant it ies of fresh leaf tissue[ J] . Phytochem Bull, 1987, 19( 4) : 11~ 15
[ 9] Doyle J J, Doyle D J. Isolation of plant DNA from fresh t issue[ J] . Focus, 1990, 12: 13~ 15
[ 10] 时向阳,魏江春,姜玉梅,等.提取地衣真菌总 DNA的简便方法[ J] .北京林业大学学报, 1997, 19( 4) : 45~ 50
[ 11] Doyle J.DNA protocols for plants
CTAB total DNA isolat ion[A] . In:Hewitt G M, Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy[M] .
Berlin: Springer, 1991. 283~ 293
[ 12] 甘四明,施季森,白嘉雨,等.尾叶桉和细叶桉无性系 RAPD指纹图谱构建研究[ J] .南京林业大学学报, 1999, 23( 1) : 11~
14
[ 13] 邹喻苹,葛颂,王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[ M] .北京:科学出版社, 2001
[ 14] Park Y H, Kohel R J. Effect of concentration of MgCl2 on random
amplified DNA polymorphisms[ J] . Bio
Technology, 1994, 16: 652~
656
[ 15] Will iams J G K,Hanafey M K, Rafalski J A.Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers[ J] .Methods Enzymol ,
1993, 218: 704~ 740
[ 16] Skov E. Are RAPD
markers reproducible between different laboratories? [ J] . Silvae Genet ica, 1998, 47: 282~ 287
Genomic DNA Extraction and RAPD Protocols for Rattan
LI Fa
gen , YANG Hua , YIN Guang
tian , XUHuang
Can , GAN Si
ming
(Research Institute of Tropical Forestry,CAF, Guangzhou 510520, Guangdong, China)
Abstract: Genomic DNA was successfully extracted from leaf tissues of two rattan species, Calamus simplif icif o

lius and Daemonorops margaritae , using a modified CTAB method. This method could remove phenolic com

pounds, polysaccharides and proteins, and the quality and quantity of DNA extracted were reliably characterized.
In addition, the react ion composition and amplification program for RAPD analysis were developed with GeneAmp
PCR System 2700 ( Applied Biosystem Co. ) . This study provided a technological basis for future molecular stud

ies in rattan and the related species.
Key words: rattan; genomic DNA extraction; CTAB; RAPD
828 林  业  科  学  研  究 第17卷