全 文 ：林业科学研究摇 圆园员猿袁圆远渊源冤院源员源 源员怨云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员猿冤园源鄄园源员源鄄园远
蓝花楹 允葬悦月云员 转录因子片段的序列分析及
耐寒性功能验证
周摇 静员袁圆袁 张摇 炜猿袁 李大明猿袁 张锡九猿袁 陈其兵员鄢
渊员郾 四川农业大学风景园林学院袁四川 成都摇 远员员员猿园曰 圆郾 四川师范大学生命科学学院袁四川 成都摇 远员园园远远曰
猿郾 四川省林业科学研究院袁四川 成都摇 远员园园愿员冤
收稿日期院 圆园员圆鄄员员鄄圆愿
基金项目院 四川省国际合作与交流项目渊圆园员圆匀匀园园猿怨冤
作者简介院 周摇 静袁博士研究生袁助理研究员袁主要从事植物分子生物学研究援 耘皂葬蚤造 院 员苑圆远缘员员苑岳 择择援 糟燥皂援
鄢 责任作者院陈其兵袁博士生导师袁教授袁主要从事园林植物遗传育种研究援
摘要院悦月云 类转录因子是调控植物冷害应答反应的关键因子遥 从蓝花楹中克隆到一个 源缘苑 遭责 悦月云 类基因片段袁序
列分析表明其编码 员源圆 氨基酸的片段袁并与多个物种 悦月云员 基因序列高度同源袁且具有 悦月云 家族的 粤孕圆 核心结构
域袁因此将其命名为 允葬悦月云员遥 原核表达的结果显示此基因片段编码 员远 噪阅葬 的蛋白袁表达分析结果显示 允葬悦月云员 于
低温条件下在蓝花楹根尧茎尧叶中有差异性转录遥 杂燥怎贼澡藻则灶 杂交结果揭示 允葬悦月云员 在蓝花楹基因组中存在至少 圆 个
拷贝遥 通过脓杆菌介导方法将 允葬悦月云员 异源转录到拟南芥中袁荧光共聚焦显微照相结果显示其编码的蛋白质定位
于细胞核袁冷处理实验发现转基因拟南芥植株的耐冷性得到了显著提高袁表明此新片段具有 悦月云 类植物耐冷因子
的典型功能遥
关键词院蓝花楹曰悦月云曰转录因子曰诱导型表达曰耐寒性功能
中图分类号院杂苑员愿援 源远 文献标识码院粤
杂藻择怎藻灶糟藻 粤灶葬造赠泽蚤泽 葬灶凿 悦澡蚤造造蚤灶早 砸藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 葬遭燥怎贼 葬 晕藻憎 悦月云鄄造蚤噪藻
栽则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 云葬糟贼燥则 云则葬早皂藻灶贼 枣则燥皂 允葬糟葬则葬灶凿葬 葬糟怎贼蚤枣燥造蚤葬
在匀韵哉 允蚤灶早员袁圆袁 在匀粤晕郧 宰藻蚤猿袁 蕴陨 阅葬鄄皂蚤灶早猿袁 在匀粤晕郧 载蚤鄄躁蚤怎猿袁 悦匀耘晕 匝蚤鄄遭蚤灶早员
渊员郾 悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴葬灶凿泽糟葬责藻 粤则糟澡蚤贼藻糟贼怎则藻袁 杂蚤糟澡怎葬灶 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 悦澡藻灶早凿怎摇 远员员员猿园袁 杂蚤糟澡怎葬灶袁 悦澡蚤灶葬曰 圆郾 悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻袁
杂蚤糟澡怎葬灶 晕燥则皂葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 悦澡藻灶早凿怎摇 远员园园远远袁 杂蚤糟澡怎葬灶袁 悦澡蚤灶葬曰 猿郾 杂蚤糟澡怎葬灶 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 悦澡藻灶早凿怎摇 远员园园愿员袁 杂蚤糟澡怎葬灶袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 悦月云泽 渊悦砸栽 辕 阅砸耘鄄遭蚤灶凿蚤灶早 枣葬糟贼燥则冤 葬则藻 噪藻赠 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则泽 则藻早怎造葬贼蚤灶早 贼澡藻 糟澡蚤造造蚤灶早 则藻泽责燥灶泽藻 蚤灶 责造葬灶贼泽援
粤 源缘苑 遭责 悦月云鄄造蚤噪藻 枣则葬早皂藻灶贼 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 枣则燥皂 允葬糟葬则葬灶凿葬 葬糟怎贼蚤枣燥造蚤葬援 杂藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 枣则葬早皂藻灶贼
渊灶葬皂藻凿 葬泽 允葬悦月云员冤 藻灶糟燥凿藻凿 葬 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 员源圆 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽袁 葬灶凿 憎葬泽 澡蚤早澡造赠 澡燥皂燥造燥早燥怎泽 贼燥 皂葬灶赠 噪灶燥憎灶 悦月云员鄄造蚤噪藻
贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则泽 憎蚤贼澡 贼澡藻 粤孕圆 糟燥则藻 凿燥皂葬蚤灶 贼澡葬贼 遭藻造燥灶早泽 贼燥 悦月云 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠援 栽澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早
允葬悦月云员 泽藻择怎藻灶糟藻 憎葬泽 蚤灶贼则燥凿怎糟藻凿 蚤灶贼燥 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤援 杂燥凿蚤怎皂 凿燥凿藻糟赠造 泽怎造枣葬贼藻鄄责燥造赠葬糟则赠造葬皂蚤凿藻 早藻造 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽
渊杂阅杂鄄孕粤郧耘冤 葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 允葬悦月云员 憎葬泽 贼则葬灶泽造葬贼藻凿 蚤灶贼燥 葬 员远 运阅葬 责则燥贼藻蚤灶援 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 责葬贼贼藻则灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 蚤灶凿蚤鄄
糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 允葬悦月云员 糟燥怎造凿 遭藻 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 责葬贼贼藻则灶泽 葬灶凿 凿藻早则藻藻泽 遭赠 造燥憎 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 蚤灶 则燥燥贼泽袁 泽贼藻皂泽袁 葬灶凿
造藻葬增藻泽 燥枣 允援 葬糟怎贼蚤枣燥造蚤葬援 杂燥怎贼澡藻则灶 遭造燥贼 则藻增藻葬造藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 允援 葬糟怎贼蚤枣燥造蚤葬 早藻灶燥皂藻 糟燥灶贼葬蚤灶藻凿 葬贼 造藻葬泽贼 贼憎燥 糟燥责蚤藻泽 燥枣
允葬悦月云员援 耘糟贼燥责蚤糟 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 则藻增藻葬造藻凿 贼澡葬贼 允葬悦月云员 枣怎灶糟贼蚤燥灶藻凿 蚤灶 贼澡藻 灶怎糟造藻蚤袁 葬灶凿 蚤贼泽 藻曾鄄
责则藻泽泽蚤燥灶 糟燥怎造凿 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 蚤皂责则燥增藻 贼澡藻 枣则藻藻扎蚤灶早 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 粤援 贼澡葬造蚤葬灶葬援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 泽贼怎凿赠 泽怎早早藻泽贼
贼澡葬贼 贼澡藻 灶燥增藻造 允葬悦月云员 蚤泽 葬 贼赠责蚤糟葬造 悦月云鄄造蚤噪藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则袁 葬灶凿 责造葬赠泽 葬灶 蚤皂责燥则贼葬灶贼 则燥造藻 则藻泽责燥灶凿蚤灶早 贼燥 糟燥造凿
泽贼则藻泽泽 蚤灶 允援 葬糟怎贼蚤枣燥造蚤葬援
运藻赠 憎燥则凿泽院 允葬糟葬则葬灶凿葬 葬糟怎贼蚤枣燥造蚤葬曰 悦月云曰 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则曰 蚤灶凿怎糟藻凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰 糟澡蚤造造蚤灶早 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
第 源 期 周摇 静等院蓝花楹 允葬悦月云员 转录因子片段的序列分析及耐寒性功能验证
悦月云 渊悦砸栽 辕 阅砸耘鄄遭蚤灶凿蚤灶早 枣葬糟贼燥则冤 转录因子是一
类受低温特异诱导的反式作用因子袁在植物中广泛
存在袁特定条件下渊如低温冤能快速高效启动和表
达遥 该类因子可以激活下游多个耐寒基因的表达袁
从而激活植物体内的多种耐冷机制袁使细胞表现出
耐冷能力 咱员 原 猿暂 遥 自从 员怨怨苑 年 杂贼燥糟噪蚤灶早藻则 等在拟南
芥中克隆了 悦月云员 的基因以来袁许多研究已经从水
稻 咱源暂 尧黑麦草 咱缘 原 远暂 尧番茄 咱苑 原 愿暂 尧草莓 咱怨 原 员园暂 尧油菜和
烟草 咱员员 原 员圆暂 等多种植物中分离和鉴定出 悦月云转录因
子遥 悦月云 是一大类基因家族袁家族成员的核酸序列
具有 粤孕圆 结构域袁它可以与下游抗逆基因启动子区
的顺式作用元件渊即 悦砸栽 辕 阅砸耘 顺式作用元件冤 结
合袁进而诱导这些基因的表达 咱员猿暂 遥 粤孕圆 氨基酸结构
在许多植物中是保守的 咱员源 原 员缘暂 遥 来自拟南芥尧油菜尧
小麦尧黑麦和番茄的 悦月云 蛋白还含有两段保守的短
多肽序列袁 即 孕运运 辕 砸孕粤郧砸曾运云曾耘栽砸匀孕 序列和
阅杂粤宰砸 序列遥 前者位于 粤孕圆 阅晕粤 结合域的上游袁
可能与蛋白质运输相关曰阅杂粤宰砸 序列则位于 粤孕圆
结合域的下游 咱员远暂 遥 目前袁关于低温诱导 悦月云 基因
的表达过程还不是很清楚袁研究者正在探索其表达
调控机制遥 但基因工程研究已经验证了 悦月云 基因
在抗逆性方面的重要作用袁并获得了多种抗逆水平
不同程度提高的转化材料 咱员苑 原 员愿暂 遥
蓝花楹渊允葬糟葬则葬灶凿葬 葬糟怎贼蚤枣燥造蚤葬 匀怎皂遭援 藻贼 月燥灶责造援 冤袁
别名蕨树尧蓝雾树等袁属紫葳科渊月蚤早灶燥灶蚤葬糟藻葬藻冤蓝花
楹属渊 允葬糟葬则葬灶凿葬 允怎泽泽援 冤速生落叶乔木袁分布于我国
长江以南袁是重要的用材树种和优良的景观树种
咱员怨暂 遥 其幼苗对低温较敏感袁园 益 以下便会出现冻梢
现象遥 成年蓝花楹要求冬季夜间温度不低于 员缘 益袁
虽能忍受短时间的 愿 益 低温袁但其生长受到严重阻
碍遥 近年来袁我国经常遭遇冬季严寒气候袁霜雪天气
时而袭击南方地区袁蓝花楹的生长发育受到严重影
响袁进而使农林业遭受重大损失遥 为了探索蓝花楹
低温敏感性的分子机制袁本研究从蓝花楹叶片中克
隆到一个新的 悦月云 基因片段袁研究其核苷酸和氨基
酸序列特点与表达模式袁并通过在拟南芥的异源表
达袁验证了该转录因子片段具有提高植物耐冷性的
功能遥
员摇 材料与方法
员援 员摇 蓝花楹的低温处理
将 猿 月龄的蓝花楹幼苗先置于光照培养箱中进
行适应性培养袁培养条件为院白天 员远 澡 渊圆源 园园园 造曾袁圆愿
益袁远园豫湿度冤袁夜晚渊黑暗袁圆缘 益袁愿园 豫 湿度冤袁适时
浇灌 匀燥葬早造葬灶凿营养液袁保持土壤 猿园 豫 含水量遥 两
周后进行低温处理袁条件为院员圆 园园园 造曾袁源 益袁愿园豫湿
度遥 分别处理 园尧员尧猿尧缘尧愿尧员圆尧圆源 和 源愿 澡 后袁收取幼
苗的第三片真叶尧茎和根袁速冻于液氮中备用遥
员援 圆摇 悦月云 基因片段的克隆及信息学分析
使用 栽陨粤晕郧耘晕 公司 砸晕粤责则藻责 责怎则藻 孕造葬灶贼 运蚤贼
渊阅孕源猿圆冤 和 阅晕粤泽藻糟怎则藻 孕造葬灶贼 运蚤贼 渊阅孕猿圆园冤 分别提取
处理过的蓝花楹叶片组织的总 砸晕粤 和 阅晕粤遥 使用
匝怎葬灶贼 糟阅晕粤 第一链合成试剂盒渊运砸员园猿冤 将总 砸晕粤
反转录成 糟阅晕粤遥
根据拟南芥 悦月云员 基因的核心序列设计引物
允葬悦月云鄄杂渊缘鄄悦粤栽悦悦粤栽粤栽粤粤粤粤悦郧悦粤悦悦鄄猿冤和 允葬悦月云鄄
粤渊缘鄄郧粤郧栽栽郧栽悦悦郧粤粤郧粤粤粤悦悦鄄猿冤遥 分别以蓝花楹
叶片 糟阅晕粤 和 阅晕粤 为模板进行 孕悦砸 扩增袁扩增产物
经 员 豫 琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化袁纯化产物
连接到 责酝阅鄄员怨栽 渊栽葬运葬蕴葬袁 阅葬造蚤葬灶袁 悦澡蚤灶葬冤 载体后
转化大肠杆菌 栽韵孕员园 感受态细胞袁挑取阳性克隆送
陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司渊杂澡葬灶早澡葬蚤袁 悦澡蚤灶葬冤 进行双向测序遥
将测序所得序列在 郧藻灶月葬灶噪 中进行 月造葬泽贼载 比
对分析遥 使用 阅晕粤酝粤晕 缘郾 员 将核苷酸序列翻译为
氨基酸序列袁并预测其分子量曰同时将该氨基酸序列
与其他已知的 悦月云蛋白进行比对袁并搜索 粤孕圆 以及
孕运运 辕 砸孕粤郧砸曾运云曾耘栽砸匀孕尧阅杂粤宰砸 保守序列遥
员援 猿摇 允葬悦月云员 基因片段的融合表达
根据蓝花楹 悦月云 核酸序列设计引物 允葬悦月云员鄄
耘曾杂 渊 缘鄄悦郧郧粤粤栽栽悦粤郧栽栽郧栽悦悦郧粤粤郧粤粤粤悦悦郧鄄
郧悦郧郧郧悦悦郧鄄猿冤 和 允葬悦月云员鄄耘曾粤 渊缘鄄悦悦悦栽悦郧粤郧栽栽粤鄄
粤栽栽悦粤栽悦悦粤栽粤栽粤粤粤粤悦郧悦粤悦悦栽栽悦鄄猿冤袁并以 糟阅晕粤
为模板进行 孕悦砸 扩增遥 纯化后的 孕悦砸 产物和
孕耘栽猿圆葬 质粒进行 耘糟燥砸玉 辕 载澡燥玉 双酶切后使用 栽源
造蚤早葬泽藻 渊栽葬运葬蕴葬袁 阅葬造蚤葬灶袁 悦澡蚤灶葬冤进行连接袁所得到的
重组表达载体命名为 允葬悦月云员鄄孕耘栽猿圆葬遥 将重组载体
转化到大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤 中遥 将测序验证的重
组菌置于含 缘园 滋早窑皂蕴 原员氨苄青霉素的 蕴月 液体培
养基中培养过夜袁以 员颐 员园园 稀释后扩大培养至 韵阅远园园
为 园郾 缘袁猿苑 益尧园郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧 浓度条件下诱导
员园 澡遥 源 益尧源 园园园 早 离心收集菌体袁缓冲液渊圆园 皂皂燥造
窑蕴 原员 咪唑尧 园郾 缘 皂燥造 窑 蕴 原员 晕葬悦造尧 圆园 皂皂燥造 窑 蕴 原员
晕葬猿孕韵源袁 责匀 苑郾 缘冤 重悬后超声波破碎菌体 渊圆杂 伊
猿杂冤遥 菌体裂解液于 源 益尧圆园 园园园 早 离心 猿园 皂蚤灶袁 分
缘员源
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
别取少量超声前菌液尧破碎离心后的上清液和沉淀袁
进行 员圆豫 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳遥
员援 源摇 允葬悦月云员 基因片段的表达模式分析
根据 允葬悦月云员 序列设计荧光定量引物 允葬悦月云员择杂
渊缘鄄栽栽粤悦粤郧粤郧郧粤郧栽栽悦郧栽悦粤粤粤郧粤鄄猿冤 和 允葬悦月云员择粤
渊缘鄄悦郧栽粤郧悦悦郧悦悦粤粤郧悦悦郧粤郧栽悦粤鄄猿冤袁以 源 益 冷处
理的蓝花楹叶片尧茎尧根的 糟阅晕粤 为模板袁员愿杂 则砸晕粤
为内参基因 渊 匝员愿杂鄄杂院 缘鄄悦粤粤悦悦粤栽粤粤粤悦郧粤栽郧悦鄄
悦郧粤悦悦鄄猿 辕 匝员愿杂鄄粤院 缘鄄悦粤郧悦悦栽栽郧悦郧粤悦悦粤栽粤悦栽悦鄄
悦悦鄄猿冤袁使用 杂泽燥云葬泽贼栽酝 耘增葬郧则藻藻灶襆 杂怎责藻则藻皂蚤曾 渊 月蚤燥鄄
砸葬凿袁 哉杂粤冤 并按照说明书在 月蚤燥鄄砸葬凿 蚤悦赠糟造藻则 酝赠蚤匝
砸藻葬造鄄栽蚤皂藻 孕悦砸 杂赠泽贼藻皂泽 平台上进行荧光定量 孕悦砸遥
孕悦砸程序为院怨缘 益 猿园 泽袁源园 循环渊怨缘 益 缘 泽袁远园 益 员园
泽冤袁溶解曲线从 远缘 益 怨缘 益袁升温程序每秒为院园援 缘
益袁结果计算使用吟吟悦栽方法袁实验设计 猿 个 孕悦砸
重复遥
员援 缘摇 拷贝数分析
按照 孕悦砸 阅蚤早燥曾蚤早藻灶蚤灶 渊阅陨郧冤 孕则燥遭藻 杂赠灶贼澡藻泽蚤泽 运蚤贼
渊砸燥糟澡藻 阅蚤葬早灶燥泽贼蚤糟泽冤 说明书制备 杂燥怎贼澡藻则灶 杂交探针袁
扩增引物为 允葬悦月云员鄄耘曾杂 和 允葬悦月云员鄄耘曾粤袁将蓝花楹
总 阅晕粤 分别用 耘糟燥砸玉尧载澡燥玉尧月葬皂匀玉酶切 圆源 澡袁
阅晕粤 用量均为 员圆 滋早遥 杂燥怎贼澡藻则灶 杂交过程参照 匀蚤鄄
造葬则蚤燥 藻贼 葬造援 咱圆园暂的方法遥
员援 远摇 允葬悦月云员 片段的异源表达
根据蓝花楹 悦月云 序列设计引物 允葬悦月云员鄄
责月陨圆圆员杂 渊 缘鄄郧悦栽悦栽粤郧粤粤郧栽栽郧栽悦悦郧粤粤郧粤粤粤悦悦郧鄄
郧悦郧郧郧悦悦郧鄄猿冤 和 允葬悦月云员鄄责月陨圆圆员粤 渊缘鄄悦郧郧郧粤栽悦鄄
悦粤栽栽悦粤栽悦悦粤栽粤栽粤粤粤粤悦郧悦粤悦悦栽栽悦鄄猿 冤 并 进 行
孕悦砸 扩增袁将纯化后的 孕悦砸 产物与 责月陨圆圆员 质粒分
别用 载遭葬玉 辕 月葬皂匀玉 双酶切尧连接袁构建重组植物表
达载体袁命名为 猿缘杂鄄允葬悦月云员院郧云孕遥 拟南芥转基因采
用 郧灾猿员园员 脓杆菌介导尧花序浸染的方式遥 使用空
载的 责月陨圆圆员 质粒做转基因对照遥 使用经氨苄青霉
素筛选与 孕悦砸 检验后的转基因拟南芥 云圆 代种子做
耐冷性检测遥 实验使用 圆缘 凿 生的拟南芥植株于 原 愿
益 冷冻渊梯度降温冤处理袁叶片刚显现白霜渊约 圆源 澡冤
时将拟南芥转入室温进行恢复培养遥 猿 凿 后观察拟
南芥生长情况袁收取叶片测定丙二醛渊酝阅粤冤 及游离
脯氨酸渊孕则燥冤 含量袁并分析 允葬悦月云员 在转基因植株中
的表达模式遥
使用 蕴藻蚤糟葬 栽悦杂 杂孕缘 激光共聚焦显微镜系统检
测 郧云孕 绿色荧光蛋白袁观察倍数为 源园 伊 袁操作步骤
参照 月葬则灶藻泽 藻贼 葬造援 咱圆员暂和 运怎燥 藻贼 葬造援 咱圆圆暂 遥
圆摇 结果与分析
圆援 员摇 允葬悦月云员 基因的克隆与信息学分析
分别以 源 益 处理后的蓝花楹叶片 糟阅晕粤和基因
组 阅晕粤 为模板袁使用引物 允葬悦月云员鄄杂 和 允葬悦月云员鄄粤
进行 孕悦砸 扩增袁均克隆得到 源缘苑 遭责 的核苷酸片段袁
表明该片段中没有内含子遥 序列比对结果显示其与
陨造悦月云员 渊 粤粤在缘苑源猿源郾 员 冤尧 粤贼悦月云圆 渊 粤月灾圆苑园怨园郾 员 冤尧
粤贼悦月云员 渊 晕孕 赃缘远苑苑员怨郾 员冤尧悦遭悦月云 渊 粤粤再圆员愿怨怨郾 圆冤和
悦遭责阅砸耘月员渊粤月酝圆员源远愿郾 员冤等 悦月云员 类转录因子的相
似性在 怨园豫以上袁其中与 陨造悦月云员 相似度达到 怨怨豫
渊图 员粤冤遥 根据 阅晕粤酝粤晕 缘郾 员 预测分析袁该核苷酸
片段编码氨基酸个数为 员源圆袁分子量为 员远郾 园 噪阅葬遥
根据文献对 悦月云员 蛋白质的结构分析袁此氨基酸链
含有 悦月云 类转录因子典型的 粤孕圆尧 孕运运 辕 砸孕鄄
粤郧砸曾运云曾耘栽砸匀孕 以及 阅杂粤宰砸 保守序列 咱员远暂 袁预示
其具有结合植物耐冷基因启动子从而调控耐冷基因
表达的功能渊图 员粤冤遥 序列比对与氨基酸结构分析
表明袁从蓝花楹叶片中克隆得到的基因片段属于
悦月云员 类转录因子家族袁命名为 允葬悦月云员遥
将 允葬悦月云员 构建到 孕耘栽猿圆葬中袁在 猿苑 益尧终浓度
为 园郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧 的诱导条件下袁该重组蛋白
主要以可溶形式表达遥 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳分析表明袁
允葬悦月云员鄄孕耘栽猿圆葬 融合蛋白质的可溶性达到 怨园豫以
上袁分子量为 猿远郾 缘 噪阅葬袁与预测分子量完全吻合渊其
中袁孕耘栽猿圆葬 质粒载体的标签蛋白为 圆园郾 缘 噪阅葬冤 渊图
员月冤遥
圆援 圆摇 允葬悦月云员 的表达模式分析
使用 择砸栽鄄孕悦砸 方法研究 允葬悦月云员 的组织表达
模式袁结果显示在持续 苑圆 澡 的 源 益 低温胁迫条件
下袁蓝花楹根尧茎尧叶片中 允葬悦月云员 的转录水平都升
高袁但升高的趋势与强度不同渊图 圆冤遥 允葬悦月云员 在
根中于 愿 澡 达到最高转录水平袁之后稳定表达曰
允葬悦月云员 在茎中 园 苑圆 澡 内的转录水平稳定升高曰
而 源 益 诱导 允葬悦月云员 在叶片中表现出倒 灾 型的转
录变化趋势袁峰值出现于 缘 澡袁为根中最高表达量的
猿 倍袁同时间段茎中表达量的 源 倍袁说明冷胁迫的
早期 允葬悦月云员 表达的主要部位是蓝花楹叶片袁并且
在叶片中最先达到峰值遥 冷处理 源愿 澡 后 允葬悦月云员
转录水平在蓝花楹茎中达到最高水平袁而在根中的
转录始终较低遥
远员源
第 源 期 周摇 静等院蓝花楹 允葬悦月云员 转录因子片段的序列分析及耐寒性功能验证
摇 摇 粤院允葬悦月云员 与多个 悦月云员 转录因子氨基酸比对遥 氨基酸序列为院粤贼袁粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 悦月云员渊晕孕赃缘远苑苑员怨援 员冤曰
悦遭责袁悦葬责泽藻造造葬 遭怎则泽葬鄄责葬泽贼燥则蚤泽 阅砸耘月员渊粤月酝圆员源远愿郾 员冤曰悦遭袁悦澡燥则蚤泽责燥则葬 遭怎灶早藻葬灶葬 悦月云员渊粤粤再圆员愿怨怨郾 圆冤曰陨造袁陨则蚤泽 造葬糟贼藻葬 增葬则援 造葬糟鄄
贼藻葬造 悦月云员渊粤粤在缘苑源猿源郾 员冤曰允葬袁允葬糟葬则葬灶凿葬 葬糟怎贼蚤枣燥造蚤葬 悦月云员遥 直线区域标注的为 粤孕圆 结构域袁黑色圆点与方块标注的分
别是 孕运运 辕 砸孕粤郧砸曾运云曾耘栽砸匀孕 和 阅杂粤宰砸 保守结构域遥 月院允葬悦月云员 原核表达的 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳遥 酝袁蛋白 酝葬则噪藻则曰员
耀 猿 分别为超声前菌液尧破碎后沉淀和上清液的电泳带曰黑色箭头标注的为融合蛋白 允葬悦月云员鄄孕耘栽猿圆葬遥
图 员摇 蓝花楹 允葬悦月云员 氨基酸序列比对与原核表达
图 圆摇 允葬悦月云员 在 源 益冷诱导条件下的组织表达模式
圆援 猿摇 允葬悦月云员 的基因组拷贝数分析
为研究 允葬悦月云员 在蓝花楹基因组中的拷贝数袁
使用 杂燥怎贼澡藻则灶 杂交技术分析 耘糟燥砸玉尧载澡燥玉尧月葬皂匀
玉酶切的总 阅晕粤袁杂交显影后分别观察到 圆尧员尧员 条
杂交带袁说明蓝花楹总基因组中至少存在 圆 个
允葬悦月云员 拷贝渊图 猿冤袁这与拟南芥尧烟草中 悦月云员 转录
因子的拷贝数是一致的遥
圆援 源摇 允葬悦月云员 在拟南芥中的异源表达
为进一步验证 允葬悦月云员 基因片段的功能袁构建
了带有 郧云孕 标签的重组载体 猿缘杂鄄允葬悦月云员院院郧云孕袁并
用 郧灾猿员园员 根瘤脓杆菌介导浸染到 悦燥造怎皂遭蚤葬 野生型
白色箭头指示蓝花楹基因组中存在的 允葬悦月云员 拷贝
图 猿摇 允葬悦月云员 在蓝花楹基因组的 杂燥怎贼澡藻则灶杂交结果
拟南芥中遥 经 原愿 益 冷冻处理后袁使用 择砸栽鄄孕悦砸检
测 允葬悦月云员 的表达模式袁发现其转录水平升高了 猿 倍
渊图 源月冤袁而转基因拟南芥植株中 酝阅粤 和 孕则燥 的含
量水平都低于对照组 员 辕 圆 以下渊图 源悦袁阅冤遥 相对于
野生型与空载对照组袁转 允葬悦月云员 基因的拟南芥植
株表现出了较好的生长恢复状态袁没有明显的叶片
白枯现象渊图 源粤冤袁说明转 允葬悦月云员 基因的拟南芥在
冷冻胁迫条件下受到的伤害较小袁具备了高于对照
组的耐冷冻性袁从而验证了 允葬悦月云员 能够增强拟南
芥的耐冷冻性的功能遥
使用荧光共聚焦显微照相技术观察转 猿缘杂鄄
允葬悦月云员院院郧云孕 重组质粒的拟南芥袁发现 允葬悦月云员 蛋白
主要在细胞核中表达 渊图 缘冤袁预示 允葬悦月云员 具有转
录因子的特点袁即可作用于靶基因的启动子区以调
控其表达遥 允葬悦月云员 的核定位结果进一步验证了其
作为 悦月云 类转录因子袁在蓝花楹冷冻敏感性与耐受
应答中的重要作用遥
苑员源
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
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间段的转录水平曰悦袁阅院 分别为冷冻前后拟南芥植株中 酝阅粤和 孕则燥含量变化遥
图 源摇 允葬悦月云员 基因转拟南芥的异源功能验证
拟南芥幼苗在黑暗条件下萌发遥 粤院无光条件下拟南芥叶片曰
月院绿色荧光条件下拟南芥叶片袁白色箭头指向为细胞核
图 缘摇 荧光共聚焦纤维照相技术观察 允葬悦月云员院院郧云孕 的细胞定位
猿摇 讨论
悦月云 类转录激活因子自从拟南芥中发现袁就被
确认为反式作用因子遥 这类因子在拟南芥尧烟草等
植物组织中表达并无组织特异性袁当植株处于低温
或冷冻胁迫时瞬时表达袁且 员 澡 内就达到转录高峰遥
然而袁本研究发现袁冷敏感植物蓝花楹中 允葬悦月云员 基
因在 源 益 低温胁迫条件下的诱导转录比较迟缓袁在
叶片中 缘 澡 才达到转录高峰袁而根尧茎中的诱导表达
还要延迟 圆 猿 澡遥 杂蚤灶早澡 等 咱圆猿暂认为氧化还原系统
的低温应答速度是区分耐冷植物与冷敏感植物的特
征之一袁一些热带植物体内的 杂韵阅尧孕韵阅尧悦粤栽 和
粤孕载 等自由氧清除酶类在冷胁迫中的反应严重滞
后于组织的冷害时间袁这是导致植株低温不耐性的
重要原因遥 近来袁植物冷害应答的滞后性研究从生
理生化角度逐渐转向分子生物学的基因组与转录组
水平 咱圆源暂 遥 本研究结果提示袁在蓝花楹中 悦月云 类冷
应答因子的反应滞后性也是导致植株低温敏感性的
重要因素遥
酝藻凿蚤灶葬 藻贼 葬造援 咱员缘暂发现 悦月云员 的氨基酸链由 源 个
区域组成院氨基末端区尧核酸定位信号区尧粤孕圆 区和
酸性区 咱员猿 原 员源暂 遥 研究表明袁粤孕圆 区能与 悦韵砸 基因启
动子区的 悦砸栽 辕 阅砸耘 序列结合袁从而激活后者转录
表达遥 悦月云 基因片段缺失实验表明其 粤孕圆 区与酸
性区是发挥功能的重要区域袁氨基末端则是非必需
的 咱员源 原 员缘袁 圆缘暂 遥 本研究从蓝花楹中新克隆到的
允葬悦月云员 因子包含 粤孕圆 区和部分酸性区袁缺失氨基
末端袁在拟南芥中的异源表达证明其能增强转基因
植株的低温耐受性袁此结果不仅验证了氨基末端的
非必需性袁也说明酸性区的完整性也不是 悦月云 正常
发挥功能的必要条件遥
悦月云 类转录因子的冷应答反应通路一直是学者
愿员源
第 源 期 周摇 静等院蓝花楹 允葬悦月云员 转录因子片段的序列分析及耐寒性功能验证
们研究的热点袁涉及各种生物学方法与多种模式植
物袁但至今未取得共识性的突破进展遥 悦月云 通路简
略步骤为院植物接受低温信号袁结构性表达的 陨悦耘 类
上游因子激活 悦月云 基因家族的转录袁后者级联诱导
悦韵砸 类逆境基因的表达袁之后植物体启动多种生理
生化以及代谢反应来应对低温伤害遥 同时袁悦月云 通
路还与 粤月粤 等信号通路交叉反应袁预示了植物冷应
答反应的网络化尧系统化与复杂性 咱圆源袁 圆远暂 遥 值得注
意的是袁虽然本研究中蓝花楹的 允葬悦月云员 因子能够
增强拟南芥的耐冻性袁其是否能够提高蓝花楹自身
的耐冷性袁还需要深入探索遥 这是因为袁耐冷植物
悦月云 通路与低温敏感植物的 悦月云 通路可能并不相
同遥 鉴于蓝花楹中 允葬悦月云员 基因至少存在 圆 个拷
贝袁有功能分工的可能性遥
蓝花楹是我国重要的木材及景观用优良树种袁冷
敏感性是影响其推广与栽培的弊病遥 本研究首次从
蓝花楹中克隆到一个新的类 悦月云转录因子片段袁并通
过转基因拟南芥的异源表达方式进行了功能验证袁表
明其能够增强植物低温 辕冻害耐受性袁对蓝花楹的冷
害机制研究与良种改善工程奠定了理论基础遥
参考文献院
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及其抗寒性鉴定咱允暂 援 西北植物学报袁 圆园园苑渊圆冤院圆圆猿 原 圆圆苑
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特性研究咱阅暂援 四川雅安院四川农业大学袁 圆园园怨
咱员员暂 刘荣梅袁 李凤兰袁 胡国富袁 等援 转 悦月云猿 基因烟草的抗寒性研
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咱员愿暂 吕胜男袁 生吉萍袁 赵丹莹袁 等援 悦月云基因调控植物抗冷径途的
研究进展咱允暂 援 西北植物学报袁 圆园员员渊远冤院员圆苑缘 原 员圆愿员
咱员怨暂 刘摇 湘援 一种蓝花楹属植物的植化和抗菌活性的研究咱 允暂 援 国
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