全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 2) : 177～ 183
Forest Research
᭛ゴ㓪ো : 1001-1498( 2010) 02-0177-07
ᴼᷥ㓈ㅵ㒘㒛⡍ᓖਃࡼᄤⱘܟ䱚Ϣਃࡼ⌏ᗻߚᵤ
ۯ ڲ1 , ฆਖ਼ࠍ1 , ч܀४1 , 2 , ვ೮൶1 , ঳਴ᅘ1*
( 1. 中国林业科学研究院林业研究所 , 国家林业局林木培育重点实验室 , 北京 100091;
2. 北京大学生命科学学院 , 北京 100871)
ᨬ㽕: 启动子在基因表达调控中起关键性作用 , 它在很大程度上决定所控基因表达的时间、空间和强度。依据拟南
芥 ATH1芯片分析杨树维管形成时期特异表达基因的结果 , 选取了差异表达基因 NST3, 通过 BLAST比对在杨树
EST数据库( PopulusDB) 中找到同源性较高的基因 NAC068。以毛白杨为材料 , 在其基因组中克隆得到该基因 5侧
翼区 901 bp长的片段, 命名为 pProNAC068, 将该片段置换 pBI121载体中的 CaMV 35S启动子, 并在 84K杨中检测报
告基因 GUS的表达情况。经过 GUS活性检测分析发现 : 该启动子可以控制外源基因在次生维管组织中特异表达 ,
从而为基因工程中有目的的控制外源基因在维管组织中的表达奠定基础。
݇䬂䆡 : 维管组织; 启动子; 组织特异; GUS染色; 基因工程
Ё೒ߚ㉏ো : S792.11 ᭛⤂ᷛ䆚ⷕ : A
收稿日期 : 2009-06-04
基金项目 : 国家 863 计划项目 ( 2006AA100109 ) ; 国际先进农业科学技术 ( 948 )重大创新项目 ( 2006 -4-C01)
作者简介 : 贺郭 ( 1982— ) ,男 , 硕士 , 主要从事树木分子生物学研究 .
* 通讯作者 :卢孟柱 ( 1964— ) , 男 , 博士 , 研究员 , 主要从事植物基因工程和树木分子生物学研究 . E-mail: lumz@ caf. ac. cn
Cloning and Functional Analysis of a Vascular Tissue-specific
Promoter from Populus tomentosa
HE Guo1 , WANGMin-jie1 , CHENHong-liang1 ,2 , ZHAO Shu-tang1 , LUMeng-zhu1*
( 1. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation,
State Forestry Administration, Beijing 100091, China; 2. College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China)
Abstract: Promoter plays a key role not only in regulating the level of gene expression but also in controlling the
expression in a spatial and temporal manner. According to the expression profile generated using Arabidopsis ATH1
genechip to analyze genes involved in the regeneration of the secondary vascular system in Populus tomentosa Carr,
a differentially expressed gene NST3 was chosen and its homologous gene NAC068 in poplar were found using
BLAST software against poplar EST database ( PopulusDB) . Then the 5′- upstream sequence of this gene was
cloned from Populus tomentosa Carr. and put into the plant expression vector pBI121 to replace the 35S promoter to
control the reporter gene gus. After transformation of polar 84K via Agrobactera, the GUS activity was detected in
cambium zone, suggesting this promoter could control gene expression in secondary vascular system thus should be
useful in genetic engineering to control exogenous gene specific expression in vascular system.
Key words: vascular tissue; promoter; tissue-specific; GUS stain; genetic engineering
树木维管形成层的活动产生大量的次生维管系
统,即木材 [ 1] 。木材是工业生产的主要原材料之一,
随着市场对木材需求的不断增长,对其材性的要求也
日益提高和多样化。杨树( Populus spp. ) 是非常重要
的用材树种,具有无性繁殖容易、生长速度快、生产周
期短等优点,发展杨树人工林是解决木材短缺的重要
途径之一 [ 2]。杨树木材材性多元化是多元化应用的
基础,但传统育种手段对此问题的研究进展缓慢。由
林 业 科 学 研 究 第 23卷
于植物分子育种是直接在 DNA水平上对材性进行有
目的的改造,可以克服传统育种方法的缺陷,在深入
了解木材形成过程的分子机理,即研究控制木材形成
的主要基因及其相互作用机制的基础上,可以实现有
目的地进行基因工程改良,最终达到调控木材形成、
改良木材材性的目的。基因的表达首先取决于其转
录的启动,启动子是转录的前提。相关报道认为,基
因的特异性是由该基因启动子的特异性决定的[ 3 - 4]。
在研究木材形成的调控基因中,如某些基因所编
码的转录因子、植物激素等在木材生长调节、信号转
导等方面的调节作用往往很强,需要对基因表达的部
位及表达量进行精确控制;而植物基因工程中常用的
组成型启动子, 如来源于花椰菜花叶病毒的 CaMV
35S启动子启动表达具有持续性,其所启动的基因不
受外界因素的诱导,在不同的发育阶段和组织表达强
度大,无明显差异。因此,采用该类启动子用于基因
工程中对某些基因的研究时,不仅不能控制基因的精
确表达,而且可能会导致对转基因植株的明显影响,
因此需要寻找一些更为有效的诱导型或特异性启动
子代替组成型启动子,以期更好地调控植物基因的表
达,不至于影响植物正常的生长发育。
利用毛白杨( Populus tomentosa Carr. ) 维管再生
实验系统 [ 5] ,通过基因芯片分析已获知大量在毛白
杨次生维管再生过程中特异表达的基因 [ 6] 。本试验
以此为基础, 分离了与拟南芥 ( Arabidopsis thaliana
( L. ) Heynh. ) NST3 基因高度同源的杨树 NAC068 基
因的启动子, 与 GUS 基因融合后转化银腺杨 ( P.
alba×P. glandulosa) 无性系 84K, 利用 GUS组织化
学定位法检测转基因杨树中 GUS基因的表达情况,
鉴定启动子是否在维管组织中特异启动,从而为下
一步构建维管组织特异表达载体奠定基础,使目的
基因在维管组织中特异表达,为进一步研究基因功
能及其调控机制,从而有目的的改良树木材性提供
手段和依据。
1 ϫॸူֺ֥
1. 1 ᴤ᭭
1. 1. 1 ೋིϫॸ 毛白杨、84K杨无菌苗均为中国
林科院林业所生物技术实验室保存并繁殖;大肠杆
菌 DH5α、农杆菌 GV3101 菌种及 pBI121 质粒均由
本实验室保存。
1. 1. 2 ೋޔ 限制性内切酶及 DNA 连接酶购自
NEB公司; DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒
购自 AxyGen 公司; pGEM-T Easy 载体购自 Promega
公司; Taq DNA聚合酶购自 TaKaRa 公司; X-gluc 购
自 Sigma公司;其它试剂购自国内有关公司或厂家;
PCR引物由北京奥科生物公司合成。
1.2 ᮍ⊩
1. 2. 1 ᄑ๞ᆙ DNAԅඔ௜ 采用 CTAB法 [ 7 ] 提取
毛白杨叶片总 DNA。将 0. 1 g毛白杨叶片在液氮中
研磨至粉末状,加入 600 μL 65 ℃预热的 2 ×CTAB
( 2% ( w/v) CTAB; 1. 4 mmol·L - 1 NaCl; 0. 2% ( v/ v)
β-巯基乙醇; 20 mmol·L - 1 EDTA; 100 mmol· L- 1
Tris-HCl( pH 值 8. 0 ) ) 提取缓冲液, 65 ℃ 保温
30 min,期间稍加混匀。加入 600 μL氯仿∶异戊醇
( 24∶1, v/ v)混合液抽提 10 min, 12 000 r·min - 1离
心 10 min, 将上清液转移到新的离心管中, 加入
0. 1 倍体积的 NaOAc、2 倍体积的预冷无水乙醇,在
- 20 ℃沉淀 30 min, 12 000 r·min- 1离心 15 min,沉
淀用冰上预冷的 70% 乙醇洗涤 1 次。加入 100 μL
无菌水溶解沉淀, - 20 ℃保存备用。
1. 2. 2 ୳Վᆐଫխԅࢸন 从拟南芥的 ATH1 全
基因芯片分析杨树维管形成时期特异表达基因的结
果 [ 6 ] 中 选 取 拟 南 芥 基 因 NST3 ( Locus tag:
At1g32770) ,该基因在拟南芥纤维细胞中编码与次
生壁合成有关的 NAC转录因子 [ 8 - 1 1] ,通过生物信息
学的方法, 以此基因序列为信息探针,用 BLAST程
序找到在杨树数据库中高度同源的基因 NAC068
( JGI: gw1. XI. 947. 1) 进行启动子的分离。
参照已发表的毛果杨 ( P. trichocarpa Torr. et
Groy)基因组序列文献,根据 NAC068基因上游序列设
计 1 对 引 物, 其 序 列 分 别 为: proF: 5′ATCTG-
TAGTCTCTCGTTTGAG 和 proR: 5′GAAATCTAAAGC-
CTGGAGGAA。按下列体系进行聚合酶链式反应
( PCR) :取 1. 0 μL(约 50 ng) 毛白杨总 DNA为模板,
加入 2. 5 μL 10×buffer( 15 mmol·L - 1 Mg2 + ) , 1. 0 μL
10 mmol·L - 1 dNTP, Taq DNA 聚合酶 1. 0 U,特异引
物 proF( 10 μm)、proR( 10 mmol·L - 1 ) 各 1. 0 μL,加
适量无菌水至 25. 0 μL,先于 94 ℃预变性 5 min,后以
94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min进行 36 个反应循
环,最后 72 ℃延伸 7 min。PCR反应完成后,在 1%琼
脂糖凝胶上电泳检查扩增片段的特异性和大小。按
照 AxyGen凝胶纯化试剂盒操作指南纯化目的片段,
将此片段按操作说明与 pGEM-T Easy载体连接,连接
产物转化 E. coli DH5α感受态细胞 [ 12] 。最后在含有
IPTG和 X-gal的 LB/ Amp平板上筛选出阳性菌株,提
871
第 2 期 贺 郭等: 杨树维管组织特异启动子的克隆与启动活性分析
取质粒命名为 pGT-pro,并测序。
1. 2. 3 ୳Վᆐ༝ॹԅד๥ 采用 BLAST程序对测
序得到的 DNA序列与已发表的序列进行同源性比
较,并将该序列在 PlantCARE[ 13] 数据库中进行分析。
1. 2. 4 ζӒၻ඘ԅٲߙރᅧܤ 为了便于定向克隆
和载体构建,正向和反向引物 5�端分别引入 HindⅢ
XmaI酶切位点,引物序列如下: proF1: 5�AGCTT TG-
TAGTCTCTCGTTTGAGC 和 proR1: 5�CCGGG TCT-
TCAGGCATTTTTGCTA。PCR扩增反应体系同 1. 2. 2
节,模板为 pGT-pro 质粒。按下列程序进行扩增, 94
℃预变性 5 min,然后进入循环, 94 ℃变性 30 s、53 ℃
退火 30 s、72 ℃延伸 1 min, 5 个反应循环, 94 ℃变性
30 s、62 ℃退火 30 s、72 ℃延伸1 min, 30个反应循环,
最后 72 ℃延伸 7 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电
泳检测后,用试剂盒对特异性扩增产物进行回收纯
化,与 pGEM-T Easy载体连接,然后进行细胞转化,提
取质粒命名为 pGT1-pro并测序。用 HindⅢ和 XmaⅠ
分别双酶切 pGT1-pro和 pBI121质粒,然后将 pGT1-pro
质粒双酶切后的小片段和 pBI121 质粒双酶切后的大
片段连接获得如图 1 所示的植物表达载体,命名为
pProNAC068∶∶GUS。将该质粒用电击法导入农杆菌
GV3101菌株的感受态细胞,并通过 PCR鉴定,筛选出
转化子。
图 1 植物表达载体 pProNAC068∶∶GUS
以 84K杨无菌苗叶片为外植体, 用刀片划成约
1 cm的伤口, 放在含有重组表达载体 pProNAC068
∶∶GUS的农杆菌 GV3101 菌液中侵染 10 min, 侵染
后取出外植体置于无菌滤纸上吸干其表面的菌液,
放在 MS分化培养基( 含琼脂 5 g·L - 1,蔗糖 30 g·
L- 1 , 6-BA 0. 5 mg·L - 1 , NAA 0. 05 mg·L - 1 ) 上,在
黑暗条件下共培养 3 d;然后将这些叶片取出,置于
附加卡那青霉素 ( 300 mg·L - 1 ) 和头孢青霉素( 500
mg·L - 1 ) 的选择性分化培养基上, 16 h光照培养,
同时以转化 pBI121 质粒作为阳性对照,以未做侵染
的叶片外植体作为空白对照。待分化的抗性芽长到
1 cm左右时转入 1 /2 MS生根培养基上 ( 含琼脂 5 g
·L - 1 ,蔗糖 30 g· L - 1 , IBA 0. 05 mg· L - 1 , NAA
0. 05 mg·L - 1 ,卡那青霉素 300 mg·L- 1和头孢青霉
素 500 mg·L - 1) 诱导生根。
1. 2. 5 ᅧݮ࿙ᄑᅉԅ PCR޿Љ 转化苗长至 3 cm
左右时,取 0. 1 g左右的叶片,用 CTAB法 [ 7]提取再生
植株叶片中基因组 DNA,并作为模板进行 2 次 PCR
扩增,以提高 PCR检测的准确性,第 1 次 PCR扩增所
用引物为根据 pProNAC068 片段序列所设计的正向特
异引物: 5�TCTTCTCCAAGGCTTAGACCC,根据 GUS基
因 序 列 所 设 计 的 反 向 特 异 引 物:
5�ACTTCCTGATTATTGACCCACA,退火温度为 55 ℃,
PCR反应体系及其它条件同 1. 2. 2;第 2 次 PCR扩增
所用引物为 NPTII 特异引物 ( 上游引物: ATGATT-
GAACAAGATGGATTG; 下 游 引 物: TCA-
GAAGAACTCGTCAAGAAG) ,退火温度为 55 ℃, PCR
反应体系与其它条件同1. 2. 2,扩增产物经1%琼脂糖
凝胶电泳,以检测其大小。
1. 2. 6 ᅧݮ࿙ཷ೮ GUSݣ໿ԅᆦᄎܤ༰Շส 取
高度约为 6 cm的转基因杨树组培苗第 1 片展开叶
到第 9 片展开叶之间的每 2 片叶片间的茎段, 按照
Jefferson等 [ 14 ] 的方法进行 GUS组织化学定位。将
不同部位的茎段浸入 X-gluc 染色液, 37 ℃保温
12 ～ 16 h,经 70%酒精脱色后进行石蜡切片, 用显
微镜观察 GUS基因的表达情况。
2 ࠒڴူד๥
2.1 ਃࡼᄤᑣ߫ߚᵤ
用 T7、SP6 通用引物对 pGT1-pro 质粒进行测
序,拼接得到 1 个长度为 901 bp 的序列, 将该序列
与已发表的毛果杨序列比较发现: 二者同源性达
94. 67% ( 图 2) 。通过 BLASTn程序分析, 该序列在
GenBank数据库中没有任何同源片段, 表明此片段
为首次克隆得到。在 PlantCARE[ 13 ]数据库中搜索发
现,在该序列中存在着多个 TATA-box 和 CAAT-box
的同源序列区, TATA-box 和 CAAT-box 为启动子的
重要元件 [ 1 5]。TATA框具有将 RNA 聚合酶 II 引导
到正确的转录起始位点的功能; CAAT框是调控转
录速率的元件 [ 1 6]。另外,在该区域还发现了多个已
知顺式作用元件的同源序列区,如八聚体框:含有 8
bp的保守序列 ATGCAAAT;光应答元件: I-box、GA-
971
林 业 科 学 研 究 第 23卷
motif、GAG-motif; 生长素应答元件: AuxRR-core; 热
诱导应答相关顺式元件: HSE;水杨酸应答的顺式元
件: TGA - element等多种激素应答元件及其他一些
转录激活元件。据此推测,该启动子所控制的下游
基因 NAC转录因子即 NAC068 的表达可能受多种元
件的共同调节;同时也发现序列中富含连续 6 ～ 7
个 A或者 T的重复序列,在大多数植物启动子中 A/
T富含序列都和基因转录活性的正调控有关 [ 17 - 19] 。
P. trichocarpa NAC068: 毛果杨 pProNAC068 序列 ; P. tomentosa NAC068 + :毛白杨编码链中 pProNAC068 序列 ;
P. tomentosa NAC068 -: 毛白杨非编码链中 pProNAC068 序列。
图 2 毛白杨正负链中 pProNAC068 序列及与毛果杨 pProNAC068 序列同源性分析
2. 2 ỡ⠽㸼䖒䕑ԧⱘᵘᓎঞ䕀෎಴ỡ᷾ⱘẔ⌟
得到的重组质粒 pProNAC068∶∶GUS经 HindⅢ
与 XmaⅠ双酶切产生 1 条约 900 bp的片段,与预期
大小一致 ( 图 3 ) , 证明该片段已经成功连接到
pBI121 载体中。通过转化银腺杨 84K, 得到经卡那
青霉素抗性筛选的再生植株。采用 NPTII引物鉴定
转基因植株, 1%凝胶电泳检测 PCR产物的大小( 图
4) ,在检测的 9 株转基因杨树植株中, 有 5 株 ( 图 4
081
第 2 期 贺 郭等: 杨树维管组织特异启动子的克隆与启动活性分析
中第 2、3、5、6、7 泳道) 扩增出 1 条约 800 bp大小的
特异片段,片段大小与预期结果相同。
M1, M2: DNA Marker; 1: pProNAC068∶∶GUS双酶切结果
图 3 pProNAC068∶∶GUS质粒 HindⅢ和 Xma Ⅰ双酶切电泳图
M1, M2: DNA marker;泳道 1 ～ 9: 经卡那青霉素筛选后的再生植株
图 4 再生植株的 PCR扩增产物电泳检测图
2.3 GUS⌏ᗻߚᵤ
为了验证所克隆启动子的功能,取转基因杨树植
株不同部位进行 GUS检测。经 X-gluc 组织化学染色
检测、显微观察 GUS基因的表达情况,结果( 图 5) 表
明:在较为幼嫩的茎段( 第 2 ～ 3 片展开叶间,图 5A、
B)木质部、韧皮部中均可观察到蓝色,但蓝色较集中
地出现在维管形成层附近区域,在细胞壁正在加厚的
细胞中也能观察到蓝色;在第 3 ～ 4 片展开叶间茎段
中( 图 5C、D)也观察到了同样的现象,蓝色较多的分
布在形成层附近区域,细胞壁加厚的细胞中也能观察
到蓝色。随着木质化程度的增加( 图 5E、F,第 6 ～ 7
片展开叶间茎段) ,可观察到蓝色主要分布在形成层
靠近韧皮部的区域,而在成熟的木质部细胞中没有蓝
色,在薄壁细胞中也基本观察不到蓝色( 图 5E) ,对比
该部位在紫外激发下自发荧光的组织横切面照片( 图
5F)可看到,在细胞壁明显加厚的细胞中观察不到蓝
色。在叶柄中也同样检测到了GUS酶的活性( 图 5G,
第 3 片展开叶叶柄) ,对照该部位在紫外激发自发荧
光( 图 5H)的组织横切面照片,可观察到蓝色主要出
现在细胞壁加厚的木质化区域。由此可见: GUS主要
在维管形成层区域表达,可以推断该启动子具有维管
组织特异启动的特性。
3 ࠒৢူඉৢ
组织特异性启动子作为一类专一性启动子,能
指导外源基因在植物发育过程中某一特定时空进行
表达,根据需要选择合适的启动子,不仅便于研究新
基因的功能,阐明其在植物的生长、发育、分化及繁
殖过程中的作用与机理, 还可以在植物特定的部位
或发育阶段实现对外源基因表达的定时、定点、定量
的三维精确调控。目前,虽然得到了不少的组织特
异性启动子,但木本植物次生维管系统特异启动表
达的启动子还比较少。本试验对杨树维管系统特异
性启动子的分离及其启动活性的验证, 为构建维管
系统特异表达载体提供了有效的调控元件,为进行
材性改良奠定了基础。
本研究利用拟南芥 ATH1 全基因芯片获得的毛
白杨维管再生过程差异基因表达谱, 选取在杨树维
管系统中特异表达的基因 NAC068,从毛白杨的基因
组中分离克隆了 1 条长 901 bp的具有启动子特征
的 DNA特异片段。经序列同源性搜索后证实,是 1
个新的 5�端调控序列。用 PlantCARE[ 13] 对其分析
的结果表明, 该序列除具有普通启动子都有的 TA-
TA-box、CAAT-box顺式元件外,还含有多个顺式作
用因子元件,说明启动子调控的下游基因———NAC
转录因子受到多个信号的共同调节。另外,在该序
列中发现 1 个 bZIP蛋白结合位点 ACGT, 目前发现
的大多数 bZIP蛋白的 DNA 结合位点均含有 ACGT
核心序列,而 bZIP蛋白则是植物中最丰富的一类转
录因子 [ 2 0] ,有些 bZIP蛋白(如 VSF-1) 的结合序列与
基因维管束特异表达有关 [ 21 ]。在该序列中还发现
与控制菜豆苯丙氨酸氨裂合酶 2( PAL2) 维管束特异
表达序列 [ 2 2] AC-I ( CCCACCTACC) 相类似的序列
( CCCACATGCC) 及与 AC-II( TCCACCAACCCC) 相
类似的序列 ( TCCACACAAAGCCC) , 因而推测这些
序列可能与该启动子的维管束特异启动相关; 但这
些顺式作用元件在启动子中如何调控基因维管束的
特异表达,仍需用试验来证明。
分别取 pProNAC068∶∶GUS和阳性对照 pBI121
转基因植株的整个茎段为材料,通过 Real-Time PCR
分析 GUS基因的表达情况, 结果显示:就整个茎段
而言, 35S启动子的启动强度大约是该特异启动子
的 3 倍,但通过对组织切片的染色情况进行分析后
181
林 业 科 学 研 究 第 23卷281
第 2 期 贺 郭等: 杨树维管组织特异启动子的克隆与启动活性分析
发现,该启动子所启动的 GUS基因主要集中在形成
层区域启动表达,该区域只占整个茎段的 1 /5 左右,
从而可以推测出,该启动子在形成层区域启动表达
的强度比 35S启动子的高。
目前,已鉴定的维管组织特异启动子大多是在
木质部或韧皮部区域启动表达,而缺少在形成层区
域特异启动表达的启动子。本研究通过分析转基因
植株的 GUS基因表达情况,证明了该启动子具有维
管组织特异启动表达的特性,并且启动表达的区域
主要集中在杨树维管形成层区域。拟南芥基因芯片
探针组对应的基因 NST3 已有较多研究 [ 8 - 11 ] , 该基
因是与细胞次生壁加厚有关的 NAC转录因子,其启
动子主要在次生壁正在加厚的细胞中启动表达。本
文对杨树 NAC068 基因启动子的研究表明,该启动
子在杨树次生壁加厚的细胞中启动表达,这与在拟
南芥中的研究结果一致;但是,目前发现该启动子在
较幼嫩茎段和叶柄次生壁加厚的细胞中也启动表
达,但随着木质化程度的增加,细胞壁明显加厚的细
胞内检测不到 GUS基因的表达,这可能是由于细胞
壁明显加厚的细胞已经启动了程序化死亡,内容物
消失,所以无法检测到 GUS酶的活性。
本研究下一步的工作是对该启动子的启动表达
强度进一步进行验证,并对该序列进行系列缺失,构
建包含不同长度的启动子缺失片段的植物表达载体,
通过转基因研究确定增强子区和启动子活性区等。
在此基础上构建高效表达载体,驱动外源基因在维管
组织特异表达,对更深入了解木材形成过程的分子机
理、材性改良的基因工程育种等具有重要意义。
খ㗗᭛⤂ :
[ 1] lomion C, Leprovost G, Stokes A. Wood Formation in Trees[ J] .
Plant Physiology, 2001, 127( 4) : 1513 - 1523
[ 2] 卢孟柱 , 胡建军 . 我国转基因杨树的研究及应用现状 [ J] . 林业
科技开发 , 2006 , 20( 6 ) : 1 - 4
[ 3] Kloti A, Henrich C, Bieri S, et al. Upstream and downstream se-
quence elements determine the specificity of the rice tungro bacilli-
form virus promoter and influence RNA production after transcription
initiation[ J] . Plant molecular biology, 1999, 40( 2 ) : 249 - 266
[ 4] Saito T, Tadakuma K, Takahashi N, et al. Two cytosolic cyclophilin
genes of Arabidopsis thaliana differently regulated in temporal-and or-
gan-specific expression [ J] . Bioscience, biotechnology, and bio-
chemistry, 1999, 63( 4) : 632 - 637
[ 5] Du J, Xie H L, Zhang D Q, et al. Regeneration of the secondary vascu-
lar system in poplar as a novel system to investigate gene expression by a
proteomic approach[ J] . Proteomics, 2006, 6( 3) : 881 - 895
[ 6] Wang M J, Qi X L, Zhao S T, et al. Dynamic changes in transcripts
during regeneration of the secondary vascular system in Populus to-
mentosa Carr. revealed by cDNA microarrays[ J] . BMC Genomics,
2009, 10: 215
[ 7 ] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA [ J] . Nucleic Acids Research, 1980 , 8 ( 19 ) :
4321 - 4325
[ 8 ] Mitsuda N, Iwase A, Yamamoto H, et al. NAC transcription factors,
NST1 and NST3, are key regulators of the formation of secondary walls
in woody tissues of Arabidopsis[ J] . The Plant Cell, 2007, 19( 1) : 270
[ 9 ] Zhong R, Richardson E A, Ye Z H. Two NAC domain transcription
factors, SND1 and NST1, function redundantly in regulation of sec-
ondary wall synthesis in fibers of Arabidopsis[ J] . Planta, 2007 , 225
( 6 ) : 1603 - 1611
[ 10] itsuda N, Seki M, Shinozaki K, et al. The NAC transcription
factors NST1 and NST2 of Arabidopsis regulate secondary wall thick-
enings and are required for anther dehiscence[ J] . The Plant Cell,
2005, 17 ( 11 ) : 2993 - 3006
[ 11] Zhong R, Demura T, Ye Z H. SND1, a NAC domain transcription
factor, is a key regulator of secondary wall synthesis in fibers of Ar-
abidopsis[ J] . The Plant Cell, 2006, 18( 11) : 3158
[ 12] Sambrook J, Russell D W. Molecular cloning: a laboratory manual
[ M] . NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 : 898 - 915
[ 13] Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M, et al. Plant cis-acting regulatory
DNA elements ( PLACE) database[ J] . Nucleic Acids Research,
1999, 27 ( 1) : 297 - 300
[ 14 ] Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion
system[ J] . Plant Molecular Biology Reporter, 1987, 5( 4) : 387 - 405
[ 15 ] Pedersen A G, Baldi P, Chauvin Y, et al. The biology of eukaryot-
ic promoter prediction— a review[ J] . Computers and Chemistry,
1999, 23 ( 3 - 4) : 191 - 207
[ 16] Lewin B. Gene VIII[ M] . NJ: Pearson Prentice Hall, 2004
[ 17] Tjaden G, Coruzzi G M. A novel AT-rich DNA binding protein that
combines an HMG I-like DNA binding domain with a putative tran-
scription domain[ J] . The Plant Cell, 1994, 6( 1) : 107 - 118
[ 18 ] Bustos M M, Guiltinan M J, Jordano J, et al. Regulation ofβ-Glu-
curonidase Expression in Transgenic Tobacco Plants by an A /T-
Rich, cis-Acting Sequence Found Upstream of a French Bean β-
Phaseolin Gene[ J] . The Plant Cell, 1989, 1( 9 ) : 839 - 853
[ 19 ] Yang N S, Christou P. Cell type specific expression of a CaMV
35S-GUS gene in transgenic soybean plants[ J] . Developmental Ge-
netics, 1990, 11 ( 4) : 289 - 293
[ 20] Torres-schumann S, Ringli C, Heierli D, et al. In vitro binding of
the tomato bZIP transcriptional activator VSF-1 to a regulatory ele-
ment that controls xylem-specific gene expression. [ J] . The Plant
Journal, 1996, 9( 3) : 283
[ 21] Keller B, Baumgartner C. Vascular-specific expression of the bean
GRP 1. 8 gene is negatively regulated[ J] . The Plant Cell, 1991, 3
( 10 ) : 1051 - 1061
[ 22] Hatton D, Sablowski R, Yung M H, et al. Two classes of cis se-
quences contribute to tissue-specific expression of a PAL2 promoter
in transgenic tobacco[ J] . The Plant Journal, 1995, 7( 6) : 859 -
876
381