全 文 ：第2 卷 第 2 期
1 9 8 9 年 4 月
林 业 科 学研 究
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人参组织和细胞培养的研究 I 。影响愈伤组织中
人参皂贰生物合成的因素
蒋 晶 王敬文
(中国林业科学研究院亚 热带林业研究所 )
关锐词 人参 , 愈伤组织 , 皂武 , 生物合 成因素
引 言
自从 19 5。年A r re g ni n 和 Bo n n er 以生产橡胶为目的培养橡胶愈伤组织 , 特 别 是 细 胞液
体培养成功以来 , 随着近代生物技术的发展 , 利用植物组织和细胞培养物生产化学物质越来越
受到人们的重视。 尤其是利用药用植物的组织和细胞培养物来生产其药效成份 , 更 引起各国
的极大关注 , 致使它发展成为植物组织培养在生产应用上的两大主流之一 〔‘1。 正如各国学者
们所评论的 , 这种技术在工业上生产有用的自然物质有着无限的可能性 [’J , 有可能发展成为
新兴的产业部门。
人参是我国著名的贵重药材 , 早在1 9 6 4年罗士苇等就报道了诱导出 愈 伤 组 织 , 以后 日
本 、 美国 、 德国 、 苏联、 印度等国也开展了人参组织培养的研究工作 , 其中较 为 成 功的是
Fu r u ya 等人的研究L3 , ‘〕。根据他们的专利及发表的论文 , 粗人参皂 试 的含量 , 以干物重为基
础 , 在愈伤组织 (2 1 . 1 % )、 冠痪组织 (19 . 3 % )及再分化根 (27 . 4 % ) 中都显著地高于天然根
(4
.
1 % )
。
国内近年来相继开展 了人参组织培养的研究工作 , 大多以品种改 良为目的 , 以生产药效
成份为目的的研究工作公开报道甚少。 人参皂试是在人参活细胞中合成的 , 人参细胞培养物具
有它们“母株”植物合成皂贰的能力 , 这种合成人参皂贰的生化过程是受细胞的生理状态和外
界环境影响的 。 本文报道各种培养因素对人参愈伤组织细胞合成和积累人参皂试的影响。
材料和方法
人参材料和培养方法同前文〔‘ ]。
人参皂武的分离和制备 人参皂试的分离和制备按逢焕诚法【“’。 将人参培养物 在10 5 ℃
灭活 10 m in , 然后于60 ℃烘干 , 研磨成粉 。 精确称量人参培养物粉末 , 加入 10 倍量的乙醚 , 加
热回流三次 , 弃去乙醚提取物得脱脂人参培养物粉末。 然后加入 10 倍量甲醇 , 水浴回流 4 次 ,
个文 于1 9 8 8年 7 月 7 口收到 。
2 期 蒋晶等 : 人参组织和细胞培养的研究亚 . 影响愈伤组织中人参皂试⋯⋯ 1的
每次 4 h , 合并 甲醇提取液 , 于60 ℃条件下 回收甲醇 , 得甲醇膏状物 。再加入样品 2 倍 量的
蒸馏水溶解膏状物 , 过滤后弃去不溶物 , 滤液中加入等体积用水饱和的正丁醇萃取 6 次 , 合
并正丁 醇液 , 减压回收正丁醇 , 即得人参总皂试粗制品。 取人参总皂试粗制品用少量 甲醇溶
解 , 加入到约10 倍体积的丙酮中 , 析出黄白色沉淀 , 滤集沉淀物 。 丙酮母液经回收丙酮后 ,
残留物再用少量甲醇溶解 , 再倾入新丙酮中 , 又析出沉淀 。 如此重复 3 次 , 合并滤集的黄白
色沉淀物 , 减压干燥即得精制人参总皂试量 。
实 验 结 果
(一 ) 外植体
人参皂贰普遍存在于人参植株体内 , 但根 、 茎 、 叶等不同器官其含量差异很大〔’] 。 而 由
根、 茎 、 叶外植体所诱导的愈伤组织 , 在同样条件下 培养 40 d , 其人参皂试的含量却是基本
相同的 , 都显著高于“母株”体上的含量 (表 1 ) 。 当把从各种外植体诱导 出的愈伤组织诱导分
化出再生根时 , 再生根的人参皂贰含量又显著高于愈伤组织中的含量 (表 1 )。
(二 ) 2 , 4一 D 浓度 , , . ‘ , 。二、 * , ‘ . ,、一 产 ‘ , 性一 LJ 堆派 表 1 人参不同外植体来源的愈伤在培养基中添加植物激素 , 实验表明所 ‘ 二 . 二 , . ‘ 。 二‘ ,二。 , 卜二二 ‘, 、二、。 , , 大二二二川 组织和再生根的皂贰含量试验过的几种激素中只有 2 , 4一 D 与人 参 皂
贰的生物合成有密切的关系。在 无 2 , 4 一 D 培
养基上人参培养物生长缓慢 , 人参皂试含量
很低 ; 随着培养基中2 , 4一 D 浓 度 的增高 , 皂
俄含量也 随 之 增 高。 当 2 , 4一D 浓 度 达 到
Z m g / L 时 , 尽管培养物 生 长有 所 减弱 ,
而人参皂试含量还是略有增加。 实验结果表
明 , 使人参愈伤组织获得最大生长量和最大
皂贰量的培养基 最 适 2 , 4 一D 浓 度 为 。. 5一
1
。
o m g / L (表 2 )。
(三 ) 光照
不同的光照强度对人参培养物的生长和
人参皂贰的积累 , 影响是不同的 。 在黑暗条
件下人参愈伤组织能够生长 , 组织细胞中也
能合成和积累少量皂贰 ; 随着光强的增加组
织生长越发旺盛 , 人参皂俄含量 大 幅 度增
外 植 体 种子 根 茎 叶 再 生 根
皂贰含量 (% ) 1 5 . 2 17 . 4 1 6 . 7 1 7
表 2 2 , 4 一D 浓度对人参培养
物皂俄含量的影响
U一O土一O2
,
4
一D 浓度
( m g / L)
0 5 } 0
.
1 { 0
.
2 一0 . 5
。」3 ·
皂贰含量
( % ) i
。一⋯。一 ) 3 一{1。一{1 7一
注 : 培养4 0 d 。
表 3 光照对人参培养物皂贰含量的影晌
光照强度
( lx )
黑暗 { 5 0 0 {1 0 0 0 12 0 0 0 {5 0 0 0 1 0 0 0 0
皂瑟量 卜 7 } 8 · 2 , , 4 · 8 ⋯, ”· 6 ⋯‘3 · 3 1 8 ·
加 。但光强超过5 0 o lx , 组织生长受到抑制 , 相应地人参皂试含量也下降。 在2 0 0 lx 光照条
件下可获人参皂贰最大产量 (表 3 ) 。
(四 ) 人参培养物的生长和皂俄含量的变化
在固定培养基上培养人参愈伤组织 , 每隔 s d 取样测定其生长量 , 同时测 定 皂 贰 的 含
量。 测定结果表明 , 人参愈伤组织皂贰含量的变化是与生长量的增大相并行的 , 当培 养40 d
的组织块停止生长时 , 其皂贰含量也增加到最大值 (见图 ) 。
2 0 0 林 业 科 学 研 究 2 卷
10 1
(五 ) 无 2 , 4 一 D 细胞系的驯化培养
作为药物使用时 , 人参培养物应该不含
有 2 , 4 一 D 成分 , 或使其残 留 量 减少到最 低
限度 。在 M S 培养基中逐步 减 少2 , 4 一 D 的添
加量 , 对人参愈伤组织进 行 无 2 , 4一 D 驯 化
培养 , 经1 8 代驯化培养后能够获得在无 2 , 4
一D 培 养基上正常生长的无 2 , 4一 D 细胞系 ,
但其人参皂试的含量低于 需 2 , 4 一D 细 胞 系
的含量 (表 4 ) 。 另一方面 , 把无 2 , 4一 D 细胞
系在逐步增加 2 , 4 一 D 含量的培 养基上继 代
培养 , 其合成和积累皂贰的能力又可重新恢
复到原来的水平 (表 5 )。
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人参培养物的生长和皂 贰含 t 变化 图
表 4 人今无 2 , 4 一D 细饱系的驯化培养
2 , 4
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D 浓度
( m g / L )
皂贰含 t
( % )
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{
第
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1
一
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衰 5 2 , 4 一D对人 , 无2 , 4 一D 细胞系皂俄含 , 的刺激作用
2
,
4
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(m g / L )
皂武含盆
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继 代 , 第 O 代
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讨 论
(一 ) 许多种药用植物在人工培养条件下能够象在其 “母株”上那样具有合成和积累 药 效
成分的能力 , 这就表现出了培养细胞的药物生物合成的全能性。 由不 Ib1 器官作外植体诱导的
人参愈伤组织培养物保持了合成人参皂试的能力 , 尽管少、参植株的 各个器官合成人参皂贰的
能力差别很大 , 但经脱分化诱导形成的愈伤组织合成人参皂试的能力却是大致相同的 , 而且
都比 “母株”上各器官的合成能力更强 。 这不仅证明了人参细胞合成皂试的全能性 , 而且也表
明培养条件更适合这种合成能力的表达 。 人参植株各器官经脱分化后形成的愈伤组织保持了
合成皂试的能力 , 经过诱导进行了再分化而形成的再生根不仅仍保持着这种合成能力 , 而且
这种能力又进一步被强化 , 使之超过了原器官和愈伤组织的合成能力 。 另一方而也有不少报
道 , 相当数量的重要的药用植物在其人工培养细胞中完全不存在药用成分 , 或者是其药用成
分在培养物 , },存在与否仍含糊不清。 一般认为生物碱特别难以通过细胞培养物米生产 , 其原
2 期 蒋晶等 : 人参组织和细胞培养的研究 亚 . 影响愈伤组织中人参皂试⋯ ⋯ 201
因尚不清楚 , 对某些生物碱来说可能是由于生物合成途径中某一专一反应步骤受到代谢上的
阻断 , 致使生物碱的生物合成减少或不能合成 。
(二 ) 生长调节剂不仅影响培养细胞的生长和分化 , 而且也影响次生代谢 。它们对次生代
榭的影响 随代谢产物的种类而有很大变化。 实验表明 , IA A 、 N A A 和K T 、 6一BA 对人参培
养物的生长有影响 , 而对人参皂贰的含量没有什么显著影响 , 只有 2 , 4一 D 不仅影响人参培养
物的生长和分化 , 而且也影响皂贰的合成和积累 。 逐步减 低 2 , 4一 D 添加量继代培 养人 参 细
胞 , 人参细胞能够被驯化在 无 2 , 4一D 培 养基上生长 , 但合成皂贰的能力明显下降了。 在逐
渐增加2 , 4一 D 浓 度 的培养基上继代培养 , 培养物的生长量有所增加 , 合成皂 贰的 能力逐步
增强 , 最后恢复到原来的水平 。 这表明无2 , 4一D 驯化培 养所获得的细胞系不是突变型 , 而是
一种生理适应过程。
参 考 文 献
【1 〕罗士韦 , 1 9 7 8 , 植物组织与细胞培养研究工作的进展及 应用 , 植物生理学报 , 4 (1 ) : 91 一1 1 2 。
[ 2 〕M is a w a , M ‘ , 1 9了7 , P la n t T is s u e C u lt u r e a n d Its B io 一T e e h 几 o lo g ie a l A p p lie a t io n , i 7we 2 6 .
〔3 〕Fu r u y a , T . e t a l . , 1 9 7 3 , C h e m . a n d Ph a r m . , B u lle t . , 2 1 (1 ) 一 。8一1 03 。
〔4 〕 Fu r u y a , T . e t a l . , 1 97 3 , C u lt u r e o f G in s e n g e e ll, J a P a n . Pa t e n t A p p l . , 沁 4 5一3 1 9 1 7 。
【S 〕蒋晶等 , 1日8 8 , 人参组织与细胞培养的研究 工 . 环境因子对人参愈伤组织生长 的影响 , 林业科学研究 , 1 (6) : 6 81
一6 8 6 。
〔6 〕逢焕诚 , 1 9 56 , 人参 , 科学普及出版社 , 6 50
〔7 〕逢焕诚 , 1 9 8 6 , 人参 , 科学普及出版社 , 8 70
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