全 文 ： 1998—01—02收稿。汪建亚工程师(湖北省林木育种中心 武汉 430079) ;河野耕藏(日本林木育种中心长驻湖北专家)。
* 本项目为日本政府无偿援助中国的专项技术合作项目,合作时间 1996～2001年。
1)湖北省林业厅.湖北省林木种质资源. 1993.
猕猴桃的组织培养及繁殖能力的研究*
汪建亚 河野耕藏
摘要 以猕猴桃的顶芽作外植体进行离体培养, 芽分化率最高, 为 79. 1% , 其次是侧芽和茎
段, 两者的芽分化率分别可达 45. 8%和 24. 4% ,叶片的芽分化率为 0。以顶芽为外植体, 在添加 1. 5
mg / L BAP 和 0. 2 mg/ L NAA , N 素减半的改良 MS 培养基上进行芽分化和继代培养,芽分化率可
达到 97. 7% , 在继代培养中补充 10 mg / L 的谷氨酸盐,可大大提高继代增殖系数 1 ,到第三次继代
时, 1 可达到 127. 5, 而此时对照的的 1仅为 12. 7。以 N 素减半或 N 素及 Fe 盐减半的 MS 培养基
作生根培养基, 生根率均可达 100% ,比对照提高 30% , 平均根长分别比对照长 4. 2 cm 和 7. 1 cm ,
开始生根时间分别比对照早 3 d 和 6 d; 在生根培养基上添加 3%的活性炭可以进一步提高生根长
度, 缩短生根时间。研究认为繁殖系数 是衡量一个外植体可繁殖成多少苗木的主要指标, 本试验
中 = 101, 即一个外植体可繁殖 101 棵苗。
关键词 猕猴桃 组织培养 培养基 繁殖系数
猕猴桃( A ctinidia chinensis Pl )是原产我国的野生藤本果树,属猕猴桃科( Act inidiaceae)
猕猴桃属( A ctinidia)。在猕猴桃属 70多个品种中, 目前广泛栽种的仅有几种 [ 1]。长江三峡猕猴
桃是湖北省特有的品种之一,是湖北省宝贵的种质资源,其果实中维生素 C 的含量高于中华
猕猴桃和美味猕猴桃1)。丁士林等[ 2]、朱道街[ 3]、刘翠云等 [ 4]曾对美味、软枣、哑特猕猴桃的组织
培养方法进行了研究。为进一步提高组织培养的繁殖系数,降低成本,作者对继代培养中添加
有机物谷氨酸盐作了研究, 特别是对前人未系统研究过的衡量繁殖能力大小的指标进行了较
深入研究。现报道如下。
1 材料和方法
1. 1 材料的处理
原始外植体选自生长于湖北省林木种苗管理站苗圃的8年生长江三峡猕猴桃优株。在 11
月份,选取健康、生长旺盛的当年生新梢, 长约 30 cm , 粗 1 cm 的枝条(含顶芽或侧芽) , 放入
100 mg/ kg 浓度的 BAP 溶液里,在室内浸泡 3个星期。每星期换水1次,至重新萌芽。剪取新
萌芽条,先用清水反复冲洗 2～3次, 然后用 70%的酒精消毒 2 min,再用 6%的双氧水消毒 15
min。由于猕猴桃叶、茎段及芽有很多毛,要边消毒边用磁力搅拌器搅拌。最后再用无菌水冲洗
3～4遍。
1. 2 接种及培养
所有供试的培养体均接种在 250 mL 的三角瓶中, 放在温度为 24～26 ℃、光照强度为
林业科学研究 1998, 11( 6) : 635～639
Forest Research
3 000 lux, 每日光照时间为 15 h 的培养室中培养。
原始外植体经接种培养后, 剔除发霉和不萌发的,选取已萌发并形成内生愈伤组织的培养
体作试验材料,继续继代培养。
1. 3 培养基的制备
实验以 BTM [ 5]、GD [ 6]、MS [ 7]以及改良 MS 为基本培养基, 分化试验补加 1. 5～2. 5 mg/ L
BAP、0. 2 mg/ L NAA 以及 0. 1 mg / L IBA、1. 5 mg/ L IAA 等,在继代培养中补加谷氨酸盐
( Glutam ine) 12 mg / L 以及琼脂 0. 8%,蔗糖 3%。生根试验补加 0. 1 mg / L NAA、活性碳 3%
以及琼脂 0. 8%、蔗糖 3%, 培养基的 pH 值均调至 5. 8,按常规法消毒。
1. 4 繁殖系数的计算
全部试验重复 3次,观测值取平均值。为衡量一个外植体在一年中繁殖能力的大小,作者
提出了繁殖系数( )这个概念。= 1×2×F
( 1) 1= K 1×b ( b= a1×a2×a3×⋯×ai⋯×an, n为继代培养次数)
( 2) K 1= h1×( 1- f 1)
( 3) 2= K 2×e
( 4) K 2= h2×( 1- f 2)
总算式: = h1×( 1- f 1)×( a1×a2×a3×⋯×ai⋯×an )×h2×( 1- f 2 )×e×F
式中 1为继代增殖系数, 2为生根增殖系数, 1、2反映继代或生根培养时增殖的大小,其数
值越大,说明增殖效果越好; a i 为每次继代的增殖率; b 为多次继代的增殖率; K 1 为继代培养
中的环境影响, K 2 为生根培养中的环境影响,主要是指在操作过程中人为及设备因素造成的
污染及对苗木质量的影响; h1为继代培养的壮苗率, h2为生根培养的壮苗率; f 1为继代培养的
污染率, f 2为生根培养的污染率; e为生根率; F 为健化成苗率。
2 结果和分析
2. 1 不同外植体对芽分化的影响
顶芽和侧芽在接种一周内,体积增长缓
慢,一周后增长加快, 18 d 后, 有的侧芽出现
延长生长,逐渐形成独苗。接种 21 d 后,顶芽
和侧芽开始分化, 在原来的芽体上形成了丛
生芽,芽的数量从 3到 11个不等。从顶芽和
侧芽的分化情况来看,两者的分化率相差很
大, 在相同的培养基上, 顶芽的分化率为
79. 1% ,侧芽的分化率为 45. 8%。不同外植
表 1 不同外植体的分化情况
项 目 外植体种类顶芽 侧芽 茎段 叶片
接种材料数(个) 86 120 120 52
产生愈伤组织的材料数(个) 8 75 36 8
产生芽分化的材料数(个) 68 55 11 0
芽分化率( % ) 79. 1 45. 8 24. 4 0
注:培养基为 MS+ 1. 5 mg/ L BAP+ 0. 2 mg/ L NAA
+ 3%蔗糖。
体的分化情况从表 1可以看出,在本试验的条件下, 外植体的分化能力以顶芽为最高,其次为
侧芽,再次为茎段,叶片未出现芽分化。从大量繁殖的目的来看,顶芽不仅分化率高,且容易成
苗,在遗传上又能保持母本的优良特性,因而做试材最为理想。
2. 2 不同激素对芽分化的影响
以顶芽为试材,在 MS中补加不同激素,以探讨激素对芽分化的影响。结果从表 2可以看
出,激素对芽的分化起重要作用。在不含激素的培养基上,材料不能分化,仅有部分出现生长,
636 林 业 科 学 研 究 11 卷
且两周后,逐渐黄化枯死。在含激素培养基上, 材料出现了不同程度的分化和生长。其中, NAA
效果比较好, 只要含量适当,就能获得较高的分化率。IAA 诱导分化的效果较差。IAA 是一种
天然生长素,不稳定容易分解, 效果欠佳。以BAP 与 NAA 组合比较好。但 BAP 含量过高时,
分化效果明显降低, 当 BAP 的含量为 2. 5 mg/ L 时, 分化率仅为 10%～30% ,以 1. 5 mg/ L
BAP 和 0. 2 mg / L NAA 组合效果比较理想,分化率可达到 70% ,较高时可达 79. 1%(表 1)。
表 2 激素对芽分化的影响
项 目
激 素 配 比 ( m g/ L)
对照 BAP 1. 5
NAA 0. 2
BAP 2. 5
NAA 0. 2
BAP 1. 5
IBA 0. 1
BAP 2. 5
IBA 0. 1
BAP 1. 5
IAA 1. 5
接种材料数(个) 10 10 10 10 10 10
产生芽分化的材料数(个) 0 7 3 5 1 2
分化率( %) 0 70 30 50 10 20
2. 3 培养基对芽分化的影响
以顶芽为试材, 在 BT M、GD、MS 以及
改良 MS (氮元素减半)为基本培养基, 补充
1. 5 mg / L BAP 和 0. 2 mg / L NAA, 进行了
接种试验,弄清了不同培养基对芽分化的影
响。结果从表 3可以看出, 氮元素含量偏高
表 3 培养基对芽分化的影响
项 目 培 养 基
BT M GD M S 改良 M S
接种材料数(个) 18 19 21 45
产生芽分化材料数(个) 5 2 14 44
分化率( % ) 27. 7 10. 5 66. 7 97. 7
的MS 以及偏低的BTM、GD培养基效果差,而以氮元素含量适中的改良 MS 培养基效果比较
好,诱导率可达 97. 7%。
2. 4 谷氨酸盐(Glutamine)对继代增殖系数的影响
在多次继代中,芽分化出现了衰退现象。为避免衰退,提高芽分化率,在含有 1. 5 mg/ L
BAP 和 0. 2 mg/ L NAA 的改良 MS培养基的基础上, 再添加不同用量的谷氨酸盐, 以顶芽为
材料,进行接种。其结果从表 4可以看出, 在第一次继代培养中, 含谷氨酸盐和不含谷氨酸盐
表 4 谷氨酸盐对芽分化的作用
各次继代
的繁殖率
谷氨酸盐( mg/ L)
对照 5 10 15
a1 4 4 6 4
a2 2 2. 2 5 4
a3 1. 86 2 5 3
增殖系数 1 12. 7 15. 3 127. 5 40. 8
注: 本试验初步定污染率 f 1 = 16% ; 壮苗率 h1 =
94. 4% ,即 K 1= 0. 85。
的培养基对芽分化影响基本上无区别。但在
第二、三次继代培养中相差很大, 在含 10
mg / L 谷氨酸盐的培养基上, 到第三次继代
时,增殖系数( 1 )可提高到 127. 5,而在不含
谷氨酸盐的培养基上,到第三代继代增殖系
数( 1)仅为 12. 7。
2. 5 培养基对生根的影响
为探讨培养基、活性炭等对猕猴桃生根的综合影响,作者设计了以下 6 种培养基,进行了
生根培养:
培养基 A: M S+ 0. 1 mg/ L NAA
培养基 B: MS(氮素减半) + 0. 1 mg/ L NAA
培养基 C: M S(铁盐和氮素减半) + 0. 1 mg / L NAA
培养基 D: MS+ 0. 1 mg / L NAA+ 活性炭 3%
6376 期 汪建亚等: 猕猴桃的组织培养及繁殖能力的研究
培养基 E: M S(氮素减半) + 0. 1 mg / L NAA+ 活性炭 3%
培养基 F: MS(铁盐和氮素减半) + 0. 1 mg / L NAA+ 活性炭 3%
以上培养基均加琼脂 0. 8%,蔗糖 3% , pH 调到 5. 8。
表 5的结果表明,在氮素减半或铁盐和氮素减半的 MS 培养基(培养基 B、C 组)上,生根
率可提高到 100%, 比对照(培养基 A 组)提高了 30%左右。平均根长分别比对照长4. 2 cm 和
7. 1 cm;开始生根时间分别比对照早 3 d 和 6 d。添加活性炭与否,对生根率没有大的影响,但
可以大大缩短生根时间及促进根的生长。添加 3%活性炭的培养基D、E、F 组比未加活性炭的
培养基 A、B、C 组平均根长长 2. 5～6. 1 cm, 开始生根时间缩短了 2～6 d。根在黑暗的环境里
生长良好, 活性炭刚好提供了这种环境,所以有利于促进根的生长[ 8]。同时, 它还具有吸附作
用,可以吸附植物生根时相互产生的抑制物质, 以利于缩短生根时间。
表 5 不同培养基上生根状况
培养基 接种材料数
(个)
生根材料数
(个) 平均根长( cm)
生根率
( % )
开始生根时间
( d)
A 15 10 18. 1 66. 7 22
B 12 12 22. 3 100 19
C 15 15 25. 2 100 16
D 13 11 20. 6 84. 6 17
E 17 17 28. 4 100 17
F 14 14 31. 2 100 10
2. 6 试管苗的移栽
当试管苗生出完整的根系之后, 在培养室内揭开盖子,放置 3 d后,移到温度在 10～16 ℃
的温室里。3 d后,取出试管苗, 用毛笔轻轻洗掉粘附在根上的琼脂,测量其主根和侧根长度之
后,移栽到珍珠岩(使用前一周用 0. 1%波尔多液消毒)的扦插池里,此后 14 d 的管理非常重
要,这是试管苗能否成活的关键。这个阶段需要较高的湿度和良好的通风条件。为此,扦插池
需盖上塑料薄膜以保持空气湿度。根据干燥情况,每天喷雾 2～3次。两周后移植到大田。移
到大田后,要特别注意防止病害发生, 每隔一周要用 0. 1%波尔多液消毒一次, 直到小苗健壮
成活。本试验移苗 79棵,成苗 75棵,成活率为 94%。
2. 7 繁殖能力的分析
在继代培养中,第一次的最高增殖率 a1= 6,第二、三次的最高增殖率分别为 a2= 5, a3= 5,
所以,在继代培养中最高的继代增殖系数 1= 1×b= 0. 85×6×5×5= 127. 5(详见表 4)。
在生根培养中, 最高生根率 e= 100% ,根据实际操作经验, 确定生根培养的污染率 f 2=
15%, 生根壮苗率 h2= 100%,所以生根增殖系数 2= K 2×e= h2×( 1- f 2 )×e= 100%×( 1-
15%)×100% = 0. 85。
在健化中,成活率 F= 94%, 所以,繁殖系数 = 1×2×F= 127. 5×0. 85×94% = 101。即
一个外植体在三次继代培养后最高可繁殖出101个外植体。有了这个系数作参考,根据每年需
要的苗木数量,即可计算出开始所需外植体数量。
3 讨 论
通过本研究认为, 在继代培养中,添加一定量的谷氨酸盐,可明显促进不定芽的分化,提高
638 林 业 科 学 研 究 11 卷
增殖率。特别是通过对繁殖系数的计算, 可以掌握繁殖能力的大小,检验配方、试验操作的合
理程度。但在组织培养的实际应用中,成本和利润的核算,是衡量成功与否的关键之一,所以,
繁殖系数 达到多少可以盈利,还需进一步进行研究。另外,在本试验中还发现,猕猴桃的愈伤
组织比较容易诱导,如能通过愈伤组织→不定胚→苗或愈伤组织→苗的培养,将会进一步提高
繁殖系数 ,降低成本。
参 考 文 献
1 梁畴芬.中国猕猴桃属分类志要.广西植物, 1930, ( 1) : 30～35.
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3 朱道街.软枣猕猴桃叶片愈伤组织分化再生植株.植物生理学通讯, 1997, 33( 2) : 127～128.
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Research on Tissue Culture and Reproductive
Capacity of Actinidia chinensis
Wang Janya K ounou K ouz ou
Abstract On the test o f tissue cultur e, using shoot t ips o f A ctinidia chinensis as ex-
plant , the highest rate of shoo t dif ferent iat ion is 79. 1%, and the shoot differ ent iat ion rate o f
lateral shoo t and stem are respect ively 45. 8% and 24. 4%, and the shoot different iation rate
of blade is 0% . On the test of shoot dif ferentiat ion and subculture, using shoot t ips as ex-
plant , and the improved MS culture medium by increasing 1. 5 mg / L BAP and 0. 2 mg/ L
NAA, and half decreasing N element , the rate of shoot dif ferent iation can reach 97. 7%. It
can obv iously impr ove the coef f icient 1 o f subculture to add 10 mg / L glutamine on the test
of subcultur e, w hen it comes to the third t ime of subculture, 1 can get to 127. 5, how ever the
check 1 is only 12. 7. Taking M S culture medium on half decreasing N element or N element
and Fe salt as taking ro ot culture medium, the roo ting rate can get to 100% , which increases
30% more than the comparison. The average roo t length are respectiv ely 4. 2 cm and 7. 1 cm
longer and the root ing time ar e respect iv ely 3 day s and 6 days ear lier than those o f the com-
parison. Adding 3% act ive carbon to roo ting culture medium can further incr ease the root
leng th and sho rten the root ing t ime. T he r esearch ho lds that reproductive coeff icient is the
main index to measur e how many plant ing stock one explant can reproduce. It is = 101 on
this test , w hich means that one explant can r eproduce 101 plant ing stock.
Key words A ctinidia chinensis t issue culture cultur e medium repr oduct ive coef fi-
cient
Wang Jianya, Engineer ( Hub ei Provin ce Fores t T ree Breeding Cen ter Wuhan, Hubei 430079) ; Kounou Kouzou
( Japan Forest T ree Breeding Center) .
6396 期 汪建亚等: 猕猴桃的组织培养及繁殖能力的研究