全 文 ：第 1 卷 第 6 期
1 9 8 8 年 12 月
林 业 科 学研 究
FO R E S T R E S E A R C H
V o l
。
1 , N o
.
6
D e e
。 , 1 9 8 8
人参组织和细胞培养的研究 1 . 环境因子
对人参愈伤组织生长的影响
蒋 晶 王敬文
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所 )
关健词 人参; 愈伤组织 ; 环境 因子 ; 生长速率
人参(P砚ax g in 二: g )是我国传统的名贵药材 , 不仅在临床医学上用于治疗多种疾病 , 而
且在保健食品 、 保健饮料中的应用也越来越广泛 。 随着人们生活水平的提高 , 对人参的需求
量也越来越大。 由于人参栽培需要特殊的气候、 土壤条件 , 我国只在部分地区种植 , 而且需
要种植 5 一 6 a 才能收获 , 年产量不能满足人们的需求。 为了改进人参药材的品质和增加市
场供应量 , 有必要利用近代生物技术开展人参组织和细胞培养 的研究 , 探讨人工培养工业化
生产人参的技术路线 。
早在60 年代我国罗士韦〔‘1从人参叶柄成功地诱导 出愈伤组织。 70 年代 以来 , 国外已进行
了人参细胞悬浮培养的研究 , 日本明治制药厂甚至在1 3 0 6 0 L 大罐中成功地进行了大规模培
养 , 但由于植物细胞大规模悬浮培养还存在若干难以克服的困难 , 实施商业化生产仍属将来
的问题 , 许多研究者重又转向固相一气相培养和液相一气相培养的研究 。 在此同时国内也陆
续开展了人参组织培养的研究 , 其主要目标是利用组织培养术改 良品种 , 个别单位进行了人
参悬浮细胞培养的研究 , 试图探索悬浮培养工业化生产的途径 , 取得了一定的进展 。 应用固
相一气相培养的方式来探讨工业化生产的技术路线的研究尚未见详细报道 。
一 、 材料和方法
人参 (p曲ax g 认se ng )种子购自黑龙江省宁安县江山娇实验林场 。 干燥种子用 1 0 0 p p m
赤霉素水溶液20 ℃浸种72 h , 然后埋藏在湿砂中 8 一10 ℃催芽45 d 。 种子萌发至种壳裂口
露白时 , 取一部分作为接种材料 , 其余的种植于湿润砂中 , 在10 一15 ℃下继续发芽。 当其幼
根长至 3 c m 时 , 取一部分种子的初生根为接种材料。待苗长至 6 一 8 c m 时 , 取其幼茎 、 叶片
为接种材料。 将已取好的外植体先用自来水冲洗干净 , 再用肥皂粉液洗涤。 冲净残留肥皂粉
后 , 在无菌条件下 , 于70 % 酒精中漂洗20 5 , 冲洗掉酒精 , 再放入 O。 5 % 升汞中消毒 3 m in ,
用无菌水洗涤三次 , 三次洗涤时间共计不短于 10 m in , 消毒后的材料可用于接种培养。 基本
培养基组成如下 : M g SO ; · 7 H : 0 3 7 0 m g / L 、 C a CI: · ZH : 0 4 4 0 m g / L 、 K N O : 1 9 0 0 m g / L 、
N H
‘
N O
: 1 6 5 0 m g / L
、
K H
:
PO
‘ 1 7 0 m g / L
、
Fe SO
; · 7H
:
0 2 7
.
8 m g / L
、
M n SO
‘ · 4 H IO
本文于1 9 8 8年 4 月1 1 日收到。
6 8 2 林 业 科 学 研 究 1 卷
2 2
.
3 m g / L
、
K l o
.
s m g / L
、
Co CI
: · 6 H
:
0
·
o
.
o 2 5 m g / L
、
Z n SO
‘ · 7 H 2 0 s
.
6 m g / L
、
C u S O
; · SH : 0 0
.
0 2 m g / L
、
H 3B O
3
6
.
2 m g / L
、
N a
Z
M o O
‘· 2H
2
0 o
.
2 5 m g / L
、 甘氨酸 Zm g / L 、
肌 醇 1 0 0 m g / L 、 V . B ; 0 . 1 m g / L 、 V . B . o . s m g / L 、 烟 酸 o . s m 虾L 、 2 , ’峨一D 0 . 0 1一s
m 岁L 、 6 一B A 0 . 0 1一2 m g / L 、 蔗糖 5一 5 0 9 / L 、 琼脂 1 0 9 / L , PH 6 . 5 。 培养基经 l . Z k好
c m
Z
30 m in 高温灭菌后 , 在无菌条件下接种。 培养温度16 一35 ℃ , 光照 。一2 0 0 0 0 lxo
二 、 实 验 结 果
1
. 外位体 人参的萌发种子 、 初生根 、 幼茎和叶片都可以诱导出愈伤 组 织 (表 1 ) , 诱
导率以幼茎为最高 , 叶片最低 。 幼茎开始形成愈伤组织的时间比其他外植体早 , 在激素浓度
2 , 4一 D Z m g / L
、
6一B A l m g / L 条件下 , 接种的幼茎 5一 7 d 即见有膨大的愈伤组织出现 ,
而接种的种子约在14 d 后才形成愈伤组织 。 从不同外植体诱导出的愈伤组织 , 其颜色、 质地
有所不同 , 生长速度也有快慢。 幼茎的愈伤组织生长快 , 幼根和叶片的愈伤组织生长慢 , 生
长快的愈伤组织继代培养效果良好 , 生长慢的不宜作继代培养的起始材料。
衰 1 不同外植体诱导的愈伤组奴
! 接 种 致外 植 体 1
1 (个 )
形 成 愈 伤
组 织 效
诱 导 串
(% )
愈伤组织颇色 盒伤组织质地
脆致黄 密松一拐
黄一黄
米 货
黄一绿
松掩 、 枯.
密 致
.⋯自O内J,人‘工.匕只q.几J, .山‘,d自七只目。曰且.上,占子 } 2 00生 根 } 2 0等 { 2 。。斤 . 名0 0
幼种初叶
2
. 减源 从幼茎诱导的愈伤组织在以蔗搪、 葡萄糖为碳源的培养基上生长 良好 , 碳 源
浓度和配比不同其生长速度有所不同 。 把正在旺盛生长的愈伤组织分割 成约 1 9 重的小块 ,
接种在试验培养基上 , 培养 6 周后取出测定其鲜重 。 实验表明 : 虽然单独用蔗糖 作 为 碳 源
时 , 3 %蔗塘最适 于愈伤组织生长 (表 2 ) , 但 3 %蔗糖与0 . 5 %葡萄糖相配伍使用作为碳源
时 , 则对愈伤组织生长更有显著促进作 用(表 3 ) 。
衰 2 不同浓度蔗旅对人今愈伤组织生长的形 ,
浓 度 ( % )
接种瓶数
最大鲜 , ( g )
平均鲜宜 ( g )
标准偏差
变动系数 ( % )
2 O 2 0 2 0
6
.
8 7
.
6 6
.
8
4
.
4 5
。
3 4
.
7
0
.
96 0
。
7 4 0
.
4 9
2 1
。
8 1 3
。
4 10
.
4
注 : 2 , ‘一 D i m g / l , 6 一 B A o . s m g / l, 培养 6 周 。
3
. 有机氮源 酪阮水解物 (美国 , Gi b co ) 、 牛肉浸膏 (中国 , 上海 ) 和大豆水解物作为有
机氮源 。 大豆水解物是 自制的 , 大豆粉经乙醚 脱 脂千 燥 后 , 以 4 N H cl 1 0 ℃ 回 流水解
4 h
, 滤去残渣 , 滤液用 N a 0 H 调 至中性 , 浓缩 、 干燥后备用。 在基本培养基中加入各种有
6 期
表 3
蒋 晶等 : 人参组织和细胞培养的研究 6 8 3
葡萄塘不同添加量对人参愈伤组织生长的影晌
0
。
1 0
。
5 1
.
0 1
。
5
接种瓶数
最大鲜重 ( g )
平均鲜重 ( g )
标准偏差
变动系数 (% )
2 0
7
。
4
5
。
0
0
.
6 8
1 3
.
6
2 0
6
。
7
4
.
6
0
.
8 5
1 8
。
5
2 0
_
5
。
2
2 0
4
.
6
4
.
3
0
。
5 2
1 2
。
1
一了
的舀自O斤Jno
.⋯
n六050八」,‘月二
注 : 蔗糖 浓度为 3 % , 2 , 4 一 D l m g /l , 6 一B A o . s m g /l , 培养 6 周 。
机氮源 , 在25 ℃每天 16 h 、 5 o 0 lx 光照下培养愈伤组织 。实验结果表明 , 大豆水解物对愈伤组
织生长有较好的促进作用 , 牛肉浸膏不仅不利于生长 , 而且有毒害作用 , 培养一周后组织块
发生褐变 , 继而黑变而死亡 (表 4 ) 。 .
表 4 不同有机N 派对人参愈伤组织生长的影响
{ ⋯最 大 鲜 重 ⋯平 均 鲜 重有 机 N 源 1 接 种 瓶 数 } , 、 {
{ } 戈g , { ‘g )
基杏烤费基 . _ _ ⋯ 2 “ ⋯ “· ‘ { 4 · 6
1 赞峥粤杏竺物 } 2 。 } 7 · ’ } ‘· g
1 赞矛里得竺. . 一 “。 ⋯ 一 } 一王 % 大显水解物 { “0 1 7 · 2 { 5 · 2
标 准 偏 差
变 动 系 数
(% )
::;
2 8
.
3
2 5
。
5
注 : 2 , 4 一D l m g / l , 6 一 BA o . s m g / l, 培养 6 周 。
4
. 温度 在恒温条件下培养 , 人参愈伤组织对 28 ℃以上的温度非常敏 感 , 30 ℃持续
培养一周后 , 生长停止 , 在 32 ℃时细胞开始死亡 , 而对较低的温度有较好的适 应 性 。 人参
组织生长的最适温度 为 20 一24 ℃ (表 5 )。 在较高温度下生长的愈伤组织色泽加重 变 褐 , 在
表 5 温度对人参愈伤组织生长的影响
;
,
_
、 二
}
, 。 ⋯ , 8 ⋯ 2。 { 2 2 { 2‘ ! 2。 」 2 , ⋯ 3 。
(℃ ) }
‘”
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}
“ ‘ ⋯ 一“ } “ ’ 一 “ ’ } “ “ }一 接种瓶。 一 ⋯2 0 1 2 。 ⋯2。 ⋯2。 ⋯2 0 1 2。 ! 2。 { 2。
最大些重 ‘g , { 堪· 8 } “· 2 1 7 · , { “· 7 ⋯ 7 · 0 1 “· 6 ! ”· 6 , 一平均鲜重 ‘g , 1 “· “ ⋯ ‘· 4 ⋯ ‘· 9 } 5 · 2 { ‘· 8 1 “· 7 } 2 · “ 」 一坪呼堡李 _ . _ ⋯ 。· 9 8 { ’· 2‘ ⋯ 1 · 2 5 】 。· 9 9 ⋯ 1 · 7 3 { 1 · 62 1 1 · , 1严砂系烈. (% ’: , r _ j Z , ·了 j “7 · s j “5 · 5 1 1 9 · 0 1 “6 · 0 1 毛‘· g : 1 “9 · “ : : _
注 : 2 , ‘一 D i m g / I, 6 一BA o . s m g / l, 每天 i 6 h 、 s 0 0 0 1x 光照下培养 6 周 。
最适温度下生长的其色泽为米黄色 , 质地松脆 。
5
. 光照 人参愈伤组织在暗培养中虽能够生长 , 但实验结果表明不同光照 强 度对其生
长有明显的影响 。 5 o 0 lx 以上的光强不利于愈伤组织生长 , 如果每天光照时间缩短为 s h 以
下 , 可以减弱高光强的不利影响。 实验中发现 , 在 2 o 0 lx 光强下间歇照光 (暗 :光 = 1 : 2 ) 最
适于人参愈伤组织生长(表 6 )。
6 8 4
表 6
林 业 科 学 研 究 1 卷
光照对人参愈伤组组生长的形晌
2 0 0 0 0 Ix 1 0 0 0 0 l
x
{ 5 0 0 0 lx 2 0 0 0 1: 1 00 0 1又
s h
}
, 。h
琳曰川周一接种瓶数最大鲜重 (g )平均鲜重 (g )标准偏差变动系致 (% ) 2 : . ,川注 : 2 , 4 一D 2 m g / I, 6 一 BA o . s m g / I, 2一℃培养 6 周 。6 . 激素 人参愈伤组织诱导和培养必须在基本培养基中添加植物 激 素 , 研究结果证明
只有 2 , 4 一 D 是必需的 , 其余几种激素对人参愈伤组织没有明显的作用 , 但 6 一 B A 可能在细
胞中起激素平衡的作用 , 对生长略有促进(表 7 )。 人参愈伤组织对 2 , 4 一 D 浓度变化不敏感 ,
在浓度相当宽的幅度内都能良好生长(表 8 ) , 2 , 4 一 D 浓度还与人参皂贰的合成和 积 累 有 密
切的关系(待发表) 。
衰 , 生长润节物质对人 , 愈伤组级生长的形晌
⋯接种瓶· ⋯’沙 ⋯‘粉 ⋯标准偏· ’黔燕然 6 一BA 1 m s/L )⋯:: ⋯:: ⋯翔 洲 拭
注 : 光照 Z 0 0 0 lx , 1 6 h , 2 4 ℃ , 培养 6 周 。
表 8 2 , 4 一 D 浓度对人参愈伤组织生长的影晌
浓 度 (m g / L )
接种瓶数
最大鲜徽 (g )
平均鲜重 (g )
标准偏差
变动系致 (% )
o
· ”5 1 ”· 2 } ”
· “ ⋯’· 。 l “· 0 3 . 0 1 5 . 0
2 。
}
2 “
2 0 2 0 2 0 2 0
·
1 ⋯ “· , 2 0 2 0
2
.
6 5
.
8 7
.
4
, “
}
“· 29 5 . 3 3 . 7
1
.
8 4
.
3 5
.
8
· “ ⋯ 1 · ,2 8 4 。 1 3 . 3
0
.
6 7 1
.
02 1
。
4 3
·
8 一 3 8 · 0 8 O 。 8 1 0 . 7 4
3 7
.
2 2 3
.
7 2 4
.
7 3 8
.
0 1 9
.
8 22
. 毛
注 , Z 0 00 lx , 1 6 h , 2 一℃ , 培养 6 周 。
7
。 生长 曲线 选取第二代培养 25 d 的愈伤组织块接种在含有 3 % 蔗 糖 + 。. 5 % 葡 萄
糖 、 1 m g / L Z , 4一 D 的基本培养基上 , 在24 ℃和 2 o0 lx 间 歇 光照下培养 , 定时取样测定组
织块的生长量 , 据此绘出生长曲线图。 从图 1 可以看出 , 组织块约经 5 一 6 d 的静止期后开
始缓慢生长 , 约10 d 后生长加速 , 进入对数生长期 , 约 30 d 后生长渐慢 , 40 d 后生长完全
停止 , 继而组织块自内而外 、 自下而上发生老化和褐变。
8
. 细胞悬浮培养 选取松脆的人参愈伤组织放入灭菌的液体基本培 养 基中 , 再加入经
超滤消毒的果胶酶 , 使酶浓度为0 . 5 % 。经振摇后细胞大部分由组织块脱落成单细胞和少量细
胞团 , 用1 2 0目尼龙滤布过滤去除大细胞团块 , 在显微镜下计数 (每毫升细胞数 , 10 个细胞以
6 期 蒋 晶等 : 人参组织和细胞培养的研究 6 8 5
下的细胞团按单细胞计数 )。然后接种到盛有 1 0 m l培养液的 250 m l三角瓶中, 使细胞起始
密度为1护个/ m l。 培养液中蔗糖浓度为 3 % , 2 , 4一D 浓度为 1 m g / L 。 在室 内 自然光 和 20
一25 ℃下振荡培养 , 每分钟在复振荡90 次 , 每两天取样测定培养液细胞密度。 悬浮 培 养 细
胞增殖变化为图 2 所示。
00八钊n9.8入2.36.541
侧教叻串喇州
1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2 36 4 0
培养时问( d )
人参愈伤组织生长过程
培养时问 ( d )
图 2 人参悬浮培养细胞增殖进程
三 、 讨 论
1
. 人参的萌发种子、 初生根 、 幼茎和叶片都能被 诱 导形成愈伤组织 。 叶柄也是诱导愈
伤组织常用的外植体材料〔”1。 幼茎所形成的愈伤组织生长迅速、 质地松脆 。 后来的研究结果
(待发表 )也发现 , 从质地松脆、 生长迅速的愈伤组织中很方便地筛选 到 快速 生长的细胞株
系 , 而且其人参皂试含量也较高 。
2
. 人参是喜阴植物 , 人参愈伤组织还保持着植株的习性 。较低温度和弱光强对愈伤组织
生长有利 , 较高温度 ( > 25 ℃ )和较强光强 ( > 2 O0 lx )对愈伤组织生长不利 。 但在连 续黑暗
中培养的愈伤组织不仅生长很差 , 而且其细胞中人参皂试含量也很低 (待发表 ) 。 可见 , 光照
是人参愈伤组织细胞生长和合成人参皂试的必要条件[.1 。
蔗糖和葡萄塘都是人参愈伤组织生长的良好碳源 , 尤其 3 %蔗糖与 0 . 5 %葡萄 糖 酗狂可
使愈伤组织生长更快 。 这主要是由于缩短了愈伤组织生长曲线中的静止期和滞缓期 , 从而加
速了生长进程。
有机N 源看来不是人参愈伤组织生长所必须的N 源。 国外一些实验室施用牛肉浸膏培养
人参组织 , 对生长有促进作用[s1 , 本实验中施用牛肉浸膏不仅不利于生长 , 甚至有很强的毒
害作用 , 这有可能是由于其中的防腐剂成分所造成的。
2 , 4一 D 是人参愈伤组织和悬浮培养细胞所必须的生长调节物质 , 而且 2 , 4一 D 的浓度 与
细胞中人参皂试的合成和积累密切相关(待发表 ) 。 在本研究中还发现在 2 m g / L 浓度下培养
的人参组织有少量根分化出来 , 但其生长量也随之减少 。在今后的研究中需要找出施用2 , 4一 D
的浓度临界值 , 以便既能促进组织生长 , 又能使细胞大量的合成积累有效成分(人参皂试) ,
一
巷一,二一6 8 6 林 业 科 学 研 究
而且又能最大限度地减少人参产品中的化学污染成分。 国外已有人进行人参无激素培养的驯
化研究l’] , 也有人设想把根癌杆菌 (A g : o吞a c te : fum t u 二。fa c fe , s ) 的生长因子转移到人 参细胞
中而不再添加生长调节物质 「‘1。
3
. 人参愈伤组织固相一气相培养和人参悬浮细胞液相培养 , 其生长进程基本是相同的 ,
生长曲线都可划分四个阶段 : 静止期、 滞缓期、 对数增长期 、 休止期 。 在固一气相培养中 ,
影响静止期、 滞缓期长短的因素 , 除培养条件外主要取决于所接种的起始细胞的生理状态 。
如果起始细胞是处于对数增长期的活跃生长的细胞 , 大约 10 d 就可度过静止期一滞 缓 期 而
进入对数增长期 , 如果起始细胞是早已进入休止期的细胞 , 那么静止期一滞缓期甚至可拖延
到 ZO d 之久。 在细胞悬浮培养中 , 影响静止期一滞缓期长短的主要因素是 接 种 细胞的起始
密度 , 如果起始密度低于某一临界值 , 甚至会使静止期无限地拖延下去直至细胞死亡 。
人参细胞悬浮培养可 以获得 比固一气相培养大得多的生物产量 。 在固一气相培养中培养
物重量在 6 周 内一般增重 4 一 5 倍 , 而在液相悬浮培养中20 d 内细胞数 增殖80 一 1 0 倍 。 但
由于大规模悬浮培养在技术上和经济效益上还有一系列需要克服的困难 , 距实行商业化生产
尚有相当一段距离 , 因而近期内研究人参组织固一气相培养的技术方法更具有现实意义 。
今 考 文 献
〔1 〕 梦士书等 , 19 6 4 , 植物生理学通讯 , ( 2 ) . 2 6.
[ 2 〕 Fu r o y a , T . e t a l. , 19 5 3 , E ffe e t , o f a u x in , o n g r o w t h a n d s a Po n in p r o d u e t io n in e a llu s
e u ltu r e s o f P a ”a x 夕‘月s e ”夕 . P la n t M e d le a . , 峨7 (3 ) : 15 3一i a 7 .
t 3 」 Fu r u g a , T . e t a l. , 19 73 , P r o d u e t io n o f G ln s e n g r a d lx , Ja p a n p a te n t (o Pe n ) . , 7 3一 3 1 , 1 7 .
〔‘1 R ho de s , M . J . C . , i, 5 6 , A g r ie e ll R e p o r t . , 7 (5 ) : s一
[ 5 ] Y a su d a
,
5
.
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10 7 2
,
S tu d le , o n t h e e u ltu r a l e o n d 玉tio n . o f p la n t e e ll , u s p e n s io n
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, ‘9 7 .
6 期 蒋 晶等 : 人参组织和细胞培养的研究 6 8 7
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T ISSUE AND CE LL 1
.
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.
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tim es in s o lid
一
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